ISOLASI DAN PEMURNIAN LAKTOFERIN DARI

KOLOSTRUM KAMBING PERANAKAN ETAWA SEBAGAI

ANTIVIRUS Human Papillomavirus

ANGGRAENI RAMADHALETA YUGIS

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2015

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Isolasi dan Pemurnian

Laktoferin dari Kolostrum Kambing Peranakan Etawa sebagai Antivirus Human

Papillomavirus adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing

dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun.

Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun

tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan

dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.

Bogor, September 2015

Anggraeni Ramadhaleta Yugis

NRP G451130031

RINGKASAN

ANGGRAENI RAMADHALETA YUGIS. Isolasi dan Pemurnian Laktoferin dari

Kolostrum Kambing Peranakan Etawa sebagai Antivirus Human Papillomavirus.

Dibimbing oleh IRMA HERAWATI SUPARTO dan JOKO PAMUNGKAS.

Kanker serviks (leher rahim) merupakan kanker tertinggi kedua prevalensi

pada wanita. Data World Health Organization pada tahun 2013 menyatakan

bahwa setiap tahunnya sekitar 270 000 wanita meninggal diakibatkan kanker

serviks dan lebih dari 85% terjadi di negara berkembang. Kanker serviks ini

disebabkan oleh infeksi Human Papillomavirus (HPV). Untuk mencegah

terjadinya kanker dapat dilakukan dengan cara mengonsumsi sumber pangan

seperti susu. Salah satu protein yang terkandung di dalam susu dan kolostrum

adalah laktoferin (Lf). Lf dengan konsentrasi tertinggi terdapat pada kolostrum.

Bobot molekul Lf sekitar 80 kDa dan memiliki muatan positif. Lf memiliki peran

penting dalam sistem imun nonspesifik yang bertindak sebagai antivirus, bakteri

dan jamur. Kemampuan Lf yang paling utama untuk berperan sebagai pertahanan

atau yang bersifat antivirus adalah mencegah virus memasuki sel inang sehingga

infeksi dapat dicegah pada tahap awal dan pemblokan pada reseptor heparan sulfat

yang merupakan reseptor. Lf dapat dimurnikan dari kolostrum dan susu melalui

beberapa metode seperti kromatografi penukar ion, filtrasi gel dan kromatografi

afinitas. Tujuan penelitian ini adalah isolasi dan pemurnian Lf dari kolostrum

kambing peranakan etawa yang merupakan kambing endemik Indonesia dan

menentukan aktivitas antivirus terhadap HPV.

Protein Lf dimurnikan melalui metode kromatografi penukar kation dengan

menggunakan resin karboksimetil (CM) Sephadex C-50 dan melalui kromatografi

dua dimensi dengan metode kromatografi penukar kation (CM Sephadex C-50)

dan kromatografi filtrasi gel (Sephadex G-75). Metode kromatografi penukar ion

dielusi dengan menggunakan kenaikan konsentrasi larutan NaCl 0.0-0.5 N dan

kromatografi dua dimensi pada tahapan filtrasi gel dielusi dengan larutan dapar

PBS. Resin penukar ion CM Sephadex C-50 merupakan resin penukar kation

lemah yang mampu memisahkan biomolekul yang memiliki muatan positif

dengan rentang bobot molekul antara 4-100 kDa. Resin Sephadex G-75 memiliki

kemampuan untuk memisahkan biomolekul dengan rentang 3-80 kDa. Kedua

resin ini cocok untuk memisahkan Lf yang memiliki muatan dan bobot molekul

dengan kisaran 80 kDa. Profil pemisahan dan pemurnian Lf diperiksa dengan

menggunakan sodium deodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-

PAGE) dibandingkan dengan Lf murni dari sapi (bLf). Konsentrasi Lf ditentukan

dengan metode bicinchoninic acid assay (BCA). Lf murni yang telah diperoleh

dievaluasi aktivitas antivirus terhadap HPV secara in vitro dengan pada sel HeLa.

Teknik Real time PCR digunakan untuk menentukan kemampuan Lf kambing

(gLf) menghambat replikasi HPV.

Hasil yang diperoleh bahwa pemurnian dengan metode kromatografi

penukar ion belum dapat memurnikan Lf secara maksimum, tetapi metode

kromatografi dua dimensi menghasilkan gLf murni. Bobot molekul Lf murni,

yaitu 82 kDa dengan konsentrasi 379 μg/mL. Adanya penghambatan replikasi

HPV ditandai dengan kenaikan nilai cycle treshold (Ct) atau ambang siklus. Pada

hari pertama setelah inkubasi dengan Lf belum terjadi kenaikan nilai Ct atau

belum terjadi penghambatan replikasi HPV. Pada hari ke-2 dan ke-3 setelah

inkubasi terjadi peningkatan nilai Ct yang berarti bahwa terjadi penghambatan

replikasi HPV oleh laktoferin. Laktoferin memiliki kemampuan penghambatan

replikasi DNA virus HPV dengan konsentrasi gLf 100 μg/mL setelah tiga hari

inkubasi dalam sel HeLa. Hal ini mengindikasikan bahwa laktoferin memiliki

aktivitas sebagai antiHPV.

Kata kunci: Laktoferin kambing, isolasi, pemurnian, kromatografi filtrasi gel,

kromatografi penukar ion

SUMMARY

ANGGRAENI RAMADHALETA YUGIS. Isolation and Purification Lactoferrin

from Etawa Goat as Antiviral Human papilomavirus. Supervised by IRMA

HERAWATI SUPARTO and JOKO PAMUNGKAS.

Cervical cancer is the second most common cancer in women worldwide.

Evidence from World Health Organization (2013), every year mortality due to

cervical cancer were more than 270 000 women, more than 85% of these death

were from low and middle income countries. Infection of human papillomavirus

(HPV) can cause cervical cancer in women’s reproduction system. Efforts to find

cure or prevention continues including the search of the use of natural products

such as milk. One of the compound proteins in milk is lactoferrin (Lf). The

highest concentration of Lf can be found in colostrum. The concentration of Lf in

colostrum and milk varies widely from one species to another. Lf is an 80 kDa

iron-binding protein that has an important role in the non-specific immune system

such as in the defense mechanisms against virus, bacteria and fungi. The antiviral

activity of Lf act in the early phase of the viral infection thus preventing entry of

virus into the host cell, either by blocking cellular receptors or by direct binding to

virus particles. The most probable mechanism preventing virus entry by

interacting with the viral attachment receptor heparan sulfate. Lf can be purified

from colostrum and milk by several methods such as ion exchange

chromatography, gel filtration and affinity chromatography. The aims of this

study were to focus on the isolation and purification of Lf from Indonesian local

goat colostrums and observing its activities as antiviral Human Papillomavirus

(HPV).

Lf was purified by cation exchange chromatography on carboxymethyl

Sephadex C-50 resin eluted by increasing stepwise the molarity of NaCl 0-0.5 M

in the PBS and by two-dimension chromatography with cation exchange

chromatography (CM Sephadex C-50) - gel filtration chromatography (Sephadex

G-75). CM Sephadex C-50 resins is weak cation exchange that has the ability to

separate the positive charge of biomolecule with molecular range 4-100 kDa and

Sephadex G-75 have the ability to separate the biomolecule with molecular weight

range 3-80 kDa. Both resins were compatible to separate and purified the Lf.

Purity of Lf was analyzed by sodium deodecyl sulphate-poliacrylamide gel

electrophoresis (SDS-PAGE) and compared with commercial bLf. The

concentration of gLf determined by bicinchoninic acid assay (BCA) kit. The pure

gLf was further evaluated for its in vitro antiviral activity to HPV on HeLa cell

line. Real time PCR was used to examine the ability of goat lactoferrin (gLf) to

inhibit the replication of HPV.

The result showed that chromatography by ion exchange not yet purified the

Lf, but two-dimension chromatography was successful in purifying gLf. The

molecular weight of purified gLf was 82 kDa and concentration was 364 μg/mL

as measured by BCA assay. A positive inhibition of HPV replication indicated by

the increased value of Ct. On the first day after incubation with Lf, Ct value not

increase that implied the replication of HPV were still not inhibited by Lf, this

could be due to the lack of interaction between gLf and the HPV. However, on

day-2 and day-3 an increase of Ct value that implied that Lf inhibited HPV

replication. The highest inhibition of replication was on the third day after

incubation with gLf 100 μg/mL. This indicated that Lf had ability to inhibit HPV

replication.

