laporan kultur jaringan

Download LAPORAN KULTUR JARINGAN

Post on 23-Jun-2015

6.460 views

Category:

Documents

7 download

Embed Size (px)

TRANSCRIPT

ACARA I PEMBUATAN LARUTAN STOCK, PEMBUATAN MEDIA TANAM, DAN STERILISASINYA

A. PENDAHULUAN1. Latar Belakang

Bioteknologi di bidang pertanian telah berkembang pesat, salah satu contohnya adalah kultur jaringan. Kultur jaringan tanaman merupakan teknik menumbuhkembangkan bagian tanaman, baik berupa sel jaringan atau organ tanaman dalam kondisi aseptis secara in vitro. Ciri teknik ini adalah kondisi kultur yang aseptis, penggunaan media kultur buatan dengan kandungan nutrisi lengkap, dan kondisi lingkungan kultur yang sesuai. Lingkungan yang sesuai dapat dipenuhi dengan menentukan media tumbuh yang sesuai dan penempatan pada kondisi yang terkendali berkaitan dengan intensitas dan periodisitas, cahaya, temperatur, dan kelembaban serta keharusan sterilisasi. Sterilisasi alat merupakan hal mutlak yang harus dilakukan dalam kultur jaringan. Ha ini untuk menciptakan kondisi aseptis perlu dilakukan proses pensterilan atau sterilisasi untuk mencegah terjadinya kontaminasi. Sterilisasi alat (petridish, pinset, gunting, dll) biasanya dilakukan dengan pemanasan secara langsung diatas api atau dibakar atau dengan pemasan menggunakan autoklaf selama 30 menit pada suhu 115C 135C. Media kultur jaringan merupakan faktor penting penentu keberhasilan perbanyakan tanaman secara kultur jaringan. Berbagai komposisi media kultur telah diformulasikan untuk mengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan tanaman yang dikulturkan. Media kultur fisiknya dapat berbentuk padat atau cair. Media berbentuk padat menggunakan pemadat media seperti agar. Media kultur yang memenuhi syarat

1

adalah yang mengandung nutrient makro dan mikro dalam kadar dan perbandingan tertentu, sumber energi (sukrosa), serta mengandung berbagai macam vitamin dan ZPT. Kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara vegetatif. Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan cara mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas, serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi tanaman lengkap. Prinsip utama dari teknik kultur jaringan adalah perbayakan tanaman dengan menggunakan bagian vegetatif tanaman menggunakan media buatan yang dilakukan di tempat steril. Larutan stock merupakan larutan bahan-bahan komponen media yang besarnya telah dikalikan menjadi beberapa konsentrasi sehingga larutan stock ini berfungsi sebagai salah satu cara untuk memudahkan penimbangan dan menghindari kesalahan penimbangan bahan-bahan yang diperlukan dalam jumlah yang relatif kecil. Bahan-bahan kimia komponen media dibutuhkan dalam jumlah yang relatif kecil, oleh karena itu bahan-bahan tersebut disediakan dalam bentuk larutan stock. Untuk itulah tahapan pembuatan larutan stock merupakan tahapan yang sangat penting dalam metode kultur jaringan agar tidak terjadi kesalahan dalam penimbangan bahan-bahan kimia yang akan digunakan. Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Media sebagai tempat pertumbuhan aksplan yang akan dikulturkan sehingga pembuatan media harus dilakukan dalam tahapan perbantakan tanaman secara kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon. Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan. Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca. Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoklaf.

2

Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril. Seperti disebutkan sebelumnya bahwa kondisi yang aseptic merupakan syarat yang mutlak dalam tahapan perbanyakan tanaman secara kultur jaringan. Oleh karena itu tahapan sterilisasi harus dilaksanakan dalam praktikum kali ini. Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang disemprotkan secara merata pada peralatan yang digunakan. Teknisi yang melakukan kultur jaringan juga harus steril.

2. Tujuan Tujuan praktikum acara yang pertama ini adalah : 1. Mengetahui prosedur pembuatan larutan stock. 2. Mengetahui langkah-langkah dalam pembuatan media kultur jaringan. 3. Mengetahui prosedur sterilisasi alat dan media kultur.

3. Waktu dan Tempat Praktikum Praktikum acara pertama ini berjudul pembuatan larutan stock, media tanam, dan sterilisasi dilaksanakan pada : Waktu praktikum Tempat : Senin, 13 Oktober 2008 : Laboratorium Fisiologi dan Bioteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret Surakarta.

