IMUNOASAI (PEMERIKSAAN SEROLOGI)

Departemen Patologi KlinikUniv. Wijaya Kusuma Surabaya

dr. Febtarini R, Sp.PK

Serologi • Suatu ilmu yang mempelajari cara mendeteksi suatu infeksi di dalam

serum pasien, misalnya adanya antibodi (Ab) spesifik terhadap mikroba tertentu

• Uji serologi didasarkan atas ikatan spesifik antara antigen (Ag) dan antibodi (Ab)

Ag yang telah diketahui akan bereaksi/berikatan dengan Ab yang belum diketahui di dalam serum

Sebaliknya Ab yang telah diketahui dapat digunakan untuk mendeteksi Ag dalam serum pasien

• Reaksi Ag-Ab dapat diamati atas terbentuknya presipitasi, aglutinasi atau dengan bantuan label tertentu, misalnya label radioaktif, label enzims dll

-S-S--S-S--S-S-

Regio variabel

L H L H

Fc

Fab

Gambar 1. Struktur dasar dari molekul antibodi L = Light Chain H = Heavy chain

2. Komponen yg terpenting dalam serologi yaitu ANTIBODIANTIBODI

Beberapa Istilah penting dlm Imunoasai

Ikatan Ab-Ag adalah spesifik seperti kunci-anak kunci. Reaksi silang dapat terjadi dengan struktur mol Ag lain yang mirip dengan Ag pasangannya tergantung dari :

- profil spesifitas Ab-nya &- kemurnian Ag-nya

Ab yang amat spesifik = Ab dengan binding sites yang hanya dapat mengikat Ag dengan struktur molekul yang unik/tertentu saja.

a. Spesifitas dari Ab

xyz

xyz

Antigen I Antibodi I

Antigen II

v wx v

wx

XYZ

XYZ

V WX

XYZ

Gambar 2. Kompleks dua antigen yang memiliki satu epitop yang sama (X) dan berbagai macam antibodi

yang mungkin terbentuk

Antibodi II

b. Ukuran kuantitas Ab

Ada beberapa cara tentukan konsentrasi Ab dalam serum.

- Kualitatif pos. /neg. adanya perubahan fisik dari bahan pemeriksaan. (+/-)

- Semi kuantitatif ; ditentukan dengan pengenceran serum secara progresif Titer (1/10, 1/100, 1/640)

- Kuantitatif ; ditentukan dengan menggunakan beberapa sera baku kurva baku. Akurasi dicek dengan serum kontrol. (100 pg/mL, 2 μL/mL) Hasilnya diinterpolasi ke dalam kurva baku.

Gambar 3. Kurva baku uji ELISA

0Kadar Bahan

X

OD

5 g/dl

FAKTOR-2 DASAR YG MEMPENGARUHI IMUNOASAI

Sifat dari Ag. Ab diberi nama sesuai dengan cara penentuan yang paling sens. Mis : aglutinin, presipitin dllElektrolit dan pH2

1

Waktu dan suhu. Reaksi Ag-Ab terjadi dalam 2 tahapa. Ikatan spesifik Ab dg Ag/Hapten yang sesuaib. Terjadi reaksi yg dapat dilihat (presipitasi dll)

3

Mekanisme Daya Tahan NonspesifikBahan yg normal/abnormal terdapat dalam sekret/cairan tubuh.

4

Rasio Ag dan Ab5

prozone postzone

Prozone,Tak ada presipitasi

Equivalent zone,Presipitasi

Post zone,Tak ada presipitasi

Gambar 4. Berbagai macam rasio Ag – Ab dan implikasinya

= ANTIBODI= ANTIGEN

BAHAN PEMERIKSAAN UTK IMUNOASAI

MACAM BAHAN : serum , plasma, css Usahakan jangan hemolisis

Inaktivasi C 56°C, 30 menit

Ag untuk Imunoasai. Sebaiknya dibuat sendiri dari strain lokal, lebih baik yang multistrains.

IMUNOASAI

KADAR BAHAN

RENDAH ( ng/ml, pg/ml ) TINGGI (mg/ml,ug/ml)

Hasil reaksi tak tampak

FAKTOR PENGUAT (LABEL)

IF RIA EIA

Homogen Heterogen = ELISA

Hasil reaksi DAPAT DILIHAT

Presipitasi/RID

UJI AGLUTINASI

ICA

UJI PRESIPTASI UJI AGLUTINASI UJI FIKSASI KOMPLEMEN UJI NETRALISASI TOKSIN

I. IMUNOASAI TAK BERLABEL

Ada 2 jenis imunoasai.I. IMUNOASAI TAK BERLABELII. IMUNOASAI BERLABEL

JENIS IMUNOASAI

Ag yang larut Antibodi

PRESIPITASI

Gambar 5. Prinsip dasar uji presipitasi

UJI PRESIPITASI

Presipitasi adalah bila Ag + Ab dalam bentuk larutan menghasilkan suatu agregasi yang terlihat dengan mata

Ag.