Keywords: goat lactoferrin, isolation, purification, gel filtration chromatography,

ion exchange chromatography

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015

Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang

Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan

atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,

penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau

tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan

IPB

Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini

dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

Tesis

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Magister Sains

pada

Program Studi Kimia

ISOLASI DAN PEMURNIAN LAKTOFERIN DARI

KOLOSTRUM KAMBING PERANAKAN ETAWA SEBAGAI

ANTIVIRUS Human Papillomavirus

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2015

ANGGRAENI RAMADHALETA YUGIS

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr Mohamad Rafi, MSi

Judul Tesis : Isolasi dan Pemurnian Laktoferin dari Kolostrum Kambing

Peranakan Etawa sebagai Antivirus Human Papillomavirus.

Nama : Anggraeni Ramadhaleta Yugis

NRP : G451130031

Disetujui oleh

Komisi Pembimbing

Dr dr Irma Herawati Suparto, MS

Ketua

Dr drh Joko Pamungkas, MSc

Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi Kimia

Prof Dr Dyah Iswantini, MScAgr

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian: 27 Agustus 2015 Tanggal Lulus:

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas

segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang

dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Juli 2014 ini ialah isolasi

protein, dengan judul Isolasi dan Pemurnian Laktoferin dari Kolostrum Kambing

Peranakan Etawa sebagai Antivirus Human Papillomavirus.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr dr Irma Herawati Suparto MS

dan Bapak Dr drh Joko Pamungkas MSc sebagai pembimbing, Prof Dr Dyah

Iswantini MScAgr selaku Ketua Program Studi Kimia, rekan-rekan dari Pusat

Studi Satwa Primata Ibu Dr drh Diah Iskandriati, Bapak Dr Uus Saepuloh

MBiomed, Bapak Agus Saputra, SSi MSi, Ibu Silmi Mariya MS, Ibu Isti

Kartikasari MSi, Ibu Rachmita Noviana, SKH MSi , Kakak Iin Indriawati SSi,

Kakak Tri Fauziani SSi, Kakak Sela Septima Mariya SSi, Kakak Elis Dwi yang

telah banyak memberi bantuan dalam menyelesaikan penelitian ini. Terima kasih

kepada rekan-rekan mahasiswa Sekolah Pascasarjana Kimia 2013 Novita Rose

Diana SPd, Wahyuning Lestari SPd, Fatan Umbara SSi, Doni Notriawan SSi,

Anom Cahyotomo SPd, Syamsul Hidayat SSi, Muhsinun SSi dan Yuspian Nur

SPd yang banyak memberikan bantuan selama studi. Ungkapan terima kasih juga

disampaikan kepada ayah, ibu, seluruh keluarga atas segala doa dan kasih

sayangnya.

Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Direktorat Jendral

Pendidikan Tinggi (DIKTI) yang telah memberikan dana pendidikan melalui

Beasiswa Pendidikan Pascasarjana Dalam Negeri (BPPDN) dari Tahun 2013

hingga Tahun 2014.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, September 2015

Anggraeni Ramadhaleta Yugis

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL vi

DAFTAR GAMBAR vi

DAFTAR LAMPIRAN vi

1 PENDAHULUAN 1 Latar Belakang 1

Perumusan Masalah 2

Tujuan Penelitian 2

Manfaat Penelitian 2

2 TINJAUAN PUSTAKA 3

Laktoferin 3

Pemurnian Laktoferin 5

3 METODE 7

Waktu dan Tempat penelitian 7

Bahan 7

Alat 7

Prosedur Kerja 8

Isolasi dan Pemurnian Laktoferin 8

Elektroforesis SDS-PAGE 8

Penentuan Total Protein 8

Kultur Sel HeLa 9

Ekspresi Gen dengan Teknik Real Time PCR 9

4 HASIL DAN PEMBAHASAN 9

Isolasi dan Pemurnian Laktoferin 9

Profil Inhibisi Laktoferin terhadap DNA HPV 12

5 SIMPULAN DAN SARAN 14

Simpulan 14

Saran 14

DAFTAR PUSTAKA 14

LAMPIRAN 19

RIWAYAT HIDUP 21

DAFTAR TABEL

1 Perbedaaan kandungan laktoferin berbagai spesies 4 2 Jenis resin dan gugus penukar ion 5 3 Jenis gel untuk pemurnian biomolekul pada kromatografi filtrasi gel 6 4 Nilai Ct dan persen hambat gLf dan bLf terhadap virus HPV dari pellet

sel lestari HeLa 13

DAFTAR GAMBAR

1 Struktur tiga dimensi laktoferin 3 2 Elektroforegram gradien konsentrasi NaCl 10 3 Elektroforegram fraksi 1-7 elusi 0.5 N NaCl 11 4 Ektroforegram hasil kromatografi dua tahapan fraksi1-7 11 5 Elektroforegram purifikasi gLf dengan 2 tahapan kromatografi 12 6 Mekanisme aktivitas antivirus laktoferin 13

DAFTAR LAMPIRAN

1 Tabel bobot molekul standar protein 19 2 Kurva normalitas bobot molekul standar protein 19 3 Tabel konsentrasi standar protein berbanding absorbasi 20 4 Kurva normalitas konsentrasi protein standar 20

1 PENDAHULUAN

Latar Belakang

Kanker serviks (leher rahim) merupakan kanker dengan prevalensi tertinggi

kedua pada wanita. Data World Health Organization (WHO) pada tahun 2013

menyatakan bahwa setiap tahunnya lebih dari 530 000 kasus dan sekitar 270 000

wanita meninggal diakibatkan kanker serviks dan lebih dari 85% terjadi di negara

berkembang. Kanker serviks ini dapat disebabkan oleh infeksi Human

Papillomavirus (HPV). Virus ini merupakan virus DNA yang tidak memiliki

selubung pelindung dan merupakan anggota dari Papillomaviridae. HPV

menyerang mukosa sel, kulit, dan saluran reproduksi. Jika infeksi HPV ini terjadi

pada mulut rahim wanita, hal inilah yang akan memicu terjadinya kanker serviks

(WHO 2013). Salah satu usaha untuk mencegah terjadinya kanker dapat dilakukan

dengan cara mengonsumsi sumber pangan seperti susu yang mengandung

senyawa-senyawa yang dapat mencegah berkembangnya sel-sel kanker. Davoodi

et al. (2013) menyatakan potensi dan manfaat kesehatan dari mengonsumsi susu

dan produk susu untuk dapat mencegah terjadinya kanker.

Susu mengandung banyak senyawa yang dibutuhkan oleh tubuh (Potocnik

et al. 2011). Khususnya kolostrum atau susu pertama mengandung sangat banyak

protein yang memiliki sifat sebagai komponen bioaktif (Indyk dan Filonzi 2004;

Ebringer et al. 2008; Wu et al. 2010; Wu et al. 2011). Salah satu protein yang

terkandung di dalam susu dan kolostrum adalah laktoferin (Lf) (Campanella et al.

2009) yang memiliki berbagai bioaktivitas yang menguntungkan dalam bidang

medis seperti antibakteri (Conesa et al. 2008; Moradian et al. 2014), antivirus dan

antikanker (Tanaka et al. 1999; Strate et al. 2001; Pietrantoni et al. 2003; Groot et

al. 2005; Mistry et al. 2007; Chen et al. 2008; Chien et al. 2008; Berlutti et al.

2011; El-Fakharany et al. 2012 dan 2013), anti-tumor (Fujita et al. 2004; Yamada

et al. 2007; Florin et al. 2012) dan anti-inflamasi (Florian et al. 2012). Laktoferin

juga diketahui memiliki aktivitas anti-HPV yang telah dilaporkan Mistry et al.

(2007) bahwa Lf murni dari susu manusia (hLf, human lactoferrin) dan susu sapi

(bLF, bovine lactoferrin) memiliki aktivitas antivirus HPV Hasil penelitian yang

dilakukan Mistry et al. (2007) dilaporkan bahwa hLf dan bLf berpotensi untuk

menghambat infeksi yang disebabkan HPV khususnya tipe 5 dan tipe 16.

Laktoferin memiliki kemampuan untuk mengikat DNA ataupun RNA dari suatu

virus tertentu. Kemampuan Lf yang paling utama untuk berperan sebagai

pertahanan atau yang bersifat antivirus adalah adanya pengikatan pada membran

glikosaminoglikan dan pemblokan reseptor yang spesifik pada permukaan sel

target. Dengan cara ini, Lf mencegah virus memasuki sel dan infeksi dapat

dicegah. (Adlerova et al. 2008; Berlutti et al. 2011; El-Loly dan Mahfous 2011).

