Slide 1

DIAGNOSTIC METHODS IN VIROLOGY

Elisabeth D. HarahapDept. MikrobiologiFK UKRIDA1METODE DIAGNOSTIK INFEKSI VIRUSUji diagnostik infeksi virus terdiri atas:Deteksi langsungDeteksi tidak langsung (isolasi virus)Serologi

Deteksi langsung:Untuk melihat adanya partikel virus, antigen virusatau asam nukleat virus.

Deteksi tidak langsung:Spesimen dikultur dalam biakan sel, telur atau hewan percobaan untuk membiakkan virus (isolasi virus).

2Uji serologi:Diagnosa serologi dapat dilakukan dengan mendeteksi kenaikan titer antibodi antara infeksi masa akut dankonvalesen ( 4 kali) atau deteksi antibodi IgM.

3Pemeriksaan langsung spesimen

a. Menggunakan mikroskop elektronb. Menggunakan mikroskop cahaya badan inklusi.c. Deteksi antigen Imunofluoresen, ELISAd. Teknik molekuler deteksi langsung genom virus41.1 Deteksi antigen dari spesimen langsung dengan uji imunofluoresens.Mis.- Aspirasi nasofaring untuk virus RSV, INFLUENZAE- Deteksi HSV dan VZV dari kerokan kulit

51.2. Teknik molekuler Deteksi asam nukleatPolymerase Chain Reaction (PCR)

6

8

Hasil PCR HSV yang berasal dari 2 sampel corneal scrapings9Pemeriksaan tidak langsung spesimenBiakan sel melihat CPE : Piknosis Karyoreksis Plasmolisis Ballooning Sinsitium Vakuolisasi Giant multinucleated celBadan inklusi

Biakan pada telur berembrio pocksBiakan pada hewan percobaan timbulnya penyakit atau kematian

2. INDIRECT EXAMINATION Biakan pada sel

Types of cell cultures:Primary cells Sel yang diperoleh dari jaringan yang segar.Sel ini hanya dapat dipasasse satu atau dua kali.2. Semi-continous cells Human embryonic kidney, skin fibroblasts. Sel ini berasal dari embrio dan dapat dipasase sampai 50 kali.Continous cells HeLa, Vero.Sel ini immortal berasal dari sel tumor dan dapatdipasase berkali-kali. 12

Monolayer sel normal HeLa13

CPE Measles-syncytia cellCytopathatic Effect pada sel14

CPE VZV (Varicella Zooster Virus)

Biakan sel dengan IFA163. Uji Serologi

Deteksi kenaikan titer antibodi antaramasa akut dengan konvalesen, atau deteksi IgM pada infeksi primer.

Ada beberapa cara:a. Complement fixation tests (CFT)b. Haemagglutination inhibition test (HI)c. Immunofluorescence technique (IF)d. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)e. Western Blot (WB)173. UJI SEROLOGI

1.1.Masa akutMasa konvales1/201/401/801/16018

1.2.ELISA

19DIAGNOSIS INFEKSI VIRUS SIMPLEXDeteksi langsung (Mikroskopik): NSP (Nasopharyngeal Secretions)

CPE HSV- multinucleated cell20Deteksi langsung dengan Uji PCR HSV: Sampel dari corneal scraping

Hasil PCR HSV dari 2 sampel corneal scrapings21Deteksi tidak langsung:Identifikasi pertumbuhan virus pada biakan sel fibroblast dengan melihat adanya Cytopathic Effect (CPE).

Fibroblast (spindle-shaped cells) become rounded when infected with HSV.22

CPE HSV Giant cell multinucleated 23

UJI IMMUNOFLUORESENSI HSV1 & HSV 2Biakan sel yang diinfeksi dengan virus HSV, kemudian dilakukan uji immunofluoresensi,masing-masing dengan antibodi HSV1 dan antibodi HSV2. Sel yang terinfeksi virusterlihat berfluoresensi.HSV1HSV224

UJI SEROLOGI DETEKSI IgM anti HSV25

DIAGNOSIS MEASLES VIRUSBiakan sel yang telah diinokulasi dengan virus measles, diwarnai dengan teknik immunofluoresen terlihat sel giant multinukleus (syncytia cell) berfluoresensi hijau26

DIAGNOSIS VIRUS VARICELLA Biakan sel yang telah diinokulasi dengan virus Varicella, kemudian diwarnai terlihat sel giant multinukleus dan adanya badan inklusi intranukleus.27

CPE VZV (Varicella Zooster Virus) Biakan sel yang telah diinokulasi dengan virus Varicella, kemudian diwarnai terlihat sel giant multinukleus dan adanya badan inklusi intranukleus.28DIAGNOSIS RSV(Respiratory Syncytial Virus)

