KULTUR JARINGAN

Kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara

vegetatif. Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan cara

mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas, serta menumbuhkan bagian-

bagian tersebut dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur

tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat

memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi tanaman lengkap.

Contoh Tanaman Kultur Jaringan

I.    Kelompok Tumbuhan Hias

1.      Kenanga

2.      cendana

3.      ubi gondola

4.      ubi duren

5.      cempaka

6.      adenium merah

7.      krisan

8.      zaitun

9.      kembang sungsang

10.  baby pink banana

11.  waru hias thai

12.  melo badak

13.  cocor bebek

14.  sansivera G

15.  sansivera

16.  draicena

17.  plumeria

18.  kabebuya

19.   zamio curcas

20.  mandevila

21.  keladi merah

22.  jagung hitam

23.  nepenthes

24.  cucarowo

II.      Kelompok Pohon

1.      Jelutung

2.      Labu

3.      Pulai

4.      Jabon putih

5.      Merbau

6.      Eboni

7.      Gaharu Aquilaria chrasna

8.      Gaharu Aquilatia malacensis

9.      Gaharu Girinop

10.  Jati muna

11.  Jati Solomon

12.  Sengon Solomon

13.  Sengon merah

14.  Cemara balon

15.  Cendana

16.  Adensonia baubab

17.  Kabebuya

18.  Plumeria

III.   Kelompok Buah-buahan

1.      Nanas bogor

2.      Jeruk

3.      pear merah

4.      apel merah

5.      leci

6.      melon

7.      papaya

8.      jeruk bali

9.      pisang

IV.       Kelompok Tumbuhan Obat

1.      binahong

2.      saga

3.      tapak liman

4.      zodiac

5.      zaitun

6.      alfalfa

7.      buah makasar

8.      kemukus

9.      sanrego

10.  oyong

11.  jarak

12.  sirih merah

13.  ginseng

14.  pule pandak

IV.   Kelompok Hortikultura

1.      kentang

2.      pisang

3.      nanas bogor

4.      ubi duren

5.      ubi gondola

6.      singkong MS1

7.      singkong MS2

8.      pear merah

9.      apel merah

10.  oyong

11.  melon

12.  papaya

13.  ginseng

14.  jeruk bali

Persyaratan Ruangan di Labor Kultur jaringan

1. Organisasi Dalam Laboratorium Kultur Jaringan 

Di setiap laboratorium dimana teknik kultur jaringan digunakan harus mempunyai

sejumlah fasilitas yang mencakup al.:

- Ruang pencucian

- Ruang persiapan media, sterilisasi dan penyimpanan

- Ruang transfer aseptik

- Ruang kultur atau inkubator yang lingkungannya terkontrol

- Ruang pengamatan dan koleksi data Diagram laboratorium kultur jaringan dapat

dilihat pada gambar B-2.1.

a. Ruang Pencucian 

Ruang pencucian harus mempunyai bak cuci, meja kerja yang terbuat dari bahan yang

tahan terhadap asam dan basa, rak pengering dan mempunyai saluran untuk air

demineralisasi atau destilasi, ruang untuk tempat oven pengering, alat/mesin pencuci

dan pengering, serta rak atau lemari penyimpanan alat.

b. Ruang Persiapan Media 

Di dalam ruang persiapan media harus tersedia tempat untuk penyimpanan bahan-

bahan kimia, gelas kultur dan penutupnya, dan peralatan gelas yang diperlukan untuk

pembuatan media. Meja yang kokoh atau ”bench” untuk penyimpanan ”hot plate

magnetic stirrer”, pH meter, timbangan, dan dispenser harus tersedia. Peralatan lain

yang biasanya ada di ruang persiapan dan pembuatan media antara lain alat vaccum,

distiling unit, bunsen, refrigerator (kulkas) dan freezer untuk penyimpanan larutan stok

dan bahan kimia, mikrowave, kompor gas, oven dan autoclave untuk sterilisasi mdia,

