kesehatan
DESCRIPTION
mjgcksjgfngfjhgjTRANSCRIPT
BAB IV
METODOLOGI PENELITIAN
4.1. Desain Penelitian
Penelitian dilaksanakan dengan metode Eksperimental laboratorium,
menggunakan desain true eksperimental dengan kontrol (post test only Control
Group Design). Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui manfaat dari
pemberian ekstrak Cinnamomum burmanni terhadap profil lipid pada hewan coba
tikus putih (rattus norvegicus) jantan hiperglikemia yang telah diinduksi aloksan.
Penelitian dilakukan secara in vivo pada hewan coba tikus strain winstar
jantan. Untuk membuat model tikus diabetes, tikus di injeksi dengan bahan kimia
diabetogen, yakni aloksan. Kemudian hewan coba kelompok eksperimen diterapi
dengan suplementasi ekstrak kayu manis (Cinnamomum burmanni) per oral
selama 14 hari (akut). Pada akhir penelitian dilakukan pengukuran kadar TG dan
LDL pada kelompok kontrol dan eksperimen (post test).
4.2. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini akan dilakukan di Laboratorium Biokimia Universitas Islam
Malang, Laboratorium Biomolekuler Universitas Brawijaya, dan Laboratorium
Faal Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya pada bulan Desember 2010
hingga Februari 2011.
4.3. Metode Pengambilan Sampel
Metode pengambilan sampel yang digunakan adalah teknik Probability
Sampling berupa Simple Random Sampling. Cara menentukan estimasi jumlah
sampel yang dibutuhkan dihitung berdasarkan Federe (1963) dalam Sastrosupadi
20
21
(1977) yang menyatakan bahwa hubungan antara perlakuan dan banyaknya
ulangan adalah sebagai berikut :
(t-1) (n-1) = 15
t = banyaknya perlakuan
n = banyaknya ulangan
Jika jumlah perlakuan dalam penelitian ini = 5, maka jumlah ulangan adalah
4n = 19, sehingga n = 4,75 5. Dengan demikian jumlah sampel yang digunakan
dalam penelitian ini minimal 25 ekor tikus. Mempertimbangkan terjadinya
eksklusi yang dilakukan setelah hewan coba di induksi aloksan, maka jumlah
tikus yang digunakan sebanyak 40 ekor. Sehingga jumlah sampel yang
dibutuhkan dapat terpenuhi.
4.4. Alat dan Bahan Penelitian
4.4.1. Hewan coba
Penelitian ini menggunakan hewan coba tikus putih (Rattus norvegicus) jantan
strain wistar sebanyak 40 ekor yang diperoleh dari Laboratorium Biomolekuler
Universitas Brawijaya. Umur hewan coba berkisar 2,5 – 3 bulan dengan berat
badan 180 – 250. Tikus albino sering digunakan sebagai binatang coba pada
berbagai penelitian karena mempunyai sensitifitas terhadap obat yang sangat
tinggi dan tahan terhadap kondisi laboratorium (Farris & Griffith, 1971).
Berdasarkan hal-hal tersebut diatas, maka pada penelitian ini digunakan tikus
Strain wistar sebagai binatang coba.
22
4.4.2. Alat dan bahan untuk pemeliharaan hewan coba
1. Kandang tikus
2. Penutup kandang
3. Botol air
4. Timbangan BB tikus
5. Pakan tikus standar
6. Aquades untuk minum
4.4.3. Alat dan Bahan Induksi Aloksan
1. Timbangan digital
2. Beker glass
3. Pipet
4. Tabung ukur
5. Spuit 1 cc
6. Jarum suntik
7. Batang pengaduk
8. Aloksan Monohidrat (A7413-10G) (Sigma Aldrich)
9. Normal Saline 0,9 %
10. Glukosa 10 %
11. Glukosa 5 %
4.4.4. Alat dan Bahan Untuk Ekstraksi
1. Kertas filter
2. Timbangan digital
3. Beker glass
4. Pipet volume
5. Tabung ukur
6. Alumnium foil
7. Batang pengaduk
8. Kayu manis yang telah dihaluskan
9. Aquades
4.4.5. Alat dan Bahan Pemeriksaan Glukosa Darah
1. Glukometer
2. Strip Glukometer
3. Jarum suntik
4. Kapas alkohol
5. Betadine
6. Darah ujung ekor tikus
4.4.6. Alat dan Bahan Perlakuan
1. Sonde
2. Spuit 1 cc
3. Handscoen
4. Ekstrak kayu manis
23
4.4.7. Alat dan Bahan Pembedahan
1. Spuit
2. Gunting
3. Tempat organ
4. Pinset
5. Pengait jaringan
6. Handscoon
4.4.8. Alat dan Bahan Pemeriksaan SOD
1. EDTA ( etilen diamin tetra asetat )
2. PBS ( phosphat buffer saline )
3. H2O
4. Xantin
5. Xantin oksidase
6. NBT ( Nitroblue tetrazolium )
7. Pankreas tikus
8. Kertas label
9. Tempat organ
4.4.9. Alat dan Bahan Pemeriksaan MDA
1. TCA 100%
2. HCI 1N
3. Na-thio 1%
4. Pankreas tikus
24
5. Kertas label
6. Tempat organ
4.5. Tahapan Penelitian
4.5.1. Adaptasi dan Pengelompokan Hewan Coba
Tikus akan diadaptasikan didalam kandang hewan coba di laboratorium
Biomolekuler Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya selama 14 hari, dan diberikan
makan dan minum sesuai standar.
