Isolasi Flavonoid

I. ISOLASI

a. Tujuan Isolasi

1. Isolasi senyawa yang tidak diketahui sama sekali dengan aktivitas tertentu.

2. Memurnikan senywa untuk karakterisasi penuh atau parsial.

3. Menyediakan material yang cukup untuk menerima/membantah proposal struktur

b. Arah Isolasi

Sebelum melakukan suatu isolasi senyawa, maka yang dilakukan adalah ekstraksi terlebih dalu, prinsip berdasarkan polaritas.

c. Ekstraksi

Proses mengambil / menarik suatu senyawa yang terdapat dalam suatu bahan dengan pelarut yang sesuai. Proses yang terjadi dalam ekstraksi adalah terlarutnya senyawa yg dapat larut dari sel melalui difusi, tergantung dari letak senyawa dalam sel dan juga permeabilitas dinding sel dari bahan yang akan di ekstraksi. Prinsip “Like Disolve Like”

Metode Ekstraksi

Berdasarkan terbentuknya gardien konsentrasi, motode ekstraksi terbagi menjadi 2 :

1. Gradien konsentrasi solvent-sampel yang tetap, terdiri dari

a) Maserasi Diam,

b) Maserasi Dengan Pengadukan,

c) Digesti,

d) Ekstraksi Dengan Bantuan Gelombang Ultrasonik.

1

2. Gradien konsentrasi solvent-sampel yang dinamis

a) Perkolasi,

b) Countercurrent Extraction,

c) Perkolasi Dalam Vakum,

d) Perkolasi Dengan Tekanan,

e) Soxhlet.

Maserasi

Secara harfiah berarti merendam. Metode ini merupakan metode yang paling sederhana, tidak ada batas pelarut dalam metode ini. Catatan jika menggunakan metode ini, simplisia dibasahkan terlebih dahulu, jika tidak di khawatirkan akan ada simplisia yang tidak teraliri pelarut. Proses maserasi sendiri dilakukan secara berulang dengan memisahkan cairan perendam dengan cara penyaringan, dekantir atau di peras, selanjutnya ditambahkan lagi penyari segar kedalam ampas hingga warna rendaman sama dengan warna pelarut.

Perkolasi

Perkolasi adalah cara penarikan memakai alat yang disebut perkolator, dimana simplisia terendam dalam cairan penyari sehingga zat-zatnya terlarut dan larutan tersebut akan menetes secara beraturan keluar sampai memenuhi syarat-syarat yang telah ditetapkan.

Soxhlet

Merupakan metode ekstraksi yang memanfaatkan pemanasan untuk destilasi pelurut sehingga terjadi sirkulasi pelarut melalui serbuk simplisia. Metode ini efisiensi dalam pemanfaatan pelarut tetapi berisiko pembentukan artefak akibat penggunaaan panas. Prinsip pemanasan-penguapan-pendinginan-perendaman.

Destilasi

Merupakan metode ekstraksi yang memanfaatkan perbedaan titik didih dari senyawa. Biasa digunakan untuk mengisolasi minyak atsiri. Destilasi dibagi menjadi 3 yaitu destilasi air, destilasi uap dan destilasi uap-air.

d. Kromatigrafi Lapis Tipis (KLT)

Prinsip interaksi yang terjadi anatara analit dan fase gerak --> Like Disolve Like. Kromatografi adalah suatu nama yang diberikan untuk teknik pemisahan tertentu. Pada dasarnya semua cara kromatografi menggunakan dua fase yaitu fasa diam dan fasa gerak, pemisahan tergantung pada gerakan relatif dari dua fasa tersebut. Cara-cara kromatografi dapat digolongkan sesuai dengan sifat-sifat dari fasa tetap, yang dapat berupa zat padat atau zat cair. Jika fasa diam berupa zat padat maka cara tersebut dikenal sebagai kromatografi serapan, jika zat cair dikenal sebagai kromatografi partisi.