B. TINJAUAN PUSTAKA3

1. Pembuatan Larutan Stock Bahan-bahan kimia komponen media dibutuhkan dalam jumlah yang relatif kecil, oleh karena itu bahan-bahan tersebut disediakan dalam bentuk larutan yang disebut sebagai larutan stock. Larutan stock merupakan larutan bahan-bahan komponen media yang besarnya telah dikalikan menjadi beberapa konsentrasi. Sehingga larutan stock ini berfungsi untuk memudahkan penimbangan dan menghindari kesalahan penimbangan bahan-bahan yang diperlukan dalam jumlah yang relatif kecil. (Yuniastuti, Endang. 2008: 4) Seperti diungkapkan oleh Lydiane Kyte dan John Klein dalam Plant for Test Tubes Stock solutions are concentrated solutions of groups of media chemicals that are preparated ahead of time and used to make several batches of media. They may be made in liter quantities of 10 to 100 times the concentration required in the final formula. Having stock solutions eliminates the need to weigh so many different chemicals every time you want to make a batch of medium. Also, the quantities will be more accurate because they are on larger scale than would be required for a single batch of medium, and thus minor inaccuracies have less impact. Larutan stock merupakan sekelompok larutan media kimia berkonsentrasi yang disiapkan di awal dan digunakan untuk membuat beberapa kumpulan media. Larutan stock dibuat dalam satuan jumlah liter pada 10 sampai 100 kali konsentrasi yang dibutuhkan pada formula akhir. Pembuatan larutan stock mengurangi resiko perbedaan berat kimiawi yang besar setiap kali kita ingin membuat kumpulan media. Juga, jumlah akan lebih akurat sebab larutan stock dibuat dalam skala yang lebih besar daripada jika kita membuat medium tunggal, dan berkurangnya ketidakakuratan ini akan mengurangi dampak yang buruk bagi kultur jaringan. ( Lydiane Kyte & John Kleyn. 1996: 76) Beberapa komposisi akan mengendap (membentuk komponen padat) jika dicampurkan bersama dalam bentuk konsentrasi yang sama, jadi tiap kelompok kimiawi dibuat dalam bentuk kimia yang biasanya tidak mengendap pada konsentrasi larutan stock. Sebelum menambahkan bahan kimia apapun pada pembuatan larutan stock, harus ada air dalam labu, sehingga pengendapan sulit untuk terjadi.4

Tidak ada kesepakatan umum mengenai kombinasi komposisi larutan stock, juga tentang bagaimana larutan stock dibuat dan berapa lama larutan tersebut dapat disimpan sebagai larutan stock. Sebagian besar larutan stock dapat disimpan untuk watu yang terbatas tanpa reaksi yang berlawanan atau berkebalikan. Apabila larutan stock tersebut memiliki daur hidup yang pendek, seperti pada material organic, kemudian komposisi kimianya akan stabil dalam waktu yang lama apabila larutan stock tersebut disimpan dalam refrigerator, hormone cenderung memiliki waktu hidup yang pendek yang menyebabkannya harus dibuat dalam jumlah yang kecil sekitar 25 mg dalam 250 ml air. Apabila komposisi larutan stock memiliki daur hidup yang lebih panjang, seperti pada garam anorganik, larutan-larutan tersebut dapat disimpan pada cup atau wadah-wadah kecil, namun larutan-larutan tersebut beresiko tinggi untuk tumbuhnya kontaminan karena temperatur yang lebih tinggi. Dengan kata lain, jika larutan garam mendekati proses pengendapan, larutan-larutan tersebut akan mengendap pada suhu dingin di refrigerator sebab kelarutan suatu larutan akan menurun dengan menurunnya temperature. Apabila larutan membentuk endapan, larutan-larutan tersebut dapat dibawa pada suhu ruang, atau sedikit dipanaskan, kemudian digunakan, untuk menghilangkan endapan. Bila larutan stock tidak mudah untuk mengendap, memanaskan larutan tersebut pada hot plate atau stirer akan menjadi solusi permasalahan ini. (Bernice M. Martin. 1994: 39). Pembuatan media pada prinsipnya dilakukan dengan melarutkan semua komponen media dalam air sesuai dengan konsentrasinya pada formulasi yang diinginkan. Namun, penimbangan satu persatu komponen media untuk setiap pembuatan media kultur adalah tidak praktis dan hanya dapat dilakukan jika jumlah zatnya cukup besar. Masalah tersebut dapat diatasi dengan pembuatan larutan stok. Larutan stok adalah larutan berisi satu atau lebih komponen media yang konsentrasinya lebih besar dari konsentrasi komponen tersebut dalam formulasi media akan dibuat (Hemawan dan Naem, 2006). Penggunaan larutan stok mengurangi pekerjaan yang rumit dalam persiapan media, sehingga risiko human error dalam percobaan dapat dikurangi. Lebih dari itu, penimbangan langsung komponen media, misalnya mikronutrien dan hormon yang

5

dibutuhkan hanya dalam ukuran milligram atau microgram dalam formulasi akhir tidak dapat dilakukan dengan cukup akurat untuk pekerjaan kultur jaringan (Rahardja, 1995).

2. Pembuatan Media Media kultur merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan perbanyakan tanaman secara kultur jaringan. Berbagai komposisi media kultur telah diformulasikan untuk mengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan tanaman yang dikulturkan. Contohnya komposisi Knudson C (1946),