peralatan gelas dan peralatan lain. Didalam pembuatan media kultur, bahan-bahan

kimia yang digunakan harus yang bertaraf analitik dan penimbangannya harus baik dan

benar. Agar lebih akurat, dalam pembuatan media harus dilakukan tahap demi tahap

dan bahan-bahan yang digunakan harus di ”checklist”. Air yang digunakan dalam

pembuatan media harus berkualitas tinggi yang mempunyai tingkat kemurnian yang

tinggi. Air ledeng atau sumur tidak digunakan untuk pembuatan media karena

mengandung kation-kation (amonium, kalsium, besi, magnesium natrium, dll.), anion-

anion (bikarbonat, klorida, flourida, fosfat, dll.), mikroorganisme (algae, jamur, bakteri),

gas-gas (oksigen, CO2, nitrogen) dan bahan-bahan lain (minyak, bahan organik dll.). Air

yang digunakan dalam kultur jaringan harus mempunyai standar type II (minimum)

yaitu bebas pirogen, gas, dan bahan organik dan mempunyai konduktivitas elektrik

kurang dari 1.0 µmho/cm. gambar Metoda yang paling umum untuk pemurnian air

standar type II adalah dengan deionosasi yang diikuti dengan satu atau dua destilasi

gelas. Deionisasi menghilangkan dari bahan yang bersifat ionik dan proses destilasi

menghilangkan molekul-molekul organik, mikroorganisme dan pirogen. Metode-

metode lain yang dapat digunakan untuk mendapatkan air murni type II adalah

(1) penyaringan dengan cara absorpsi, dengan menggunakan karbon aktif untuk

menghilangkan kontaminan organik dan bebas klorine;

(2) penyaringan dengan membran, yang menghilangkan bahan-bahan partikulat dan

kontaminasi oleh bakteri; dan

(3) reverse osmosis, yang menghilangkan sekitar 99% bakteri, bahan organik dan

bahan partikulat.

c. Ruang Transfer 

Teknik kultur jaringan dapat berlangsung dengan sukses apabila dilakukan dibawah

kondisi laboratorium yang sangat bersih. Oleh karena itu pemindahan atau transfer

biakan dikerjakan dalam ruang transfer steril atau laminar air flow. Laminar air flow

yang digunakan dalam kultur jaringan tanaman adalah tipe horizontal dan dirancang

dengan mempunyai ruangan yang bebas dari partikel debu yang halus dan dilengkapi

dengan sinar ultra violet (UV) serta unit penyaring udara. Penyaring udara harus

mempunyai filter udara dengan efisiensi tinggi atau ”high-efficiency particulate air

(HEPA filter). HEPA filter harus mempunyai pori sekitar 0.3 µm dengan efisiensi kerja

berkisar 99.97 – 99.99%. Semua permukaan ruang kerja dalam laminar harus dirancang

dan mempunyai konstruksi sedemikian rupa sehingga debu dan mikroorganisme tidak

dapat berakumulasi dan permukaan tempat kerja dapat mudah dibersihkan dan

diidisinfeksi.

d. Ruang Kultur 

Semua jenis kultur harus disimpan dalam tempat yang terkontrol baik temperatur,

sirkulasi udara, kelmbaban maupun kualitas dan lamanya cahaya. Faktor-faktor

lingkungan tersebut akan mempengaruhi proses pertumbuhan dan diferensiasi biakan

baik secara langsung maupun tidak langsung. Kultur protoplas, suspensi sel dan kultur

anther adalah yang paling sensitif terhadap kondisi lingkungan. Suhu ruang kultur

untuk pertumbuhan umumnya berkisar antara 15o – 30oC, dengan fluktuasi kurang

dari ±0.5oC; akan tetapi kisaran suhu yang lebih besar mungkin diperlukan untuk

tujuan percobaan. Ruang kultur harus mempunyai pencahayaan hingga 10.000 lux.

Suhu dan cahaya harus dapat diprogram selama 24 jam. Ventilasi udara harus baik

dengan kelembaban berkisar 20-98%.