Serum dengan Ab

Inkubasi

Presipitasi

Gambar 6. Uji presipitasi tabung

Antisera dalam agar

GAMBAR 10. R.I.D

1

3

4

56

7

8 2

Sera baku

Tes serum

Tes serum

Tes serum

Tes serum

Tes serum

APLIKASI KLINIS UJI PRESIPITASI

Uji Tabung : VDRL - Makro

Uji Slide : VDRL - Mikro

Uji Tabung Kapiler : Penentuan CRP

RID : Penentuan kelas Ig

Imunoelektroforesis

• Migrasi protein serum di dalam gel dan apabila bertemu dengan antigen yang sesuai akan terjadi presipitasi

Ag. pada permukaan sel

Ab.Aglutinasi

Gambar 11. Prinsip dasar reaksi aglutinasi

UJI AGLUTINASI

Tak larut

+ -Gambar 12. Uji Aglutinasi Slide

Gambar 13. Uji Aglutinasi tabung

Serum ( Ab )

Susp. Ag

Inkubasi

Aglutinasi

AGLUTINASI TAK LANGSUNG

A. AGLUTINASI PASIF

B. Ab TAK LENGKAP

a. Ab Monovalen

b. Lokasi Tersembunyi / Ukuran Terlalu Kecil ( Ig. G )

+ +Ag Larut

PartikelPartikel disalut Ag

Ab dalam serum

AglutinasiGambar 14. Uji aglutinasi pasif

Partikel:

Seldarah merah

Lateks

Carbo adsorben

(Ko-aglutinasi)

APLIKASI KLINIS UJI AGLUTINASI

Uji Slide (lempeng): uji Widal slide Uji Tabung : uji Widal tabung Aglutinasi Tak Langsung: uji Rose-Waaler

III. UJI HEMAGLUTINASI : KULIAH Bank Drh

IV. UJI LISIS IMUN & FIKSASI KOMPLEMENHampir sama dengan uji aglut. tak langsung,Hanya Anti – Ig diganti C Lisis Imun

UJI LISIS IMUN & FIKSASI KOMPLEMEN

• Komplemen di dalam plasma sebanyak 3 mg/ml dalam bentuk inaktif

• Jika bertemu dengan kompleks Ag-Ab komplemen menjadi aktif (melalui jalur klasik), dan menghasilkan berbagai kaskade aktivasi, misalnya lisis dari sel target

Prinsip Uji Komplemen

Komplemen

Sensitized cellAb

Ag pada permukaan sel

= Komplemen

Gambar 15 . Prinsip dasar uji lisis imun

Uji Lisis Imun

Gambar 16 . Uji Fiksasi Komplemen

A.

C C Tak ada Lisis

Komplemen Komplemen

Terikat

Sensitized SDM

B.

C C Lisis

Komplemen Komplemen

Bebas

Serum dgn. Ab

Serum tanpa Ab

Uji Positif

Uji Negatif

An example of the complement fixation test.

Fig. 17.14 Complement fixation test.

II. IMUNOASAI BERLABEL1. CAT FLUORESENS: IF

2. RADIOISOTOP: RIA3. ENZIM: IMUNOASAI ENZIM ( EIA )

A. EIA HOMOGENB. EIA HETEROGEN (ELISA)C. UJI IMUNO-PEROKSIDASE

4. EMAS KOLOIDAL:ASAI IMUNOKROMATOGRAFIK (ICA)

CUCI

Mikroskop Fluoresens

Ab diket berlabel cat fluoresensAg tak diket.

Fiksasi pada slide

Kompleks Ag-Ab Berfluoresensi

Gambar 18. Prinsip dasar uji imunofluoresens langsung (direct).

1. IMUNOASAI FLUORESENS (IF)

CuciAg diket.Ab tak diket

Cuci

Mikroskop Fluoresens

Kompleks Ag – Ab tak tampak

AHG dilabel Fluorescein

Kompleks Ag – Ab – AHG berfluoresensi

Gambar 19. Prinsip dasar uji imunofluoresens tak langsung (indirect).

An example of direct and indirect immunofluorescence testing.

Fig. 17.15 Immunofluorescence testing

KELEMAHAN UJI IF Peralatan canggih dan mahal

Perlu tenaga terlatih

Per hari maks 25 slide / analis

Sukar dibuat otomatis

Pelaksanaan agak kompleks & membosankan

Gambar 20. Prinsip dasar Uji RIA R = label radioisotop

R

RR RR

R

R

R

R

Radiation Counter

2. Uji RIA

Radioisotop : 3H Thymidin, 131 I

Gambar 21. Prinsip dasar Uji RIA kompetitif

R

R

R

R

R

R R

RADIATION COUNTER

Cuci

KELEMAHAN UJI RIA

Butuh alat mahal & tenaga terlatih

Waktu paruh reagens amat pendek ( 1,5 – 2 bln )

Perlu perlindungan khusus pd petugas lab.

