Kromatografi – Mekanisme Pemisahan

in Metoda Pemisahan / by S Hamdani /

Metoda pemisahan untuk senyawa murni atau campuran senyawa dari campuran berdasarkan pada perbedaan migrasi senyawa yang dipengaruhi fase diam dan fase gerak

Kromatografi berasal dari kata chroma yang artinya warna dan graph yang artinya pembacaan, jadi keseluruhan jadinya ‘pembacaan warna’. Dikatakan demikian karena pada awalnya metoda ini dipakai untuk memisahkan senyawa-senyawa berwarna dari ekstak daun dengan menggunakan serbuk kapur yang dimampatkan pada sebuah kolom (kromatografi kolom), dan tentunya hasil dari pemisahan ini

menghasilkan pita-pita warna pada kolom dengan demikian dinamailah “pembacaan warna / chromatography”

Pemisahan terjadi karena adanya perbedaan polaritas antara fase gerak (cairan), fase diam (kapur) dan senyawa-senyawa yang terpisahkan.

fase diam (pada kolom) adalah senyawa non polar, sedangkan fase gerak adalah senyawa polar, kita anggap demikian untuk memudahkan mengingat. Bila kemudian ada senyawa bersifat polar, maka senyawa ini jelas akan lebih suka terikat pada fase diam dan tidak akan tertahan oleh fase gerak, maka akan keluar dengan mudah.

Akan berbeda bila senyawa bersifat non polar, maka dia akan lebih suka terikat pada fase diam sehingga akan sulit untuk keluar, tapi karena fase gerak mengalir terus menerus maka lama kelamaan senyawa ini akan keluar juga.

Perbedaan migrasi/perpindahan inilah yang menyebabkan senyawa-senyawa yang terkandung dalam campuran akan terpisah, dan nantinya akan terlihat seperti cincin bila dalam kolom atau noda pada plat (kromatografi lapis tipis).

Hal yang harus diperhatikan dan mungkin bisa dikatakan salah satu kesulitan pada kromatografi adalah pemilihan fase gerak, dimana harus disesuaikan dengan tingkat kepolaran senyawa-senyawa yang akan dipisahakan, tapi bukan berarti harus sama kepolarannya. Maksudnya fase gerak ini harus bisa membawa senyawa-senyawa tapi secara terpisah-pisah, tidak membawa 2 atau lebih senyawa secara bersamaan, kalau begitu bukan pemisahan namanya. Penentuan fase gerak ini berdasar pada “trial and error” jadi di coba-coba, ini yang lama….. coba-coba ini meliputi jenis pelarut, campuran pelarut, atau konsentrasi campuran pelarut.

Kenapa fase gerak di nomor duakan? Pada dasarnya sama fase gerak juga harus dipilih hanya saja karena macem-macem fase gerak tidak banyak dan tidak dibuat variasi konsentrasi jadi relatif tidak terlalu jadi masalah, bahkan untuk sebagian besar metoda kromatografi fase diam sudah jadi tinggal beli.

Kromatografi pada perkembangannya tidak hanya pemisahan untuk senyawa yang berwarna (dilihat mata) tapi untuk yang kasat mata juga, dan karena metoda ini mampu memisahkan sampai senyawa murni karenanya berkembang dengan sangat hebat dan saat ini menjadi metoda andalan. Dengan bantuan instrumen muncullah kromatografi gas, kromatografi cair kinerja tinggi, kromatografi superkritis, dll.

Kromatografi Kolom

Ditulis oleh Redaksi chem-is-try.org pada 06-10-2007

Bagian ini menunjukkan bagaimana prinsip yang sama yang digunakan dalam kromatografi lapis tipis yang dapat diterapkan pada skala besar untuk pemisahan campuran dalam kromatografi kolom. Kolom kromatografi seringkali digunakan untuk memurnikan senyawa di laboratorium.

Pelaksanaan kromatografi kolom

Kolom

Dalam kromatografi lapis tipis, fase diam adalah lapisan tipis jel silika atau alumina pada sebuah lempengan gelas, logam atau plastik. Kolom kromatografi berkerja berdasarkan skala yang lebih besar menggunakan material terpadatkan pada sebuah kolom gelas vertikal.

Berbagai ukuran kolom kromatografi digunakan dan jika anda membuka link pada halaman Kimia Organik dari situs Universitas Colorado, anda akan menemukan foto dari bermacam-macam kolom. Dalam laboratorium sekolah, seringkali dengan mudah digunakan buret biasa sebagai kromatografi kolom.

Penggunaan kolom

Anggaplah anda akan memisahkan campuran dari dua senyawa yang berwarna, yaitu kuning dan biru. Warna campuran yang tampak adalah hijau.

Anda akan membuat larutan jenuh dari campuran dengan menggunakan pelarut yang lebih disukai dalam kolom.