Laktoferin umumnya ditemukan pada susu mamalia seperti kambing, sapi,

domba, kerbau, gajah, unta dan bahkan pada air susu manusia. Banyak penelitian

yang telah dilakukan untuk menguji aktivitas laktoferin sebagai antivirus, namun

pada beberapa penelitian umumnya memanfaatkan kolostrum yang bersumber

dari susu sapi dan susu manusia sedangkan penelitian yang dilakukan pada

kolostrum ataupun susu kambing peranakan etawa terutama untuk uji antiHPV

belum pernah dilaporkan. Oleh sebab itu penting untuk dilakukan studi mengenai

2

isolasi dan pemurnian Lf bersumber dari kolostrum kambing peranakan etawa

yang merupakan kambing endemik di Indonesia (goat lactoferrin, gLF). Kambing

peranakan etawa dipilih karena merupakan kambing penghasil susu dan dikenal

serta dipercaya memiliki banyak manfaat di kalangan masyarakat.

Pemurnian Lf dapat dilakukan dengan menggunakan metode kromatografi

penukar ion, filtrasi gel, kromatografi afinitas dan metode kromatografi dua

tahapan untuk memaksimalkan hasil pemurnian Lf. Metode kromatografi yang

digunakan pada penelitian ini, yaitu kromatografi penukar ion menggunakan resin

karboksimetil (CM) Sephadex C-50 dan kromatografi dua tahapan menggunakan

metode kromatografi penukar ion (CM Sephadex C-50) serta kromatografi filtrasi

gel (Sephadex G-75). Resin penukar ion CM Sephadex C-50 merupakan resin

penukar kation lemah yang mampu memisahkan biomolekul yang memiliki

muatan positif dengan rentang bobot molekul antara 4-80 kDa (Sivasankar 2014),

resin ini digunakan untuk memurnikan Lf yang memiliki muatan positif dengan

bobot molekul berkisar 80 kDa. Resin Sephadex G-75 memiliki kemampuan

untuk memisahkan biomolekul dengan rentang 3-80 kDa (Sivasankar 2014). Oleh

karena itu, Sephadex G-75 digunakan pada pemisahan dua tahapan kromatografi

untuk memaksimalkan pemurnian Lf. Untuk melihat profil pemisahan Lf yang

diperoleh dari proses kromatografi akan dilakukan elektroforesis SDS-PAGE

(sodium dodecyl sulpfate polyacrylamide gel electrophoresis) dan untuk

menentukan bobot molekulnya dibandingkan dengan penanda bobot molekul

standar dan bLf yang dijual secara komersil. Laktoferin yang diperoleh dari proses

pemurnian ini akan diuji aktivitas anti-HPV secara in vitro terhadap sel HeLa.

Perumusan Masalah

Laktoferin merupakan protein yang diketahui memiliki banyak manfaat

pada bidang kesehatan dan dapat diperoleh dari kolostrum serta susu dari kambing

peranakan etawa. Biokativitas Lf yang bersumber dari manusia dan sapi telah

banyak dilaporkan tetapi untuk aktivitas Lf yang bersumber dari kambing

peranakan etawa sebagai anti-HPV belum ada laporannya. Untuk memperoleh Lf

perlu dilakukan dalam dua metode, yaitu kromatografi penukar ion dan

kromatografi dua dimensi (kromatografi penukar ion dan filtrasi gel). Oleh sebab

itu, penelitian ini diharapkan dapat menjawab pertanyaan mengenai metode yang

tepat untuk memurnikan Lf yang bersumber dari kolostrum kambing peranakan

etawa serta aktivitas sebagai anti-HPV yang dilakukan secara in vitro pada sel

Hela.

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan Lf dari kolostrum kambing

peranakan etawa (gLF) serta menguji aktivitasnya sebagai antivirus HPV secara in

vitro pada kultur sel HeLa.

Manfaat Penelitian

Manfaat dari penelitian ini adalah memberikan informasi kepada masyarakat

bahwa laktoferin yang terkandung pada kolostrum kambing peranakan etawa

memiliki manfaat sebagai antivirus terhadap HPV.

3

2 TINJAUAN PUSTAKA

Laktoferin

Laktoferin merupakan suatu protein dengan bobot molekul sekitar 80 kDa

dan mengandung sekitar 700 asam-asam amino yang umumnya hampir sama pada

setiap spesies penghasilnya. Laktoferin merupakan rantai polipeptida yang

sederhana yang dibagi menjadi dua lobus simetris, yaitu lobus karboksil (lobus C)

dan lobus amino (lobus N), yang sangat homolog satu dengan yang lainnya.

Kedua lobus saling terhubung oleh untaian α heliks. Domain menjadi tempat

pengikatan dengan Fe3+

masing-masing untuk setiap lobus. Domain ini disebut

N1, N2, C1, dan C2. Empat residu asam amino yang berperan sangat penting

dalam pengikatan dengan Fe3+

, yaitu histidin, asam aspartat dan dua tirosin. Selain

mengikat Fe3+

, residual asam amino ini dapat juga mengikat ion-ion lain seperti

Cu2+,

Zn2+,

Mn3+

, Al3+

, Ga3+

,Co3+

, dan logam lainnya (Stejins dan Hooijdonk,

2000; Baker dan Baker 2005; Oztas dan Ozgunes 2005; Adlerova et al. 2008,

Chaves et al. 2009). Visualisasi struktur tiga dimensi laktoferin yang diperlihatkan

seperti pada Gambar 1.

(Sumber: Baker dan Baker 2011)

Gambar 1 Struktur tiga dimensi laktoferin

Laktoferin umumnya ditemukan pada susu mamalia seperti kambing, sapi,

domba, kerbau, gajah, unta, beberapa roden lainnya dan bahkan pada manusia.

Laktoferin paling banyak ditemukan pada kolostrum tetapi pada susu dan cairan

tubuh lainnya seperti saliva, darah, air mata, cairan gastrointestinal, urin, empedu,

cairan sinovial dan plasma seminal juga ditemukan adanyaLf (Neville dan Zhang

2000; Adlerova et al. 2008; Chaves et al. 2008). Kandungan Lf berbeda untuk

setiap spesies. Laktoferin juga merupakan protein yang memiliki kelimpahan

terbanyak kedua setelah kasein (Chaves et al. 2008). Beberapa faktor yang

mempengaruhi perbedaan kandungan Lf dari berbagai spesies, yaitu umur spesies,

nutrisi pangan yang dikonsumsi dan waktu laktasi. Tabel 1 memperlihatkan

persentase perbedaan kandungan laktoferin dari berbagai spesies.

4

Tabel 1 Perbedaan kandungan laktoferin berbagai spesies

Sumber Laktoferin Kadar

Kolostrum manusia 5-7 mg/mL

Susu manusia 1-2 mg/mL

Air mata manusia 2.2 mg/mL

Susu Sapi 8.38 %

Susu Kuda 9.89 %

Air liur 7-10 μg/mL (Levay dan Viljoen, 1995; Potocnik et al. 2011)

Laktoferin mempunyai banyak aktivitas biologis seperti antibakteri terhadap

Pseudomonas aeruginosa dengan konsentrasi Lf 400 dan 700 μg/mL (Moradian et

al. 2014) dan Eschericia coli dengan konsentrasi hambat minimum (MIC) dan

konsentrasi bunuh minimum (MBC) 0.5-2.0 mg/mL (Conesa et al. 2008).

Aktivitas antitumor dan antikanker Lf dilaporkan beberapa peneliti seperti;

antitumor payudara (Yamada et al. 2007), antitumor usus (Fujita et al. 2004),

antitumor terhadap melanoma (Bezault et al. 1994, Florian et al. 2012). Tanaka et

al. (1999) melaporkan bahwa laktoferin sapi (bLF) dalam jumlah 3.6 g berpotensi

sebagai anti-HCV dan sangat efektif untuk mengobati pasien yang terinfeksi

hepatitis C dengan HCV di dalam serum rendah. van der Strate et al. (2001)

melaporkan bahwa Lf memiliki berbagai aktivitas seperti antivirus terhadap friend

virus complex (FVC), virus polio, respiratory syncytial virus (RSV), human

immunodeficiency virus (HIV), herpes simplex virus tipe 1 dan 2 (HSV-1 dan 2),

dan cytomegalovirus (CMV). Laktoferin juga dilaporkan memiliki aktivitas

antivirus terhadap adenovirus dengan konsentrasi 1 mg/mL (Pietrantoni et al.