2. Peralatan dan Bahan Dasar Dalam Laboratorium Kultur Jaringan 

Peralatan yang diperlukan dari suatu laboratorium umumnya adalah sbb.:

1. Hot plate/magnetic stirrer atau kompor

2. Peralatan gelas (gelas ukur, erlenmeyer) atau stainless steel untuk memanaskan dan

melarutkan media

3. Alat sterilisasi dengan tekanan uap (autoclave)

4. pH meter

5. Timbangan (analitical dan bench top loading)

6. Gelas ukur gradual

7. Botol kultur dengan penutupnya

8. Dispenser

9. Alat diseksi (spatula, scalpel (pinset), forcep, gunting)

10. Refrigerator

11. Distiling unit atau water deionizer

12. Oven

13. Microwave

14. Mikroskop

15. Pipet ukur

16. Shaker

17. Laminar air flow

18. Disinfectant

19. Bahan kimia yang diperlukan untuk pembuatan media (Lampiran)

20. Dll.

Peralatan gelas yang digunakan di lab kultur jaringan umumnya terbuat dari Pyrex.

Erlenmeyer dari berbagai ukuran (50, 125, 250, 500, 1000 atau 2000 ml) digunakan

untuk wadah kultur dan pembuatan media. Tabung gelas, cawan petri, botol jam atau

bekas selai juga sering digunakan sebagai botol kultur. Peralatan gelas tesebut harus

tahan panas selama proses sterilisasi dengan oven atau autoclave. Peralatan gelas lain

yang biasanya digunakan adalah gelas piala, gelas ukur, pipet dan labu ukur.

Nama Ruangan di labor Kultur Jaringan

Pembagian ruangan laboratorium kultur jaringan berdasarkan kegiatan-kegiatannya

adalah sebagai berikut :

1. Ruang persiapan/preparasi

2. Ruang transfer/tanam

3. Ruang kultur/inkubasi

4. Ruang stok/media jadi

5. Ruang timbang/bahan kimia

Ruang Persiapan

Ruang ini dipergunakan untuk mempersiapkan media kultur dan bahan tanaman yang

akan dipergunakan, sebagai tempat mencuci alat-alat laboratorium, dan tempat untuk

menyimpan alat-alat gelas. Sesuai dengan fungsinya, maka di-ruangan ini terdiri dari :

1. Hot plate dengan magnetic stirer

2. Oven

3. Pengukur pH, dapat berupa pH meter, atau kertas pH indikator

4. Autoklaf

5. Kompor gas

6. Tempat cuci

7. Labu takar, gelas piala, erlenmeyer, pengaduk gelas, spatula, petridish, pipet,

botol kultur, pisau scapel.

Ruang Transfer/Tanam

Ruang transfer merupakan ruang di mana pekerjaan aseptik dilakukan. Dalam ruangan

ini dilakukan kegiatan isolasi tanaman, sterilisasi dan penanaman eksplan dalam media.

Ruangan ini sedapat mungkin bebas dari debu dan hewan kecil, serta terpisah dan

tersekat dengan ruangan lain. Penggunaan AC sangat dianjurkan dalam ruangan ini.

Ruang transfer dilengkapi peralatan sebagai berikut :

1. Laminar air flow cabinet, bisa juga enkas

2. Alat-alat diseksi; pisau bedah/scapel, pinset, spatula, dan gunting.

3. Hand sprayer yang berisi alkohol 70 %

4. Lampu bunsen

Ruang Kultur/Inkubasi

Merupakan ruang yang paling besar dibanding dengan ruangan yang lain. Ruangan ini

harus dijaga kebersihannya dan sedapat mungkin dihindari terlalu banyak keluar

masuknya orang-orang yang tidak berkepentingan. Ruangan ini berisi rak-rak kultur

yang berfungsi untuk menampung botol-botol kultur yang berisi tanaman. Rak ini juga

dilengkapi dengan lampu-lampu sebagai sumber cahaya bagi tanaman kultur. Selain rak

kultur, ruang kultur juga harus dilengkapi dengan AC, pengukur suhu dan kelembapan,

serta timer yang digunakan untuk menghidup-kan dan mematikan lampu secara

otomatis.