Pertama anda membuka kran penutup untuk membiarkan pelarut yang sudah berada dalam kolom mengering sehingga material terpadatkan rata pada bagian atas, dan kemudian tambahkan larutan secara hati-hati dari bagian atas kolom. Lalu buka kran kembali sehingga campuran berwarna akan diserap pada bagian atas material terpadatkan, sehingga akan tampak seperti gambar dibawah ini:

Selanjutnya tambahkan pelarut baru melalui bagian atas kolom, cegah sedapat mungkin jangan sampai merusak material terpadatkan dalam kolom. Lalu buka kran, supaya pelarut dapat mengalir melalui kolom, kumpulkan dalam satu gelas kimia atau labu dibawah kolom. Karena pelarut mengalir kontinyu, anda tetap tambahkan pelarut baru dari bagian atas kolom sehingga kolom tidak pernah kering.

Gambar berikut menunjukkan perubahan yang mungkin terjadi sejalan dengan perubahan waktu.

Penjelasan tentang apa yang terjadi

Ini mengasumsikan bahwa anda telah membaca penjelasan tentang apa yang terjadi pada kromatografi lapis tipis. Jika belum, ikuti link awal pada bagian atas halaman dan kembali pada bagian ini dan selanjutnya.

Senyawa biru lebih polar daripada senyawa kuning dan memungkinkan mempunyai kemampuan berikatan dengan hidrogen. Anda dapat mengatakan ini karena senyawa biru tidak bergerak secara sangat cepat melalui kolom. Itu berarti bahwa senyawa biru harus dijerap secara kuat pada jel silika atau alumina dibanding dengan senyawa kuning. Karena kurang polar, senyawa kuning menghabiskan waktu dalam pelarut, sehingga keluar dari kolom lebih cepat.

Proses pencucian senyawa melalui kolom menggunakan pelarut dikenal sebagai elusi. Pelarut disebut sebagai eluen.

Apakah anda hanya ingin mengumpulkan senyawa biru saja?

Sudah waktunya untuk mencuci senyawa biru melalui kecepatan bergeraknya pada waktunya! Namun, tidak ada alasan mengapa anda tidak dapat mengganti pelarut selama elusi.

Anggaplah anda menggantikan pelarut yang anda telah digunakan selama ini dengan pelarut yang lebih polar, setelah seluruh senyawa kuning selesai terkumpulkan. Ini akan mempunyai dua pengaruh, keduanya akan mempercepat senyawa biru melalui kolom.

Pelarut polar akan bersaing untuk mendapatkan ruang pada jel silika atau alumina dengan senyawa biru. Beberapa ruang untuk sementara dipergunakan oleh molekul-molekul pelarut pada permukaan fase diam, tidak menyediakan molekul-molekul biru untuk melekat dan ini akan cenderung menjaga pergerakannya dalam pelarut.

Akan ada atraksi yang lebih besar antara molekul-molekul pelarut polar dan molekul biru yang polar. Kecenderungan ini akan menarik molekul-molekul biru menempel pada fase diam kembali pada larutan.

Pengaruh total yaitu dengan bertambahnya kepolaran pelarut, senyawa biru akan menghabiskan waktu dalam larutan dan karenanya akan bergerak lebih cepat.

Lalu mengapa tidak menggunakan alternatif ini dalam tempat pertama? Jawabannya adalah jika senyawa-senyawa dalam campuran bergerak secara sangat cepat melalui kolom dari awal, anda mungkin tidak akan mendapatkan pemisahan yang baik

Bagaimana jika campuran yang anda miliki tidak berwarna?

Jika anda akan menggunakan kromatografi kolom untuk memurnikan produk organik, mungkin produk yang anda harapkan akan menjadi produk yang tidak berwarna, meskipun satu atau lebih dari pengotor berwarna. Mari kita berasumsi kasus terburuk yaitu segala sesuatunya tidak berwarna.

Bagaimana anda bisa mengetahui bahwa substansi yang anda diinginkan telah mencapai bagian bawah kolom?

Ini bukan merupakan pekerjaan yang cepat dan mudah! Apa yang akan anda kumpulkan dan apa yang keluar dari bawah kolom dalam seluruh rangkaian pipa yang berlabel. Bagaimana besar setiap sampel akan jelas tergantung pada bagaimana besar kolom yaitu-anda mungkin mengumpulkan 1 cm3 atau 5 cm3 sampel atau apapun itu besarnya yang sesuai.

Anda kemudian akan mengambil setetes dari setiap larutan dan membuatnya ke dalam kromatografi lapis tipis. Anda menempatkan tetesan pada garis dasar bersama dengan setetes senyawa murni dari senyawa yang sementara anda buat. Dengan mengulangi pekerjaan ini, anda dapat mengidentifikasi sampel yang mana yang dikumpulkan pada bawah kolom yang mengandung produk yang diinginkan dan hanya dibutuhkan.