2003). Groot et al. (2005) melaporkan bahwa bLf dengan konsentrasi 2 μM dapat

menghambat dendritic cells (DC) sehingga replikasi sel T virus HIV tipe 1.

Mistry et al. (2007) melakukan pengujian aktivitas antivirus HPV dari laktoferin

dengan konsentrasi 1.0 μM dari bLf dan hLf, pada penelitian ini diperoleh hasil

bahwa Lf memiliki aktivitas antivirus HPV tipe 5 dan tipe 16. Chien et al. (2008)

menguji Lf dengan konsentrasi 200 μg/mL dapat menghambat replikasi RNA

pada Japanese encephalitis virus (JEV). El-Fakharany et al. (2012 dan 2013)

melakukan penelitian aktivitas laktoferin pada virus hepatitis C yang memberikan

hasil bahwa laktoferin yang berasal dari susu manusia, unta, sapi dan domba

memiliki aktivitas sebagai antivirus terhadap virus hepatitis C. Laktoferin

rekombinan (rpLF) juga dilaporkan dapat menghambat infeksi yang disebabkan

oleh enterovirus tipe 71 (Chen et al. 2008) dan Lf manusia rekombinan (rphLf)

dapat menurunkan respon sitokin pro-inflamasi dalam metode in vitro inflamasi

serta menghambat proliferasi sel dan progresi dengan metode in vitro melanoma

metastatik atau tumor kulit (Florin et al. 2012).

Laktoferin juga memiliki aktivitas anti-jamur terhadap Candida albicans

(Takakura et al. 2004; Lupetti et al. 2007; Kobayashi et al. 2011). Manzoni et al.

(2012) melaporkan bahwa bLf memiliki aktivitas terhadap beberapa spesies

Candida diantaranya C albicans, C parapsilosis, C glabrata dan C guillermondii.

Selain bersifat antimikroba, antikanker dan antivirus Lf juga dapat bersifat sebagai

anti-parasit Toxoplasma gondii yang pertumbuhannya dapat dihambat oleh hLf

5

dengan konsentrasi ≥100 μg/mL (Dzitko et al. 2007). Ordaz-Pichardo et al.(2013)

dalam ulasannya menyatakan bahwa Lf dapat bersifat sebagai anti-parasit

terhadap Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Plasmodium falciparum,

Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi, Babesia caballi, Eimeria steidai,

Pneumocystis carinii dan Microsporidia.

Pemurnian Laktoferin

Pemurnian Lf dapat dilakukan dengan menggunakan beberapa metode

diantaranya adalah dengan menggunakan kromatografi penukar ion, kromatografi

filtrasi gel, kromatografi afinitas dan kromatografi dua dimensi yang

menggabungkan dua metode kromatografi. Prinsip umum dari kromatografi

penukar ion adalah pertukaran antara gugus fungsi yang memiliki muatan

berlawanan dari muatan biomolekul yang akan dipisahkan (Harvey 2000; Manz et

al. 2004; Miekkelsen dan Corton 2004; Sivasankar 2014). Fase diam merupakan

resin yang umumnya dekstran, agarosa selulosa dan akrilamida yang diimobilisasi

dengan gugus bermuatan, sedangkan fase geraknya adalah larutan garam dengan

peningkatan kekutan ion yang berfungsi untuk mengurangi interaksi biomolekul

yang terikat pada resin (Miekkelsen dan Corton 2004). Muatan resin berlawanan

dengan muatan pada biomolekul yang akan dipisahkan, jika biomolekul

bermuatan positif maka resin yang akan digunakan memiliki muatan negatif

(penukar kation) dan biomolekul bermuatan negatif maka resin yang digunakan

harus bermuatan positif (penukar anion) (Manz et al. 2004). Kromatografi

penukar ion dibagi menjadi empat tipe, yaitu, penukar kation keras, penukar

kation lemah, penukar anion kuat dan penukar anion lemah. Tipe ini berdasarkan

muatan dan kapasitas penukar ion pada pH fase gerak yang digunakan (Manz et al.

2004; Sivasankar 2014). Jenis, tipe resin dan gugus penukar ion ditampilkan pada

Tabel 2.

Tabel 2 Jenis resin dan gugus penukar ion

Tipe Klasifikasi Nama Gugus Fungsi

Kation Kuat Sulfopropil (SP) -OCH2CH2CH2SO3-

Lemah Karboksimetil (CM) -OCH2COO-

Anion Kuat Trietilaminoetil (TEAE) -OCH2CH2N+(C2H5)3

Intermediet Dietilaminoetil (DEAE) -OCH2CH2N(C2H5)2

Lemah p-Aminobenzil (PAB) -OCH2(C6H4)NH2 (Miekkelsen dan Corton 2004; Sivasankar 2014)

Beberapa penelitain melakukan pemurnian Lf metode kromatografi penukar

ion menggunakan beberapa jenis resin antara lain resin S-Sepharose dengan

larutan dapar fosfat pH 7.0 konsentrasi NaCl 0.5 M (Hoek et al. 1997), resin SP-

Sepharose dengan fase gerak NaCl 1 M dalam larutan dapar fosfat pH 7.4 dan laju

alir 3 mL/menit (Conesa et al. 2008), resin penukar kation keras Fastline SP

dengan tingkat kemurnian 88.5% (Du et al. 2013). Abdel-Salam et al. (2014) dan

Moradian et al. (2014) melakukan isolasi dan pemurnian Lf dari kolostrum sapi

dengan menggunakan metode kromatografi penukar kation dengan resin penukar

kation yang digunakan, yaitu karboksimetil Sephadex C-50. Resin penukar kation

CM Sephadex C-50 memiliki kemampuan untuk memisahkan protein dengan

rentang bobot molekul 4-100 kDa (Sivasankar 2014). Resin ini cocok digunakan

6

untuk memurnikan Lf yang memiliki muatan positif dan bobot molekul sekitar 80

kDa, bobot molekul Lf berada pada rentang bobot molekul resin ini.

Metode kromatografi filtrasi gel juga umum digunakan dalam pemisahan

dan pemurnian Lf. Metode kromatografi filtrasi gel memiliki nama lain, yaitu

kromatografi ukuran molekul dan kromatografi permeasi gel. Prinsip umum

pemisahan dengan metode kromatografi filtrasi gel ini adalah kemampuan

biomolekul untuk tereksklusi dari gel. Biomolekul yang memiliki ukuran kecil

kan tertahan pada gel dan biomolekul yang memiliki ukuran besar akan

tereksklusi pertama (Miekkelsen dan Corton 2004). Matriks penyusun gel pada

kromatografi filtrasi gel umumnya adalah taut-silang dextran, agarosa, dan

poliakrilamida. Derajat taut silang merupakan faktor penting pada batas rentang

ukuran molekul hasil fraksinasi (Sivasankar 2014). Kemampuan resin dalam

memisahkan biomolekul berdasarkan ukuran dan bobot molekulnya diperlihatkan

pada Tabel 3.

Tabel 3 Jenis gel untuk pemurnian biomolekul pada kromatografi filtrasi gel

Jenis gel Rentang bobot molekul (Dalton)

Sephadex G-10 700

Sephadex G-15 1500

Sephadex G-25 1000-5000

Sephadex G-50 1500-3000

Sephadex G-75 3000-80 000

Sephadex G-100 4000-150 000

Sephadex G-200 5000-600 000

Sepharose 2B 70 000-40 000 000

Sepharose 4B 60 000- 20 000 000

Sepharose 6B 10 000-4 000 000

Sephacryl S-100 1000- 75 000

Sephacryl S-200 3000- 160 000

Sephacryl S-300 5000- 1 000 000

Bio-Gel P-100 5000-1 000 000

Bio-Gel P-150 15 000-150 000

Bio-Gel P-200 30 000- 200 000 (Miekkelsen dan Corton 2004; Sivasankar 2014)

El-Hatmi et al. (2006) melakukan pemurnian dengan metode kromatografi

filtrasi gel menggunakan kolom Sephadex G-100 di dalam larutan dapar Tris-HCl

0.02 M dengan pH 8.6. Pemurnian Lf dapat juga dilakukan dengan metode

kromatografi dua dimensi. Wu dan Xu (2009) yang melakukan kromatografi

penukar kation dengan menggunakan resin CM Sepharose dan dilanjutkan dengan

kromatografi penukar anion dengan menggunakan resin DEAE Sepharose

memperoleh tingkat kemurnian Lf 95.0%, El-Fakharany et al. (2013) melakukan

kromatografi penukar ion memakai resin Mono S 5/50 dan kromatografi filtrasi

gel dengan fase diam resin Superdex 200 5/150.