2

Karena fasa gerak dapat berupa zat cair atau gas maka semua ada empat macam sistem kromatografi yaitu kromatografi serapan yang terdiri dari kromatografi lapis tipis dan kromatografi penukar ion, kromatografi padat, kromatografi partisi dan kromatografi gas-cair serta kromatografi kolom kapiler.

1. KLT Preparatif

Tujuan untuk mengisolasi, KLT preparatif merupakan proses isolasi yang terjadi berdasarkan perbedaan daya serap dan daya partisi serta kelarutan dari komponen-komponen kimia yang akan bergerak mengikuti kepolaran eluen. Oleh karena daya serap adsorben terhadap komponen kimia tidak sama, maka komponen bergerak dengan kecepatan yang berbeda sehingga hal inilah yang menyebabkan pemisahan.

2. KLT 2 Dimensi

Tujuan uji kemurniaan, KLT 2 arah atau 2 dimensi bertujuan untuk meningkatkan resolusi sampel ketika komponen-komponen solute mempunyai karakteristik kimia yang hampir sama, karenanya nilai Rf juga hampir sama sebagaimana dalam asam-asam amino. Selain itu, 2 sistem fase gerak yang sangat berbeda dapat digunakan secara berurutan sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan analit yang mempunyai tingkat polaritas yang berbeda.

Sampel ditotolkan pada lempeng lalu dikembangkan dengan satu sistem fase gerak sehingga campuran terpisah menurut jalur yang sejajar dengan salah satu sisi. Lempeng diangkat, dikeringkan dan diputar 90° dan diletakkan dalam bejana kromatografi yang berisi fase gerak kedua sehingga bercak yang terpisah pada pengembangan pertama terletak dibagian bawah sepanjang lempeng, lalu dikromatografi lagi.

3. Deteksi dengan KLT dapat dilakukan dengan cara :

o Sinar tampak,

o Sinar UV,

o Pereaksi warna.

II. FLAVONOID

Senyawa flavonoid adalah senyawa yang mengandung C5 terdiri atas dua inti fenolat yang dihubungkan dengan tiga satuan carbon. Cincin A mamiliki karakteristik bentuk hidroksilasi floroglusinol / resorsinol, dan cincin B biasanya 4-, 3,4- atau 3,5,4-terhidroksilasi. Flavonoid (terutama glikosida) mudah mengalami degradasi enzimatik ketika dikoleksi dalam bentuk segar. Oleh karena itu disarankan koleksi yang dikeringkan atau dibekukan. Ekstraksi menggunakan solven yang sesuai dengan tipe flavonoid yang dikehendaki. Polaritas menjadi pertimbangan utama. Flavonoid kurang polar (isoflavones, flavanones, flavones termetilasi, dan flavonol) terekstraksi dengan chloroform, dichloromethane, diethyl ether, atau ethyl acetate. Sedangkan flavonoid glycosides dan aglikon yang lebih polar terekstraksi dengan

3

alcohols atau campuran alcohol air. Glikosida meningkatkan kelarutan ke air dan alkohol-air. Flavonoid dapat dideteksi dengan berbagai pereaksi, antara lain : Sitroborat, AlCl3, NH3.

III. CONTOH CARA KERJA

Isolasi Flavonoid dari Kulit Buah Mahkota Dewa (Phaleria Macrocarpa)

a. Tujuan

1. Dapat mengekstraksi kulit buah mahkota dewa dengan metode perkolasi.

2. Dapat mengisolasi flavonoid dari Kulit Buah Mahkota Dewa dengan metode KLT preparatif.

3. Dapat melakukan pemurnian hasil isolasi flavonoid dengan KLT 2 dimensi

b. Cara kerja

1. Ekstraksi serbuk buah mahkota dewa :

Ditimbang 10 gram serbuk mahkota dewa, dimasukkan kedalam alat perkolator, diekstraksi dengan larutan n-heksan.

Residu diekstraksi dengan menggunakan metanol dengan perkolator sampai jernih (dicatat volume metanol dan sari metanol).

Sari metanol dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator, ekstrak pekat yang diperoleh ditimbang dan disimpan dalam wadah tertutup.