1. Kelompok 1 (kontrol negatif) : Hewan coba diberikan diet normal tanpa
perlakuan induksi aloksan dan pemberian ekstrak kayu manis
2. Kelompok 2 (kontrol positif) : Hewan coba di induksi aloksan
3. Kelompok 3: Hewan coba di induksi aloksan + ekstrak kayu manis 0,5 ml
4. Kelompok 4: Hewan coba di induksi aloksan + ekstrak kayu manis 1 ml
5. Kelompok 5 : Hewan coba di induksi aloksan + ekstrak kayu manis 2 ml
4.5.2. Pemeliharaan hewan coba
Seluruh hewan coba dipelihara dalam kandang Laboratorium Biomolekuler
Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya. Masing – masing kandang berisi 5 ekor
tikus. Pembersihan kandang dan penggantian sekam dilakukan setiap satu hari sekali
untuk mencegah terjadinya infeksi sekunder dari urine tikus yang mengandung glukosa.
4.5.3. Preparasi Ekstrak Kayu manis (Cinnamomum burmannii)
Kayu manis (Cinnamomum burmannii) yang telah dikeringkan kemudian dihaluskan
hingga menjadi serbuk kayu manis. Serbuk kayu manis didapat dari Balai Materia
Medica Malang.
25
4.5.4. Proses Ekstraksi Kayu Manis
Sebanyak 10 gram serbuk kayu manis dilarutkan dalam 100 ml air. Kemudian
disimpan dalam waterbath pada suhu 60ºC selama 2 jam. Larutan yang didapat disaring
dengan kertas saring. Ekstrak yang didapatkan kemudian didilusi dengan air dengan
perbandingan 1:10.
Gambar 4.1 : Proses Ekstraksi Kayu Manis
4.5.5. Prosedur Induksi Diabetes
Tikus dipuasakan selama 16-18 jam, namun diberi minum secara bebas. Kemudian
diinjeksi dengan aloksan 150 mg/kgBB yang dilarutkan dalam Normal Saline 0,9 %,
secara intraperitoneal. Setelah 6 jam induksi aloksan, dilakukan injeksi glukosa 10 %
26
sebanyak 4 cc secara intraperitoneal. Air minum diganti dengan larutan glukosa 5 %
pada tempat minum tikus selam 24 jam pasca induksi aloksan. Setelah 72 jam induksi
aloksan, glukosa darah diukur dengan glukometer. Kriteria inklusi adalah tikus dengan
glukosa darah > 180 mg/dl.
Gambar 4.2 : Prosedur Induksi Diabetes
4.5.6. Proses Perlakuan
Sampel dibagi menjadi 5 kelompok masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor
tikus.
1. Kelompok 1 (kontrol negatif) : Tidak diberi perlakuan apa pun.
2. Kelompok 2 (kontrol positif) : Induksi aloksan tanpa ekstrak kayu manis.
3. Kelompok 3 : Induksi aloksan + ekstrak kayu manis 0,5 ml.
4. Kelompok 4 : Induksi aloksan + ekstrak kayu manis 1 ml.
5. Kelompok 5 : Induksi aloksan + ekstrak kayu manis 2 ml.
27
Ekstrak kayu manis diberikan secara oral (sonde) setelah 72 jam pasca induksi aloksan
(hari ke-4) sampai hari ke-18.
4.5.7. Pemeriksaan Glukosa Darah
Dalam penelitian ini, pemeriksaan kadar gula darah pada tikus dilakukan secara
acak atau GDA. Pada hari ke-0 dan hari ke-3 dilakukan pengukuran glukosa darah.
Pemeriksaan glukosa darah pada hari ke-0 dilakukan untuk mengukur kadar glukosa
darah awal, sedangkan pengukuran pada hari ke-3 dilakukan untuk mengetahui efek
hiperglikemik dari aloksan.
Pengukuran dilakukan dengan cara ujung ekor tikus didesinfeksi dengan alkohol,
kemudian ditusuk dengan jarum, selanjunya darah yang menetes dikenakan pada strip
glukometer. Kadar glukosa darah dinyatakan dalam mg/dl. Menurut Kusumawati
(2004), kadar glukosa darah tikus dalam keadaan normal adalah 50-135 mg/dl. Kadar
glukosa darah tikus pada hari ke-3 yang mencapai > 180 mg/dl dinyatakan mengalami
diabetes melitus. Kemudian dilakukan pemberian suplementasi ekstrak kayu manis
selama 14 hari.