Metode lain yang dapat digunakan untuk pemurnian Lf adalah kromatografi

afinitas. Hodgkinson et al. (2008) melakukan pemurnian Lf dengan metode

kromatografi afinitas memakai resin Heparin Sepharose 6 Fast Flow yang dielusi

pada larutan dapar sodium fosfat 0.01 M dengan pH 7.4, laju alir 120 mL/jam dan

gradien bertingkat NaCl 0.7-0.9 M . Le Parc et al. (2014) melakukan pemurnian

7

Lf yang berasal dari susu kambing dengan menggunakan metode kromatografi

afinitas memakai resin heparin Sepharose. Nam et al. (1999) melakukan

pemurnian dan karakterisasi Lf yang berasal dari kambing asli korea dengan

menggabungkan metode kromatografi penukar ion dan kromatografi afinitas

menggunakan resin CM-Toyopearl 650 dan AF-Heparin Toyoperal 650M. Dari

hasil penelitian ini diperoleh bahwa bobot molekul Lf yang diisolasi dari kambing

asli Korea adalah 82 kDa.

3 METODE

Waktu dan Tempat penelitian

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Juli 2014 sampai Juni 2015 di Pusat

Studi Satwa Primata, Lembaga Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat

Institut Pertanian Bogor (PSSP LPPM-IPB).

Bahan

Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah kolostrum kambing

peranakan etawa yang dikoleksi 2-4 hari setelah melahirkan dan sumber

kolostrum diambil dari peternakan komersil di daerah Cibinong Bogor. Bahan

untuk kultur sel adalah sel HeLa (American Type Culture Collection CCl2-HPV).

Bahan media kultur sel yang digunakan antara lain media Dulbecco’s Modified

Eagle Medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), larutan dapar fosfat pH 7.4,

tripsin. Bahan lain yang digunakan, yaitu resin CM Sephadex C-50, resin

Sephadex G-75, HCl 3N, NaOH 3N, NaCl, Kaleidoscop Standard Molecular

Weight (Biorad), kit bicinchoninic acid (BCA) protein assay (Pierce, USA),

pewarna Coomassie blue, pewarna Evans blue, reagen Bradford, bovine serum

albumin (BSA), polietilenglikol (PEG), membran dialisis (MWCO 12-14000),

QiaAmp Blood deoxyribonucleic acid (DNA) mini kit (Qiagen), primer

MY09/MY11, SSofast Evagreen master mix.

Alat

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah kolom kromatografi dengan

diameter 9 mm, inkubator CO2 (Binder, Tuttlingen, DE), bench-top centrifuge

(Flexplin, Tokyo, JP), micro centrifuge (Thermo Scientific, Osterode, DE),

enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Reader (Biorad, Palo Alto, US),

safety cabinet (NuAire, Minnesota, US) iQ5 Real Time Polymerase Chain

Reaction (PCR) (BioRad, Palo Alto, US) dan peralatan kaca lainnya yang umum

digunakan.

8

Prosedur Kerja

Isolasi dan Pemurnian Laktoferin (Modifikasi Moradian et al. 2014)

Kolostrum kambing peranakan etawa diambil sebanyak 30 mL, disentrifugasi

selama 20 menit dengan kecepatan 10000 xG pada suhu 4 °C sehingga menjadi

susu skim. Kasein dihilangkan dari susu skim ini dengan cara menambahkan HCl

3N diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 °C. pH dinetralkan sampai 6.8

dengan cara menambahkan NaOH 3N. Sisa protein diendapkan dengan

menggunakan (NH4)2SO4 48 %, selanjutnya dilakukan pemisahan dengan

sentrifugasi pada kecepatan 10000 xG selama 30 menit dengan suhu 4 °C

(modifikasi pada suhu inkubasi, konsentrasi HCL dan NaOH, pemekatan protein

dan pemisahan dengan kromatagrfi dua dimensi). Protein dipekatkan dengan

menggunakan membran dialisis yang dibenamkan dalam PEG. Laktoferin akan

dimurnikan dengan menggunakan kromatografi 2 metode, yaitu kromatografi

penukar ion yang menggunakan resin CM Sephadex C-50 dan kromatografi

filtrasi gel menggunakan resin Sephadex G-75. Untuk tahapan pada kromatografi

penukar ion dilakukan elusi gradien dilakukan secara stepwise dengan

menggunakan larutan NaCl 0-0.5 N yang dilarutkan dalam PBS pH 7.4 dengan

panjang kolom 15-17 cm dan lebar 9 mm, laju alir 1 mL/menit. Fraksi yang

terbaik pemisahan protein dengan kromatografi ion dilanjutkan untuk pemisahan

dengan kromatografi filtrasi gel. Elusi pada kromatografi filtrasi gel ini

menggunakan PBS sebagai fase gerak dengan panjang kolom 15-17 cm dan lebar

9 mm. Selanjutnya fraksi protein dikumpulkan sebanyak 10-15 mL lalu

dipekatkan dengan menggunakan membran dialisis dan akan dianalisis

pemisahannya dengan elektroforesis SDS-PAGE.

Elektroforesis SDS-PAGE

Fraksi protein yang telah diperoleh dari proses pemurnian dianalisis dengan elektroforesis SDS-PAGE. Sebanyak 15 μL sampel Lf ditambahkan dengan 15 μL

sampel larutan dapar kemudian dipanaskan pada suhu 100 oC di atas penangas air

selama 2 menit. Elektroforesis dilakukan pada tegangan 125 Volt selama 1 jam.

Sebagai penanda berat molekul protein digunakan Kaleidoscop Standard

Molecular Weight (Biorad). Gel hasil elektroforesis diwarnai (staining)

menggunakan coomassie blue untuk mendapatkan kisaran berat molekul gLf dan

sebagai pembanding digunakan bLf komersil.

Penentuan Total Protein

Penghitungan total protein gLF dilakukan dengan menggunakan kit BCA

protein assay (Pierce, USA) yang mengandung reagen A dan reagen B. Larutan

reagen A merupakan larutan yang mengandung reagen BCA dan reagen B

merupakan larutan CuSO4. Reagen A dicampur dengan reagen B dengan

perbandingan 50:1 sehingga didapatkan Working Reagent (WR). Masing-masing 10 μL standar protein dengan konsentrasi 0, 250, 500, 750, 1000, dan 1500 μg/mL

dan gLF dipipet ke sumur plat ELISA. Sebanyak 200 μL WR ditambahkan pada

semua sumur yang berisi standar protein dan sampel gLF, selanjutnyadiinkubasi

selama 30 menit pada suhu 37 °C. Pembacaan densitas optik dilakukan

9

menggunakan ELISA Reader (Biorad) pada panjang gelombang 595 nm. Kurva

standar dari protein dapat digunakan untuk menentukan besarnya konsentrasi total

protein gLF pada kolostrum susu kambing peranakan etawa.

Kultur Sel HeLa

Sel HeLa yang ditumbuhkan dalam media penumbuh DMEM yang

mengandung FBS 10% dan antibiotik (penisilin dan streptomisin). Sel

ditumbuhkan dalam plat kultur 48 sumur dengan konsentrasi sel 105 untuk setiap

sumurnya. Sel diinkubasi selama 24 jam, ditambahkan gLF kambing peranakan

etawa dan pembandingnya bLf dengan variasi konsentrasi 50, 100, dan 200

μg/mL serta kontrol negatif yang merupakan sel HeLa tanpa sampel. Pellet dari

masing-masing sumur dan kontrol negatif dipanen dalam rentang waktu 24, 48,

dan 72 jam setelah diinkubasi dengan sampel. Pellet dibilas dengan PBS steril dan ditambahkan 200 μL PBS steril, kemudian disimpan dalam lemari pendingin.

Ekspresi Gen dengan Teknik Real Time PCR

Pellet dari masing-masing sampel tersebut selanjutnya dilakukan ekstraksi

DNA nya menggunakan QiaAmp Blood DNA mini kit (Qiagen). DNA masing-

masing sampel selanjutnya diamplifikasi dengan teknik real time PCR (iQ5 Real

Time PCR, BioRad), primer yang digunakan, yaitu MY09 dan MY1. Pola

penghambatan replikasi DNA virus HPV menggunakan EvaGreen (BioRad).