Sekali anda mengetahui prosedur ini, anda dapat menggabungkan seluruh sampel yang yang mengandung produk senyawa murni dan menghilangkan pelarutnya. (Bagaimana anda memisahkan pelarut dari produk, tidak langsung relevan dengan topik ini dan akan bervariasi dan tergantung pada sifat dasar senyawanya. Saya tidak akan menyamaratakannya.)

Kromatografi, Kolom dan Lapis Tipis

By Asyhar

Pada isolasi kurkumin dari kunyit dapat dilakukan kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis terhadap kurkumin. Hal yang pertama dilakukan adalah melarutkan 20 gram rimpang kunyit kering dengan diklorometana kemudian direfluks selama 1 jam. Hal ini dimaksudkan agar senyawa-senyawa kurkumin dalam kunyit tersebut benar-benar larut dalam pelarutnya. Kemudian antara filtrat dan residunya dipisahkan dengan penyaringan vakum. Filtrat (ekstrak kurkumin) ini mengandung senyawa-senyawa kurkumin. Diklorometana digunakan untuk melarutkan karena hal – hal berikut:

Kelarutan yang tinggi

Cepat menguap

Selektif

Toksisitas rendah

Tidak mudah terbakar

Murah mudah didapat

Setelah didapat filtrat (ekstrak kurkumin), kromatografi dapat dilakukan terhadap ekstrak kurkumin tersebut. Kromatografi adalah cara pemisahan dua atau lebih senyawa atau ion berdasarkan perbedaan migrasi dan distribusi senyawa atau ion-ion tersebut di dalam dua fasa yang berbeda. Dua fasa tersebut adalah

a. Fasa Diam

Merupakan fasa yang tidak bergerak. Umumnya senyawa yang digunakan adalah silica gel (SiO2) dan alumina (Al2O3).

b. Fasa Gerak

Merupakan fasa yang bergerak melalui fasa diam dan membawa komponen-komponen yang akan dipisahkan. Fasa gerak yang digunakan adalah suatu pelarut organik atau campuran beberapa pelarut organik.

Macam-macam kromatografi,

a. Kromatografi Lapis Tipis

Yaitu kromatografi yang menggunakan lempeng gelas atau alumunium yang dilapisi dengan lapisan tipis alumina, silika gel, atau bahan serbuk lainnya. Kromatografi lapis tipis pada umumnya dijadikan metode pilihan pertama pada pemisahan dengan kromatografi.

b. Kromatografi Penukar Ion

Merupakan bidang khusus kromatografi cairan-cairan. Seperti namanya, system ini khusus digunakan untuk spesies ion. Penemuan resin sintetik dengan sifat penukar ion sebelum perang Dunia II telah dapat mengatasi pemisahan rumit dari logam tanah jarangdan asam amino.

c. Kromatografi Penyaringan Gel

Merupakan proses pemisahan dengan gel yang terdiri dari modifikasi dekstran-molekul polisakarida linier yang mempunyai ikatan silang. Bahan ini dapat menyerap air dan membentuk susunan seperti saringan yang dapat memisahkan molekul-molekul berdasarkan ukurannya. Molekul dengan berat antara 100 sampai beberapa juta dapat dipekatkan dan dipisahkan. Kromatografi permeasi gel merupakan teknik serupa yang menggunakan polistirena yang berguna untuk pemisahan polimer.

d. Elektroforesis

Merupakan kromatografi yang diberi medan listrik disisinya dan tegak lurus aliran fasa gerak. Senyawa bermuatan positif akan menuju ke katode dan anion menuju ke anoda. Sedangkan kecepatan gerak tergantung pada besarnya muatan.

e. Kromatografi Kertas

Merupakan kromatografi cairan-cairan dimana sebagai fasa diam adalah lapisan tipis air yang diserap dari lembab udara oleh kertas jenis fasa cair lainnya dapat digunakan. Prinsip dasar kromatografi kertas adalah partisi multiplikatif suatu senyawa antara dua cairan yang saling tidak bercampur. Jadi partisi sutu senyawa terjadi antara kompleks selulosa-air dan fasa mobil yang melewatinya berupa pelarut organik yang sudah dijenuhkan dengan air atau campuran pelarut.