Perlu tempat pembuangan reagens yang khusus

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)• Prinsip dasar Elisa adalah pemakaian enzim

untuk mendeteksi adanya ikatan Antigen-Antibodi (Ag:Ab)

• Enzim akan merubah (mengkonversi) substrate yang tidak berwarna (kromogen) menjadi produk berwarna yang mengindikasikan adanya ikatan Ag:Ab

Gambar 24. Prinsip dasar uji ELISA langsung

Ab

PRODUK berwarna

SUBSTRAT berkromogenAg pada

Fase padat

Anti –Ig berlabel enzim

Direct ELISA

• Untuk mendeteksi Ab

Enzim: AK (Alkalin fosfatase) atau HRPO (Horse Raddish Peroxidase)

Substrate : TMB (Tetra methyl benzidine) atau NPP (p-nitrophenyl phosphate)

SUBSTRAT berkromogen

PRODUK berwarna

Ag

Ab I pada Fase padat

Ab II berlabel enzim

Gambar 23. Prinsip dasar (tak langsung)

double antibody sandwich ELISA

Indirect ELISA (Sandwich ELISA)

• Untuk mendeteksi adanya antigen (Ag)

Antibodi dilapiskan pada dasar sumuran

Bahan yg diperiksa ditambahkan → terjadi reaksi Ag-Ab

Ditambahkan anti-antibodi ( Mo anti-Ab) berlabel BIOTIN (biotinylated)

Ditambahkan streptavidin berlabel enzim

Ditambah kromogen → Warna, diukur secara kolorimetri memakai Elisa-reader

ELISA

SUBSTRAT BERKROMOGEN

PRODUK berwarna

Ab pada Fase padat

Ag berlabel enzim

Gambar 22. Prinsip dasar uji ELISA kompetitif

Uji ELISAAg dlm serum

An example of the indirect and capture ELISA methods.

Fig. 17.16 Methods of ELISA testing.

CONTOH APLIKASI KLINIS SEROLOGI TEST

1. Sifilis2. Demam tifoid3. Tuberkulosis

SIFILIS

Paling Ideal ; Ig. M- ELISA ( Dx, keaktivan, mengikuti hasil Rx )

Di Indonesia ; TPHA Dx VDRL Aktivitas &

mengikuti hasil Rx

Neurosyphilis : VDRL Dx Jumlah sel Protein Total

Keaktivan & mengikuti hasil Rx

UJI SEROLOGI DEMAM UJI SEROLOGI DEMAM TIFOIDTIFOID

1.1. TES WIDALTES WIDAL2.2. TES IgM SalmonellaTES IgM Salmonella3.3. ELISAELISA4.4. BIAKAN / KULTUR DARAHBIAKAN / KULTUR DARAH

UJI WIDAL (AGLUTINASI) Dari hasil 1X tes belum dapat ditarik kesimpulan yang berarti. Perlu ulangan setelah 5-7 hari

Harga normal tes Widal tabung.Aglutinin O : 1/160

Aglutinin H : 1/160

Aglutinin PA : 1/80

Aglutinin PB : 1/320

Vaksinasi; aglutinin H dapat dipertahankan beberapa tahun,

Antibiotika ; dapat memperlambat kenaikan titer

INDIKASI SEROLOGI TBINDIKASI SEROLOGI TB• INDIKASI:INDIKASI:1.1. BTA DAHAK NEGATIFBTA DAHAK NEGATIF2.2. TB EKSTRAPULMONUMTB EKSTRAPULMONUM3.3. TB ANAKTB ANAK4.4. SPESIFISITAS:SPESIFISITAS:

– TGT JENIS ANTIGEN (REAKSI SILANG)TGT JENIS ANTIGEN (REAKSI SILANG)

5.5. KONTROVERSI KARENA:KONTROVERSI KARENA:– Kurang pemahaman patogenesisKurang pemahaman patogenesis– Bersikukuh pada Postulat KochBersikukuh pada Postulat Koch

Lateral flow immuno assay

62

LATERAL FLOW IMMUNOASSAY

CONTOH PARAMETERPEMERIKSAAN SEROLOGI

CRP = Protein C reaktif- Suatu alfa globulin yg ada di serum pd inflamasi- Suatu reaktan fase akut, indikator non spesifik

inflamasi yg berhbgn dg imunologi- Tidak dipengaruhi oleh anemia, kehamilan,

hiperglobulinemia- serial, utk indeks aktivitas penyakit dan

monitoring terapi

64

•Poliklonal antibodi•Antibodi IgG dalam kelas IgM

•Kadar IgM terbesar, bisa dideteksi oleh alat•Antibodi terhadap determinan antigenik pada fragmen Fc immunoglobulin

Sumber: PKB PK,2002

AntibodiRheumatoid

factor

FAKTORREMATOID

TERIMA KASIH ATAS PERHATIAN ANDA