Analisis yang dilakukan bersifat kuantitatif relatif dengan melihat pola

penghambatan replikasi berdasarkan pergeseran nilai Ct (cycle threshold) pada

sampel dan dibandingkan dengan kontrol negatif. Analisis data dilakukan

menggunakan iQ5 optical system software (BioRad). Analisis secara kualitatif

menggunakan teknik PCR konvensional untuk mendeskripsikan penghambatan

berdasarkan ketebalan pita yang dihasilkan.

4 HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi dan Pemurnian Laktoferin

Profil pemurnian protein yang telah diisolasi ditampilkan pada SDS-PAGE.

Dari 100 mL kolostrum kambing peranakan etawa hanya menghasilkan sekitar

1% Lf murni. Fraksi protein yang dipisahkan dengan menggunakan kromatografi

penukar ion dengan gradien elusi NaCl 0-1.5 N ditunjukkan pada Gambar 2. Hasil

SDS-PAGE memeperlihatkan bahwa pita yang sejajar dengan standar bLf dan

penanda protein yang bobotnya 86 kDa adalah Lf dan semakin tinggi konsentrasi

NaCl yang digunakan pita Lf terlihat semakin tebal. Hal ini mengindikasikan

bahwa pada Lf sudah terlepas dari resin CM Sephadex C-50. Hasil penelitian ini

berbeda dengan Moradian et al. (2014) yang berhasil memurnikan Lf yang berasal

dari kolostrum sapi hanya dengan satu tahapan kromatografi menggunakan resin

CM Sephadex C-50, monitoring dengan alat UV sehingga memudahkan dalam

proses pemurnian. Pada penelitian ini dilakukan pemurnian dengan manual dan

sulit untuk menentukan kemurnian Lf tanpa bantuan visualisasi.

10

Gambar 2 Elektroforegram gradien konsentrasi NaCl (M: penanda berat molekul,

0.0-0.5: konsentrasi NaCl untuk elusi, bLf: laktoferin sapi komersil)

Pemurnian Lf dilakukan dengan menggunakan resin penukar kation CM

sephadex-C50 dengan gradien elusi 0.5 N NaCl dan hasil SDS-PAGE ditunjukkan

pada Gambar 3. Fraksi 1 hingga fraksi ke 7 memperlihatkan bahwa Lf tertahan

pada fraksi kedua sampai fraksi kelima. Pemurnian dengan satu tahapan

kromatografi menggunakan metode kromatografi ion belum berhasil untuk

memurnikan Lf, hanya mampu memisahkan Lf dengan protein lainnya. Untuk

memaksimalkan kemurnian Lf maka dilakukan kromatografi dua dimensi, yaitu

kromatografi penukaran ion dengan menggunakan resin CM Sephadex-C50 lalu

dilanjutkan dengan kromatografi filtrasi gel dengan resin Sephadex-G75.

Gambar 3 Elektroforegram fraksi 1-7 elusi 0.5 N NaCl

11

Pemisahan protein yang dilakukan dengan dua tahapan kromatografi

memperlihatkan bahwa pemisahan lebih baik jika dibandingkan dengan

pemisahan Lf dari protein lainnya jika hanya menggunakan kromatografi penukar

ion saja. Hasil SDS-PAGE pada Gambar 4 memperlihatkan fraksi 1 terlihat

adanya pita tunggal yang sejajar dengan standar bLf tetapi pita ini tipis, diduga

konsentrasi Lf pada fraksi ini sangat kecil. Fraksi 3 hingga fraksi 7

memperlihatkan adanya pita protein yang sejajar dengan pita bLf yang diduga

adalah Lf yang lebih konsentrat jika dibandingkan dengan pita Lf pada fraksi 1

hanya saja pada fraksi 3-7 terdapat protein-protein lain yang juga tereksklusi.

Gambar 4 Ektroforegram hasil kromatografi dua tahapan fraksi1-7

Gambar 5 memperlihatkan kemurnian yang diperoleh dari pemisahan Lf

dengan protein lainnya menggunakan metode kromatografi 2 tahapan. Pita yang

dihasilkan sejajar dengan standar bLf yang digunakan. Pita gLf yang dihasilkan

dari SDS-PAGE ini juga sejajar dengan penanda standar protein yaitu BSA

(bovine serum albumin) yang memiliki bobot molekul 82 kDa. Dari hasil SDS-

PAGE ini dapat dinyatakan bahwa Lf yang dihasilkan dari proses isolasi dan

pemurnian ini memiliki bobot sekitar 80 kDa. Pemurnian Lf dengan dua dimensi

kromatografi ini mendapatkan hasil yang lebih baik dari pemisahan jika hanya

menggunakan kromatografi penukar ion saja. Keuntungan dari kromatografi dua

dimensi ini adalah pemisahannya yang lebih selektif, kromatografi penukar ion

dengan resin CM Sephadex C-50 mampu memisahkan protein berdasarkan

muatan dan kromatografi filtrasi gel menggunakan Sephadex G-75 yang dapat

memisahkan protein dengan bobot molekul sampai 80 kDa. Laktoferin memiliki

bobot molekul yang berkisaran 80 kDa seecara teoritis akan tereksklusi pertama

dari resin dibandingkan dengan protein yang bobot molekulnya lebih kecil. Bobot

molekul Lf murni yang dihasilkan dari proses isolasi dua tahapan ini adalah 82

kDa dan konsentrasi Lf yang ditentukan dengan metode BCA assay adalah 379

μg/mL.

12

Gambar 5 Elektroforegram purifikasi gLf dengan 2 tahapan kromatografi (M:

penanda bobot molekul protein standar (rentang rendah), bLf:

laktoferin sapi dan gLf: laktoferin kambing)

Conesa et al. (2008) memurnikan Lf dari berbagai spesies, yaitu, manusia,

domba, kambing, unta, gajah dan anjing laut abu-abu. El-Fakharani et al. (2013)

juga memurnikan Lf dari manusia, unta, sapi dan domba, dari penelitian ini

dihasilkan pita bobot molekul Lf yang hampir sejajar satu dengan yang lainnya

pada elektroforesis SDS-PAGE.Hal ini mengindikasikan bahwa Lf dari berbagai

spesies memiliki bobot molekul yang hampir sama atau sekitar 80 kDa.

Profil Inhibisi Laktoferin terhadap DNA HPV

Laktoferin memiliki kemampuan untuk mengikat DNA ataupun RNA dari

suatu virus tertentu. Kemampuan Lf untuk bertindak sebagai antivirus

dikarenakan adanya suatu reseptor umum dan reseptor yang spesifik pada

permukaan sel target sebagai tempat menempelnya virus untuk masuk ke dalam

sel inang. Reseptor ini khas untuk setiap jenis sel misalnya pada mukosa sel epitel,

hepatosit, monosit, makrofag, leukosit polimorfonuklear, limfosit, trombosit, dan

fibroblast. Mekanisme yang paling utama bertindak sebagai pertahanan bagi agen

antivirus adalah pengikatan dan pemblokan pada reseptor glikosaminoglikan virus

terutama pada heparan sulfat . Dengan cara ini, Lf mencegah virus memasuki sel

dan infeksi dapat dicegah pada tahapan awal (Pellegrini dan Engels 2005;

Adlerova et al. 2008; Berlutti et al. 2011; El-Loly dan Mahfous, 2011 ).

Kemampuan Lf untuk berinteraksi dengan reseptor pada virus diperlihatkan

melalui Gambar 6.

13

(Sumber: Chaves et al. 2009)

Gambar 6 Mekanisme aktivitas antivirus laktoferin

Aktivitas gLf sebagai anti-HPV secara in vitro terhadap sel HeLa

memperlihatkan adanya hambatan replikasi DNA virus HPV. Hambatan replikasi

DNA virus HPV ini ditandai dengan adanya peningkatan nilai Ct (cycle threshold)

dari sel HeLa yang diinkubasi dengan gLf. Nilai Ct ditampilkan pada Tabel 4.