4.5.8. Pembunuhan dan Pengambilan Organ Pankreas Hewan Coba
1. Letakkan kapas yang telah diberi eter ke dalam toples besar. Eter berfungsi untuk
membius tikus.
2. Masukkan tikus kedalam toples besar lalu ditutup.
3. Diamkan beberapa saat hingga tikus lemas dan pingsan.
4. Keluarkan tikus dari toples, kemudian baringkan tikus di papan bedah.
28
5. Dengan keadaan tetap di bius menggunakan eter secara inhalasi, ambil organ
pankreasnya.
6. Bungkus organ pancreas dengan kertas alumunium foil.
7. Simpan organ pankreas pada suhu dingin.
4.5.9 Pemeriksaan SOD dan MDA pankreas tikus
a. Pemeriksaan SOD pankreas tikus
Preparasi jaringan pankreas 200 mg, tambahkan 2 cc PBS, dihomogenasi. 0,2 cc
homogenat, ditambahkan berturut-turut EDTA 200 L, NBT 100 L, xanthine oxidase
100 L, dan buffer fosfat 1cc. Inkubasi pada temperatur 380C selama 30 menit.
Kemudian sentrifus dan ambil supernatan. Tambahkan buffer fosfat hingga 3 cc.
Kemudian kadar SOD dibaca dengan spektrofotometer dengan panjang gelombang 580
nm.
b. Pemeriksaan MDA pankreas tikus
Preparasi jaringan pankreas 200 mg jaringan pankreas dipresipitasi dengan TCA
100%. Sedimen ditambahkan 0,25 HCL 0,1 N dan 0,1 larutan sodium barbituric acid
10% dan panaskan dalam air mendidih selama 25 menit. Sentrifus dan ambil
supernatan, bila masih keruh maka harus difilter. Siap diperiksa menggunakan
spektrofotometer pada panjang gelombang 531,6 nm. Penentuan kadar dilakukan
dengan menggunakan kurva baku.
4.6. Analisa Data
Proses pengambilan data pada penelitian ini dilakukan secara bertahap yakni
29
1. Melakukan pengelompokan sampel terlebih dahulu dengan memberikan label
menjadi 5 kelompok. Setiap kelompok ada 5 sampel. Kemudian melakukan
penimbangan dan mencatat berat sampel setiap kelompok.
2. Pada adaptasi selama 14 hari, dilakukan pengamatan kondisi sampel kemudian
menimbang dan mencatat berat sampel setiap kelompok.
3. Dilakukan pembedahan sampel setiap kelompok, kemudian mengambil jaringan
pankreas sampel setiap kelompok untuk dilakukan pemeriksaan kadar SOD dan
MDA.
4. Sebelum dilakukan pemeriksaan, jaringan pankreas sampel setiap kelompok terlebih
dahulu di potong sebagian kemudian ditimbang dan mencatat beratnya.
5. Selanjutnya melakukan pemeriksaan kadar SOD dan MDA sampel setiap kelompok
yang sudah diberikan label.
6. Setelah pemeriksaan selesai, maka akan didapatkan data kadar SOD dan MDA
sampel setiap kelompok.
Setelah data selesai diperoleh, dilakukan pengecekan kelengkapan data. Setelah data
lengkap, kemudian melakukan entry data ke dalam software SPSS versi 17.0.
Selanjutnya mengecek frekuensi distribusi, homogenitas, dan normalitas distribusi data
menggunakan uji Kolmogorov-Smirnov 1 sample dan uji Saphiro wilk. Untuk menarik
kesimpulan dari hipotesis yang telah disebutkan, maka dilakukan pengujian hipotesis.
Karena kelompok sampel pada penelitian lebih dari 2 kelompok, maka dapat dilakukan
uji beda statistik Kruskal-Wallis H atau uji Analysis of Variance (ANOVA). Jika data
tidak terdistribusi dengan normal dan homogen, maka dilakukan uji statistik Kruskal-
Wallis H. Namun, jika data terdistribusi dengan normal dan homogen, maka dilakukan
30
uji statistik ANOVA yang dilanjutkan dengan post hoc tests menggunakan uji LSD
(Least Significant Difference) untuk mengetahui perbadingan antar perlakuan. Hasil
dikatakan bermakna bila p ≤ 0,05.
4.7. Desain Penelitian
4.7.1. Diagram Alur Penelitian
31
32
4.7.2. Jadwal Penelitian
No. Kegiatan Minggu
ke-1
Minggu
ke-2
Minggu
ke-3
Minggu
ke-4
Minggu
ke-5
1.Pembelian alat, bahan, dan
hewan coba
2. Adaptasi hewan coba
3. Pemeriksaan Glukosa Darah
4. Induksi aloksan
5. Pemberian ekstrak kayu
manis
6.
Pembunuhan hewan coba,
pengambilan sampel
pankreas, dan pemeriksaan
SOD dan MDA hepar
7. Tabulasi dan analisa data
8. Penulisan laporan dan
pembahasan
9. Penerbitan artikel
33