Uji Aktivitas Antikanker Secara Invitro dengan metode BSLT ( Brine Shrimp Letality Test )Tahapan uji BSLT adalah sebagai berikut (McLaughlin, 1998):1. Pembuatan medium penetasanSebanyak 300 ml medium penetasan disiapkan, kemudian disaring.2. Penetasan telurMedium penetasan yang telah disiapkan dimasukkan ke dalam beaker glass. Telur Artemia salina dimasukkan ke dalam wadah tersebut dan dibiarkan selama 24-48 jam, disertai aerasi kuat di bawah cahaya lampu sampai telur-telur tersebut menetas. Setelah menetas, larva A. salina diambil dengan pipet untuk dipindahkan ke dalam vial.3. Pembuatan variasi konsentrasiLarutan induk dengan konsentrasi 10.000 g/ml dibuat dengan melarutkan 20 mg sampel dalam 200 l DMSO untuk membantu proses pelarutan, lalu ditambahkan 1800 l medium pemeliharaan ke dalamnya. Dari larutan tersebut, dibuat berbagai variasi konsentrasi lalu ditempatkan ke dalam vial-vial. Pada pengujian tahap 1 variasi konsentrasi yang digunakan adalah 1000g/ml, 100 g/ml, 10 g/ml dan 1 g/ml, sedangkan pada pengujian tahap II variasi konsentrasi dipersempit sesuai data yang diperoleh.4. Pengujian terhadap larva Artemia salinaPengujian dilakukan dengan memasukkan 10 ekor larva Artemia salina ke dalam vial yang telah berisi larutan uji. Efek toksik ditentukan setelah larva Artemia salina terpapar selama 24 jam dengan larutan uji dengan cara menghitung persentase mortalitasnya. Pengujian dilakukan secara triplo. DMSO dan medium pemeliharaan tanpa penambahan bahan uji digunakan sebagai blanko lalu dibuat pengenceran yang sama seperti variasi konsentrasi bahan uji. Larva dianggap mati jika tidak memperlihatkan gerakan selama waktu pengamatan dan tidak hidup kembali ketika dipindahkan ke dalam medium pemeliharaan.5. Perhitungan nilai LC50Efek toksik dilihat dari pengamatan dengan menghitung persen mortalitas.

Untuk membuat grafik, sumbu x adalah log konsentrasi dan sumbu y adalah persentase mortalitas sehingga didapatkan persamaan garis y = ax + b. dari persamaan garis tersebut dihitung nilai LC50 dengan memasukkan angka 50 sebagai y. nilai x yang diperoleh menunjukkan LC50 dari bahan uji. LC50 menunjukkan kematian 50% hewan uji pada konsentrasi tertentu. Jika pada control ada larva yang mati, maka persentase mortalitas dihitung menggunakan rumus Abbot sebagai berikut:

dengan T : Jumlah larva A. salina uji yang matiK : Jumlah larva A. salina kontrol yang mati10 : Jumlah larva A. salina ujiSuatu senyawa dikatakan toksik jika nilai LC50 < 100 g/ml

Uji Keamanan

Hewan coba yang digunakan sebanyak14 ekor mencit galur Swiss, jenis kelamin jantan dan betina, umur 3 bulan dengan berat rata-rata25-30 gram. Mencit dikandangkan menggunakan fasilitas kandangyang memenuhi syaratdengan suhu pemeliharaan 26 10C, dan kelembaban 65 5 %. Mencit sebelum diberi perlakuan diadaptasikan dahulu terhadap kondisi penelitian selama 1 minggu. Selanjutnya, membuat rancanganpercobaan LD50 berdasarkan metode Weil (1952).MaksuddariLD50 adalahdalam dosis dimana 50% dari populasi spesies tertentu mati. Untuk menentukan LD50, terlebih dahulu dilakukan penelitian dengan menggunakan 2 ekor mencit pada tiap kelompok. Uji ini dimaksudkan untuk mendapatkan dosis antara di mana kedua mencit tidak mengalami kematian dan dosis yang mengakibatkan kedua mencit mengalami kematian. Tahapan yang sesungguhnya, mencit dipuasakanmakansebelum diperlakukan namun tetap diberi minum selama 4 jam sebelum perlakuan dan 2 jam sesudah perlakuan.Selanjutnya sediaanproduk bahan herbal diberikan secara oral dengan dosistertentu misalnya 312,5; 625; 1250; 2500; 5000; dan 10000 mg/Kg BB. Untuk contoh pemberian dosis seperti diatas, hewan uji dibagi ke dalam 7 kelompok perlakuan sebagai berikut:1. kelompok A: kontrol, diberi makan dan minum standar;oral;2. kelompok B sampai dengan G secara berturut-turut diberi dosis : 312,50 mg, 625 mg, 1250 mg, 2500 mg, 5000 mg dan 10000 mg/Kg BB/per oral.Penentuan LD50dilakukan dengan melihatdatakematian mencit pada setiap kelompok perlakuan mulai dosis 312,5 10000 mg/Kg BB selama 48 jam. Data kematian dari setiap kelompok diolah menjadi data kumulatif yang kemudian dijadikan persentase kematian. Hasil persentase kematian kemudian diolah menurut metode Reed-Muench dengan interpolasi linier untuk mendapat LD50dan standar error (SE).Sedangkan metode penetapansifattoksikdilakukan setelah perlakuan dengan bahan uji pada dosis tunggal, jumlah kematian hewan uji yang mati diamati selama 24 jam. Apabila diperlukan, pengamatan kematian hewan uji dapat diikuti sampai hari ke-15.Untuk metode penetapan gejala klinispada umumnya menimbulkan beberapa gejala klinis, di antaranya peningkatan aktifitas, peningkatan laju bernafas, mencit tampak meregangkan badan dan beristirahat di sudut kandang.Hal ini disebabkan karena kandungan bahan kimiadari produk herbalyang memiliki sifat toksik berat.Pada akhirnya mencit mulai menutup mata dan terlihat tenang, dan akhirnya mengalami kematian setelah periode kritis (3 jam).