Tabel 4 Nilai Ct dan persen hambat gLf dan bLf terhadap virus HPV dari pellet

sel lestari HeLa

Nilai Ct Selisih nilai Ct (%)

Hari

ke-

Kontrol

negatif

gLf

[100 μg/mL]

bLf

[100 μg/mL] gLf bLf

1 32.97 32.09 32.49 -2.67 -1.46

2 27 31.94 28.49 18.30 5.52

3 28 36.73 31.37 31.18 12.04

Nilai Ct mengindikasikan jumlah siklus yang dibutuhkan oleh DNA untuk

terdeteksi pada detektor instrumen real time PCR. Nilai Ct ini akan berbanding

terbalik dengan konsentrasi DNA virus. Dari hasil uji aktivitas terhadap sel HeLa

terdapat peningkatan nilai Ct setelah diinkubasi dengan Lf. Inkubasi setelah 24

jam belum terjadi penghambatan replikasi DNA virus, hal ini bisa disebabkan Lf

belum terikat pada DNA virus HPV. Pada hari kedua dan hari ketiga terjadi

peningkatan nilai Ct yang mengindikasikan terjadinya penghambatan replikasi

DNA HPV. Penghambatan replikasi DNA HPV tertinggi terjadi pada hari ketiga

setelah inkubasi pada gLf 100 μg/mL dengan selisih nilai Ct dari kontrol negatif

sebesar 31.18 %. Nilai Ct yang dihasilkan dari inkubasi dengan gLf lebih besar

dibandingkan inkubasi dengan bLf. Dari hasil perbedaan nilai Ct sel HeLa yang di

tambah Lf pada sel HeLa yang tidak ditambahkan Lf mengindikasikan bahwa Lf

dapat menghambat replikasi DNA HPV atau dapat dinyatakan bahwa Lf memiliki

aktivitas antivirus terhadap HPV.

laktoferin

n heparan sulfat

reseptor spesifik

virus

virus

14

5 SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Laktoferin diperoleh dengan menggunakan metode pemurnian kromatografi

dua dimensi penukar ion (karboksimetil Sephadex C-50) dan filtrasi gel

(Sephadex G-75). Konsentrasi gLf yang diperoleh, yaitu 379 μg/mL dengan bobot

molekul 82 kDa. Laktoferin memiliki kemampuan penghambatan replikasi DNA

virus HPV dengan konsentrasi gLf 100 μg/mL setelah tiga hari inkubasi dalam sel

HeLa.

Saran

Karakterisasi Lf perlu dilakukan untuk mengetahui urutan nukleotidanya

dan dibandingkan dengan urutan nukleotida hLf dan bLf yang telah diteliti

sebelumnya .

DAFTAR PUSTAKA

Abdel-Salam A, Alhabri KB, Magzoub MA, Mousa HM. 2014. Effect of heat

treatment on the chromatographic detection, electrophoretic pattern and

antimocrobial activity purified from camel milk. J Food Agri Environ. 12(2).

20-23.

Adam S, Zitka O, Dolezal P, Zeman L, Horma A, Hubalek J, Sileny J, Krizkova S,

Trnkova L, Kizek R. 2008. Lactoferrin isolation using monolithic column

coupled with spectrometric or micro-amperometric detector. Sensors 8: 464-

487.

Adlerova L, Bartoskova A, Faldyna M. 2008. Lactoferrin : A review. Vet Med.

53(9): 457-468.

Baker EN, Baker HM. 2005. Molecular structure, binding properties and dynamic

of lactoferrin. Cell Mol Life Sci. 62. 2531-2539. doi:10.1007/s00018-005-

5368-09.

Berlutti F, Pantanella F, Natalizi T, Frioni A, Paesano R, Polimeni A, Valenti P.

2011. Antiviral properties of lactoferrin-a natural immunity molecule.

Molecules 16: 6992-7018. doi:10.3390/molecules16086992.

Bezault J, Bhimani R, Wiprovnick J, Furmanski P. 1994. Human lactoferrin

inhibits growth of solid tumors and development of experimental metastates

in mice. Cancer Res. 54: 2310-2312

Campanella L, Martini E, Pintore M, Tomassetti M. 2009. Determination of

lactoferrin and immunoglobulin G in animal milk by New Immunosensors.

Sensors 9: 2202-2221. doi:10.3390/s90302202.

Chaves SAG, Gallegos SA, Cruz QR. 2009. Lactoferrin: structure, function and

application. Int J Antimicrob Agents. 33:301Le1-301Le8.

doi:10.1016/j.ijantimicag.2008.07.020.

15

Chen HL, Wang LC, Chang CH, Yen CC, Cheng WTK, Wu SC, Hung CM, Kuo

MF, Chen CM. 2008. Recombinant porcine lactoferrin express in the milk

of transgenic mice protect neonatal mice from a lethal challange with

enterovirus type 71. Vaccine 26: 891-898.

doi:10.1016/j.vaccine.2007.12.013.

Chien YJ, Chen WJ, Hsu WL, Chiou SS. 2008. Bovine lactoferrin inhibits

Japanese enchephalitis virus by binding to heparan sulfate and receptor for

low density lipoprotein. Virol. 379: 143-151.

doi:10.1016/j.virol.2008.06.017.

Conesa C, Sanchez, l, Rota C, Perez MD, Calvo M, Farnaud S, Evans RW. 2008.

Isolation of lactoferrin from milk different species: calorimetric and

antimicrobial studies. Comp Biochem Physiol. Part B 150: 131-139.

doi:10.1016/j.cbpb.2008.02.005.

Davoodi H, Esmaeili S, Mortazavian AM. 2013. Effect of milk and milk products

consumption on cancer: a review. Comp Rev Food Sci Food Safety. 12: 249-

264. doi:10.1111/1541-4337.12011.

Drackova M, Borkovcova I, janstova B, Naiserova M, Pridalova H, Navratilova P,

Vorlova L. 2009. Determination of lactoferrin in goat milk by HPLC

method. Czech J Food Sci. 27: S102- S104.

Du QY, Lin DQ, Xiong ZS, Yao SJ. 2013. One step purification of lactoferrin

from rude sweet whey using cation-exchange expanded bed adsorption. Ind.

Eng Chem. Res.52:2693-2699. dx.doi.org/10.1021/ie302606z.

Dzitko K, Dziadek B, Dziadek J, Dlugonska. 2007. Toxoplasma gondii: Inhibition

of the intracellular growth by human lactoferrin. Polish J Microbiol. 56(1):

25-32.

Ebringer L, Ferencik M, Krajovic J. 2008. Beneficial health effect of milk and

fermented dairy products-Review. Folia Microbiol. 53 (5): 378-394.

Elagamy EI, Ruppanner R, Ismail A, Champagne CP, Asaaf R. 1994. Purification

and characterization of lactoferrin, lactoperoxidase, lysozym and

immunoglobulins from Camel’s milk. Int Dairy J. 6:129-145.

El-Fakharany EM, Abedelbaky N, Haroun BM, San hez L, Redwan NA, Redwan

EM. 2012. Anti-infectivity of camel polyclonal antibodies againts hepatitis

C virus in Huh dan.5 hepatoma. J Virol. 9 (201): 1-9.

El-Fakharany, Sanchez L, Al-Mehdar HA, Redwan EM. 2013. Effectiveness of

human, camel, bovine and sheep lactoferrin on the hepatitis C virus cellular

infectivity: comparasion study. J Virol. 10(199): 1-10.

El-Hatmi H, Levieux A, Levieux D. Camel (Camelus dromedarius) immunoglobulin G, α-lactabumin, serum albumin and lactoferrin in

colostrum and milk during early post partum period. 2006. J Dairy Res. 73:

288-293. doi:10.1017/S0022029906001713.

El-Loly MM, Mahfouz MB. 2011. Lactoferrin in relation to biological functions

and applications: a review. Int J Dairy Sci. 6(2): 79-111.

doi:10.3923/ijdss.2011.79.111.

Florin PE, Moisei M, Trif M, Evans, RW, Roseanu A. 2012. Anti-inflamatory and

anti-tumor activity of human recombinant lactoferrin. Rom J Biochem.

49(2): 163-171.

16

Fujita K, Matsuda E, Sekine K, Iigo m, Tsuda H. 2004. Lactoferrin enhances fas

expression and apoptosis in the colon mucosa of azoxymethane-trated rats.

Carcin. 25(10): 1961-1966. doi:10.1093/carcin/bgh205.

Groot F, Geijtenbeek TBH, Sanders RW, Baldwin CE, Sanches-Hernandez M,

Floris R, van Kooyk Y, de Jong EC, Barkhout B. 2005. Lactoferrin prevents

Dendritic Cell-mediated human immunodeficiency virus type 1 transmission

by blocking the DC_SIGN-gp120 interaction. J Virol. 79(5): 3009-3015.

doi:10.1128/jvi.79.5.3009-3015.2005.

Harvey D. 2000. Modern Analytical Chemistry. Boston (US): McGraw-Hill

Higher Education.

Hodgikson AJ, Ross KM, Fahey SN, Prosser CG. 2008. Quantification of

lactoferrin in milk from New Zealand diary goats. Proceedings of the New

Zealand Society of Animal Production. 68 :166-169.