Dilakukan penjenuhan bejana oleh uap pengembang, pengembang yang digunakan : n-heksan, metanol, BAW 4:1:5, dan BAW 9:2:6.

Ekstrak metanol ditotolkan pada plat KLT 2x10 cm, dilakukan pengembangan plat KLT setelah bejana jenuh.

Dideteksi bercak pada sinar tampak dan lampu UV 254 nm dan 366 nm.

4

Dicatat warna bercak dan Rf dari setiap pengembang yang digunakan, ditentukan eluen yang paling baik dan digunakan untuk pemisahan dengan KLT preparatif.

2. Pemurnian Flavonoid menggunakan KLT preparatif

Pemisahan flavonoid menggunakan KLT preparatif dilakukan pada plat KLT 5x10 cm, pengembang yang digunakan adalah pengembang terbaik pada deteksi awal.

Dideteksi dengan menggunakan lampu UV 366 nm, bercak dengan pita ditandai dengan pensil.

Bercak yang ditandai dikerok dan dilarutkan dalam metanol.

Dilakukan identifikasi menggunakan spektrofotometer UV dengan λ 256 nm

3. Pembuktian kemurnian flavonoid

Dilakukan dengan teknik KLT 2 dimensi, pengembangan dilakukan pada plat KLT 6x6 cm.

Ekstrak metanol ditotolkan 1 cm dari tepi bawah kanan.

Pengembang pertama yang digunakan adalah pengembang terbaik dari identifikasi awal, pengembang kedua menggunakan pelarut asam asetat 15%.

Plat dielusi pada posisi 90° dari kondisi mula-mula.

c. Cara Menggunakan Alat Perkolator

Alat perkolator sebelumnya harus dibersihkan untuk menghilangkan pengotor, selanjutnya masukkan kapas kedalam alat perkalator dan dipadatkan. Tinggi kira-kira sama dengan diameter perkolator tsb, masukkan kertas saring diatas kapas sesuai dengan ukuran perkolator (bulat). Lalu tambahkan simplisia yang akan diekstraksi (sebelumnya telah dibasahkan dengan pelarut yang digunakan), padatkan kemudian kembali masukkan kertas saring diatasnya. Tambahkan pelarut hingga semua simplisia terendam. Lalu pelarut dialirkan, saat pelarut telah sampai dibatas paling atas simplisia, segera tambahkan pelarut lagi. Jangan sampai permukaan atas menjadi kering.

d. Cara pembuatan pengembang BAW (Buthanol, Acetic acid, Water)

Ukur masing-masing jumlah volume sesuai dengan yang dibutuhkan. Campurkan kedalam corong pisah, kemudian gas di keluarkan. Diamkan minimal 1 x 24 jam (terjadi pemisahan 2 fase), bagian yang digunakan adalah yang atas. Pemilihan eluen terbaik berdasarkan jumlah spot yang dihasilkan, semakin banyak spot maka semakin baik eluen tersebut.

5

e. Cara pembuatan plat KLT preparatif

Timbang 30 gram silika kemudian dilarutkan dalam 60mL aquades. Dibuat plat KLT dengan ketebalan 0,25 mm, lakukan pekerjaan ini dengan cepat.

f. Deteksi dengan Spektrofotometer UV 

Spektrofotometer merupakan alat untuk mengukur transmitan atau serapan suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Unsur-unsur penting dalam spektorfotometer.

1. Sumber lampu  lampu duetrium digunakan untuk daerah UV pada panjang gelombang dari 190-350 nm, sementara lampu halogen kuarsa / lampu tungsten digunakan untuk daerah visible (pada panjang gelombang 350-900 nm).

2. Monokromator digunakan untuk memperoleh sumber sinar yg monokromatis.

3. Kuvet  tempat sampel.

4. Detektor pemberi respon terhadap cahaya pada berbagai panjang gelombang yang selanjutnya dibaca pada sistem komputer.

5. Amplifier 

6. Sistem pembacaan Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis adalah panjang gelombang maksimum.

6