29

DIAGNOSIS RSVDeteksi antigen RSV langsung dari sekresi nasofaringdengan uji immunofluoresen30RAPID TEST UNTUK DETEKSI RSV(IMUNOKROMATOGRAFI)Sampel : aspirasi /swab nasofaring, hidung

Inkubasi 15 menit31

S1S2

S3

Hasil :Sampel 1 = NEGATIFSampel 2 = POSITIFSampel 3 = NEGATIF32DETEKSI INFEKSI HIVDapat dilakukan dengan dua metode, yaitu:

1. Langsung: biakan virus dari darah, isolasi virus dari sample, umumnya menggunakan mikroskop elektron dan deteksi gen virus. Yang paling sering digunakan adalah PCR (Polymerase Chain Reaction).

2. Tidak Langsung: dengan melihat respons zat anti yang spesifik, misalnya dengan tes ELISA, Western Blot, Immunofluoren Assay (IFA)33Pemeriksaan ElisaProsedur :Antigen HIV direkatkan pada sumur microplateInkubasi serum atau plasma yang akan diperiksa dengan antigen tersebut selama 30 menit sampai 2 jam, lalu cuciBila positif IgG (Immunoglobulin G) yg menempel pada biji2 / sumur microplate, maka akan terjadi reaksi pengikatan antigen-antibodi ; antibodi anti-IgG sudah diberi label dengan enzim alkali fosfatase, horseradish peroxidaseAkan berwarna bila ditambah dengan suatu substrat

34Kendala pada test ELISA yg perlu diperhatikan :Pemeriksaan ELISA hanya mendeteksi antibodi, bukan antigen (akhir-akhir ini sudah ditemukan test ELISA untuk antigen p24). Oleh karena itu test uji baru akan positif bila penderita telah mengalami serokonversi yang lamanya 2-3 bulan sejak terinfeksi HIV, bahkan ada yang 5 bulan atau lebih (pada keadaan immunocompromised)..

Pemeriksaan ELISA hanya terhadap antigen jenis IgG. Penderita AIDS pada taraf permulaan hanya mengandung IgM, sehingga tidak akan terdeteksi. Perubahan dari IgM ke IgG membutuhkan waktu sampai 41 minggu. 35Pemeriksaan Western BlotProsedur :HIV murni letakan pada poliakrilamid gel yg diberi arus elektroforesis sehingga terurai menurut berat protein yang berbeda-beda

Pindahkan ke Nitrocellulosa dan inkubasi dg serum penderita

Ikatan antara Antigen-Antibodi HIV dideteksi dengan memberikan antibodi anti-human yg sudah dikonjugasi dengan enzim yang memberikan warna bila diberi suatu substrat

Test ini dilakukan bersama dengan suatu kontrol positif dan negatif

36

37

Western Blot38

39Gambaran band dari bermacam-macam protein envelope dan core dapat mengidentifikasi macam antigen HIV. Antibodi terhadap protein core HIV (gag) misalnya p24 dan protein precursor (p25) timbul pada stadium awal kemudian menurun.

Antibodi terhadap envelope (env) penghasil gen (gp160) dan precursor-nya (gp120) dan protein transmembran (gp4l) selalu ditemukan pada penderita AIDS pada stadium apa saja40Beberapa protein lainnya yang sering ditemukan adalah: p3 I, p51, p66, p14, p27, lebih jarang ditemukan p23, p15, p9, p7. Secara singkat dapat dikatakan bahwa bila serum mengandung antibodi HIV yang lengkap maka Western blot akan memberi gambaran profil berbagai macam band protein dari HIV antigen cetakannya41Definisi hasil pemeriksaan Western Blot menurut profit dari band protein dapat bermacam-macam, pada umumnya adalah : Positif : Ditemukan adanya antibodi terhadap Envelope : gp4l, gpl20, gp160 Salah satu dari band : p15, p17, p24, p31, gp4l, p51, p55, p66.

2) Negatif : Bila tidak ditemukan band protein. 42

Ket.Kontrol positifKontrol negatifNegatifIndeterminatePositifHasil uji Western-Blot433) Indeterminate Bila ditemukan band protein yang tidak sesuai dengan profil positif. Hasil indeterminate .diberikan setelah ditest secara duplo dan penderita diberitahu untuk diulang setelah 2-3 bulan. Hal ini mungkin karena infeksi masih terlalu dini sehingga yang ditemukan hanya antibodi terhadap sebagian dari core antigen (p17, p24, p55). 44

Uji Rapid Test HIV45Terima kasih