Keakuratan hasil pemisahan dengan metode kromatografi bergantung pada beberapa faktor berikut:

Pemilihan adsorben sebagai fasa diam

Kepolaran pelarut atau pemilihan pelarut yang sesuai sebagai fasa gerak

Ukuran kolom (panjang dan diameter) relatif terhadap jumlahmaterial yang akan dipisahkan

Laju elusi atau aliran fasa gerak

Semua jenis kromatografi melibatkan proses kesetimbangan molekul-molekul yang dinamis dan cepat diantara dua fasa. Kesetimbangan tersebut bergantung pada:

Kepolaran dan ukuran molekul yang akan dipisahkan

Kepolaran fasa diam

Kepolaran fasa gerak

Kromatografi kolom bertujuan untuk mengisolasi komponen kurkumin dari campurannya. Pada kromatogarfi kolom digunakan kolom dengan adsorben sillika gel karena kolom yang dibentuk dengan silika gel memiliki tekstur dan struktur yang lebih kompak dan teratur. Silika gel memadat dalam bentuk tetrahedral raksasa, sehingga ikatannya kuat dan rapat. Dengan demikian, adsorben silika gel mampu menghasilkan proses pemisahan yang lebih optimal.

Silica gel ada 2 macam:

GF245, dengan G melambangkan gypsum (CaSO4), F melambangkan floroscene, dan angka 245 menunjukkan besarnya panjang gelombang yaitu, 245 nm. Silika jenis ini sering digunakan pada kromatografi lapis tipis (TLC).

H, dengan tanpa adanya gypsum dan floroscene. Silika jenis ini biasa digunakan pada kromatografi kolom.

Silica gel dapat membentuk ikatan hidrogen di permukaannya, karena pada permukaannya terikat gugus hidroksil. Oleh karenanya, silica gel sifatnya sangat polar. Sementara itu, fasa gerak yang digunakan (dalam percobaan ini, CH2Cl2 : CH3OH = 99 : 1) sifatnya non-polar. Maka pada saat campuran dimasukkan, senyawa-senyawa yang semakin polar akan semakin lama tertahan di fasa stasioner, dan senyawa-senyawa yang semakin tidak (kurang) polar akan terbawa keluar kolom lebih cepat.

Kromatografi kolom dilihat dari jenis fasa diam dan fasa geraknya dapat dibedakan :

a. Kromatografi fase normal

Kromatografi dengan kolom konvensional dimana fase diamnya “normal” bersifat polar, misalnya silica gel, sedangkan fase geraknya bersifat non polar.

b. Kromatografi fas terbalik

Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat non polar, sedangkan fase geraknya bersifat polar; kebalikan dari fase normal.

Dalam proses pemisahan dengan kromatografi kolom, adsorben silika gel harus senantiasa basah karena, jika dibiarkan kering, kolom yang terbentuk dari silika gel bisa retak, sehingga proses pemisahan zat tidak berjalan optimal. Selain itu, kondisi yang senantiasa basah berperan untuk memudahkan proses elusi (larutan melewati kolom) dalam kolom.

Senyawa kurkumin dapat mengalami penurunan dengan lepasnya gugus –OCH3 dalam setiap penurunan. Kurkumin akan mengalami dua kali penurunan, dimana turunan pertamanya adalah demetoksi kurkumin dan turunan keduanya adalah bis-demetoksi kurkumin. Kurkumin akan terelusi paling akhir (berada paling bawah) karena sifatnya yang polar. Perlu diingat bahwa penurunan ini tak mungkin terjadi dengan hanya dengan melakukan kromatografi, tp ada perlakuan khususnya. Ketika senyawa kurkumin telah mengalami degradasi, akan menjadi senyawa demetoksi kurkumin (terdapat pada bagian tengah) yang lebih polar dari kurkumin. Karena telah kehilangan sebuah gugus –OCH3. Senyawa ini merupakan turunan kedua dari senyawa kurkumin. Karena tidak lagi mengandung gugus –OCH3, maka senyawa ini merupakan senyawa yang bersifat paling polar dari antara ketiga jenis senyawa kurkumin. Dengan begitu, senyawa ini akan terelusi terlebih dahulu (berada pada lapisan yang paling atas) karena fasa diam yang digunakan (silica gel) bersifat polar.

Apabila kita menggunakan kromatografi lapis tipis, dapat diperoleh dengan adanya 3 titik – titik pada pelat TLC. Hal ini menunjukkan adanya 3 komponen utama yang terkandung dalam senyawa kurkumin yang di-refluksi. Adapun 3 komponen utama tersebut adalah senyawa-senyawa kurkuminoid yaitu kurkumin (diferuloylmethane), demetoksikurkumin (hydroxycinnamoyl feruloylmethane) & bis-demetoksikurkumin (dihydroxydicinnamoyl methane).

Setelah daerah dari noda yang terpisah telah dideteksi, maka perlu mengidentifikasi tiap individu dari senyawa. Metoda identifikasi yang paling mudah adalah berdasarkan pada kedudukan dari noda relatif terhadap permukaan pelarut, menggunakan harga Rf. Harga Rf merupakan parameter karakteristik kromatografi lapis tipis. Harga ini merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu senyawa pada kromatogram dan pada kondisi konstan merupakan besaran karakteristik dan reprodusibel.