Cahaya yang digunakan sebagai penerangan, sebaiknya cahaya putih yang dihasilkan

dari lampu flourescent. Lampu flourescent dipakai karena sangat baik dan sangat

efisien dalam penggunaan energi bila dibanding dengan lampu pijar. Karena pada

lampu pijar, hampir 90 % merupakan energi panas, sehingga mem-pengaruhi ruangan.

Intensitas cahaya yang baik dari lampu flourescent adalah antara 100 – 400 ftc (1000 –

4000 lux). Intensitas cahaya dapat diatur dengan menempatkan jumlah lampu dengan

kekuatan tertentu.

Lampu yang digunakan bisa berupa lampu TL dengan daya 15 watt atau 40 watt,

tergantung panjang rak yang dibuat. Jarak antar rak 30 – 35 cm. Sebaiknya travo pada

lampu TL dipasang terpisah dari box, (lebih baik kalau dipasang di luar ruang kultur),

karena dapat membakar tanaman kultur dan membuat suhu ruang menjadi panas.

Selain lampu TL, lampu SL juga dapat dipakai. Pemakaian lampu ini dapat meng-hemat

biaya listrik, juga lebih terang. Tinggi rak yang dibuat antara 50 – 60 cm. Dalam satu

bidang rak dapat memakai 2 atau 3 lampu SL daya 5 – 10 watt tergantung ukuran

panjang rak.

Panjang penyinaran/lama penyinaran yang dibutuhkan oleh tiap tanaman berbeda-

beda. Berapa lama penyinaran harus diberikan, tergantung pada jenis tanaman dan

respon yang diinginkan. Ada kultur yang membutuhkan waktu pe-nyinaran yang terus

menerus, ada yang 14 – 16 jam/hari, ada yang 10 – 12 jam/hari. Rata-rata waktu

penyinaran yang efektif adalah 12 – 16 jam/hari.

Suhu ruang kultur diatur pada suhu 25 – 28o C. Pada suhu yang terlalu dingin, kultur

kadang tidak berkembang dengan baik, begitu juga jika suhu ruang kultur terlalu panas,

maka jamur dan bakteri akan berkembang biak dengan cepat dan tanaman menjadi

layu.

Gambar penampang rak kultur bila memakai lampu SL

Gambar penampang rak kultur bila memakai lampu TL

Ruang stok/media jadi

Ruangan ini berfungsi sebagai ruang untuk menyimpan media tanam yang sudah di

autoklaf. Ruang stok sebaiknya dingin dan gelap, serta kebersihannya harus dijaga.

Media tanam akan diinkubasi pada ruang ini selama 3 hari sebelum digunakan. Hal ini

untuk mengetahui kondisi media tanam apakah steril atau ter-kontaminasi

jamur/bakteri. Apabila media terkontaminasi, sebaiknya segera dikeluar-kan dan

diautoklaf selama 1 jam pada tekanan 0.14 Mpa.

Denah lengkap ruangan laboratorium kultur jaringan

Ruang Timbang/Bahan Kimia

Ruang ini berisi stok bahan-bahan kimia, timbangan analitik, magnetik stirer dan lemari

es. Semua kegiatan penimbangan bahan kimia dan pembuatan larutan stok dilakukan di

ruangan ini.

Berikut skema laboratorium kultur jaringan yang mempunyai 5 ruang sesuai dengan

tahapan dan fungsinya masing-masing :

Sedangkan pada laboratorium sederhana, ruang tanam, ruang kultur dan ruang stok

media dapat digabung menjadi satu ruangan. Sedangkan ruang preparasi /per-siapan

dapat digabung dengan ruang bahan kimia (seperti dalam gambar di bawah). Dari 2

ruangan ini, ruang tanam + kultur harus memakai AC. Untuk daerah yang bersuhu

dingin, tanpa memakai AC tidak ada masalah.

Denah sederhana ruangan laboratorium kultur jaringan