Hoek KS, Milne JM, Grieve PA, Dionysius DA, Smith R. 1997. Antibacterial

activity of bovine lactoferrin-derivated peptides. Antimicrob Agents Chemo.

41(1): 54-59.

Indyk HE, Filonzi EL. 2004. Determination of lactoferrin in bovine milk,

colostrum and infant formulas by optical biosensor analysis. Int Dairy J.

15:429-438.

Kobayashi T, Kakeya H, Miyazaki T, Izumakiwa K, Yanagahira K, Ohno H,

Yamamoto Y, Tashiro T, Kohno S. 2011. Synergistic antifungal effect of

lactoferrin with azole antifungals againts Candida albicans for invasive

candidiasis. Jpn J Infect. Dis. 64: 292-296.

Le Parc A, Dallas DC, Duant S, Leonil J, Martin P, Barile D. 2014.

Characterization of goat milk lactoferrin N-glycans and comparison with the

N-glycomes of human and bovine milk. Electrophoresis. 35(11): 1560-1570.

doi: 10.1002/elps.201300619.

Levay PF, Viljoen M. 1995. Lactoferrin: a general review. Haematologica. 80:

252-267.

Lupetti, A, Brouwer CPJM, Bogaards SJP, Welling MM, de Heer E, Campa M,

van Dissel JT, Friesen RHE, Nibbering PH. 2007. Human lactoferrin-

derived peptide’s antifungal activitiess againts disseminated Candida

albicans infections. J Infection Dis. 196: 1416-1424. doi:10.1066/522427.

Manz A, Pamme N, Iossifids D. 2004. Bioanalytical Chemistry. London (UK):

Imepirial College Press.

Manzoni P, Stolfi I, Messner H, Cattani S, Laforgia N, Romeo MG, Bollani L,

Rinaldi M, Gallo E,Quercia M, Milena M, Mostert M, Decembrino L et al.

2012. Bovine lactoferrin prevents invasive fungal infections in very low

birth weight infants: a randomized controlled trial. Pediatricis. 129 (1): 116-

123.

Mikkelsen SR, Corton E. 2004. Bioanalytical Chemistry. Hoboken (US): John

Wiley & Sons, Inc.

Mistry N, Drobni P, Naslund J, Sunkari VG, Jenssen H, Evander M. 2007. The

anti-papillomavirus activity of human and bovine lactoferrin. Antivir Res.

75: 258-265. doi:10.1016/j.antiviral.2007.03.012.

Moradian F. Sharbafi R, Rafiei A. 2014. Lactoferrin, isolation, purification and

antimicrobial effect. J Med Bioengine. 3 (3): 1-4.

17

Nam MS, Shimazaki K, kumara H, Lee KK, Yu DY. Characterization of Korean

native goat lactoferrin. Comparative Biochem. Physio. Part B. 123: 201-

208.

Neville MC, Zhang P. 2000. Lactoferrin secretion into milk: Comparison between

ruminant, murine and human milk. J Anim Sci.78: 26-35.

Oztas YE, Ozgunes N. 2005. Lactoferrin: a multifunctional proteins. Int J Mol

Biol Biochem. Gene Technol. 1(4): 149-154.

Ordaz-Pichardo C, Leon-Sicairos N, Canizalez-roman A, Cornrjo-Cortez MA,

Ortiz-Estrada G, de la Garza M. 2013. Lactoferrin: a protein of the innate

immune system capable of killing parasitic protozoa. Erzinger GS, Editor.

Mexico: Nova Science Publishers Inc. ISBN:978-1-62257-692-0.

Pellegrini A, Engels M. 2005. Antiviral compounds derived from naturally

occurring proteins. Curr Med Chem. 4: 55-66.

Pietrantoni A, Biase AMD, Tinari A, Marchetti M, Valenti P, Seganti l, Superti F.

2003. Bovine lactoferrin inhibits adenovirus infectio by interacting with

viral structural polypeptides. Antimicrob Agents Chemo. 47(8): 2688-2691.

doi:10.1128/aac.47.8.2688-2691.2003.

Potocnik K, Ganter V, Kuterovac K, Cividini A. 2011. Mare’s milk: composition

and protein fraction in comparison with different milk species. Mljekarstvo.

61 (2): 107-113.

Sivasankar B. 2014. Bioseparation Principles and Techniques. Delhi (IN): PHI

Learning Private Limited.

Steijns JM, van Hooijdonk ACM. 2000. Occurence, structure, biochemical

properties and technological characteristics of lactoferrin. Brit J Nut. 84

(suppl.1): S11-S17.

Takakura N, Wakabayashi H, Ishibashi H, Yamamuchi k, Teraguchi S, Tamura Y,

Yamaguchi H, Abe S. 2004. Effect of orally administrated bovine lactoferri

on the immune response in the oral candidiasis murine model. J Med

Microbiol. 54: 495-500. doi:10.1099/jmm.0.05505-0.

Tanaka K, Ikeda M, Nozaki A, Kato N, Tsuda H, Saito S, Sekihara H. 1999.

Lactoferrin inhibits Hepatitis C Virus viremia in patiens with chronic

hepatitis C: a pilot study. Jpn J Cancer Res. 90: 367-371.

Van der Strate BWA, Beljaars L, Molema G, Harmsen MC, Meijer DKF. 2001.

Antiviral activities of Lactoferrin. Antivir Res. 52: 225-239.

[WHO] World Health Organition. 2013. Comperehensive cervical cancer

prevention and control: a helthier future for girls and women. WHO

Guidance Note: 2-12.

Wu M, Xu Y. 2009. Isolation and purification of lactoferrrin and immunoglobulin

G from bovine colostrum with serial cation-anion exchange chromatography.

Biotech Biopro. Eng. 144:155-160.doi:10.1007/s12257-008-0159-4.

Wu M, Wang X, Zhang Z, Wang R. 2011. Isolation and purification of bioactive

proteins from bovine colostrum. Progress in Molecular and Enviromental

bioengineering - From Analysis and Modeling to Technology Application.

ISBN 987-953-307-268-5: 347-367.

Wu WZ, Wang XQ, Wu GY, Kim SW, Chen F, Wang JJ. 2010. Differential

composition of proteonomes in sow colostrum and milk from anterior and

posterior mammary glands. J Anim Sci. 88: 2657-2664.

doi:10.2527/jas.2010-2972.

18

Yamada Y, Sato R, Kobayashi S, Hankanga C, Inanami O, Kuwabara M, Momota

Y, Tomizawa N, Yasuda J. 2007. The antiproliferative effect of bovine

lactoferrin on canine mammary gland tumor cell. J Vet Med Sci. 70(5): 443-

448.

19

Lampiran 1 Tabel bobot molekul protein standar

Jenis protein Bobot molekul Jarak migrasi (cm)

Phosphorylase 105 000 0,23

Bovine serum albumin 82 000 0,26

Ovalbumin 49 000 0,34

Carbonic anhydrase 33 300 0,5

Soybean trypin inhibitor 28 600 0,58

Lysozyme 19 400 0,683

Lampiran 2 Kurva normalitas bobot molekul protein standar

y = -0,6338x + 3,3912

R² = 0,9865

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

4.2 4.4 4.6 4.8 5 5.2

nis

bah

jar

ak m

igra

si

Log BM

20

Lampiran 3 Tabel konsentrasi protein standar berbanding absorbansi

Konsentrasi protein standar Absorbansi

0 -0,041

1500 0,247

1000 0,115

750 0,07

500 0,033

250 0,002

Lampiran 4 Kurva standar konsentrasi protein

y = 0,0002x - 0,0529

R² = 0,9748

-0.1

-0.05

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

abso

rban

si

konsentrasi standar protein

21

RIWAYAT HIDUP

Anggraeni Ramadhaleta Yugis lahir di Tembilahan pada tanggal 7 Juli

1989, putri pertama dari Bapak H.Mustakim dan Ibu Hj.Jaslelawati. Penuulis

diterima pada jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Riau melalui jalur SPMB tahun 2007 dan menyelesaikan studi pada

tahun 2011 untuk Strata-1. Penulis diterima di Sekolah Pascasarjana Magister

Kimia Institut Pertanian Bogor pada tahun 2013. Selama menjalankan studi di

Sekolah Pascasarjana Magister Kimia di Insitut Pertanian Bogor penulis mendapat

bantuan biaya pendidikan dari Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi Beasiswa

Pendidikan Pascasarjana Dalam Negeri dari tahun 2013 sampai 2014.