Il l . METODOLOGI- PENELlTlAN

111.1. Ternpat Dan Waktu

Penelitian dilqkukan di Laboratorium Rekayasa Proses Pangan

Pusat Antar Universitas (PAU) Pangan dan Gizi-lnstitut Pertanian Bogor

(IPB) serta Puslitbang Kimia Terapan-LIPI, Puspiptek, Serpong. Penelitian

berlangsung dari bulan April 1995 hingga bulan April 1997.

111.2. Bahan Dan Alat

Bahan baku untuk percobaan ini adalah minyak sa@t mentah

(Crude Palm Oil) dari buah kelapa sawit (Elaeis guineensis, Jam) jenis

Tenera yang didapatkan dari PT. Perkebunan Nusantara VIII, PKS.

Kertajaya, Malingping Banten, Jawa Barat. Bahan baku disimpan dalam

lemari pendingin pada temperatur - 14 O C sampai saat digunakan.

Enzim yang digunakan merupakan lipase mikrobial komersial yakni

dari Rhizomucor miehei dengan nama dagang Lipozyme-IM imobil dengan

aktivitas enzimatis = 5-6 BAUN ( BAUN = Batch Acidolysis Unit ), dan

Novozyme-435 imobil dari Candida antartica dengan aktivitas

enzimatisnya: 7000 PLUlgram (PLU = Pmpyl Laurate Unit) berdasarksn

keterangan dari PT. Novo Nordisk, Denmark. Lipase Candida cylindracea

dengan nama dagang Cipase-OF dengan aktivitas enzimatis: 360.000

Ulgr berdasarkan keterangan dari Meito Sangyo Ltd., Jepang. Potasium

dihidroksi fosfat, H2S04, HCI dan NaOH produk dari E.Merck. COz

komersial dipakai sebagai pelarut pada proses ekstraksi superkritik serta

bahan kimia lainnya untuk keperluan analisa berkualitas pro-analisa dan

pro-kromatografi didapat dari penyalur di Bogor, Jakarta dan sekitarnya,

Alat utama yang digunakan adalah : l).Unit ekstraksi fluida

superkri t i k ( Superpressure-hydrodynamics, Newpod Scientific. Inc.

AMINCO, Mary land, USA, model 46-19360-50 Hz) seperti ditunjukkan

pada Gambar 13 dengan spesifikasi sebagai berikut :

2). Kromatografi cairan kinerja tinggi (Shimadzu model SPD-MA) dengan

UVNlS Photo diode array detector, pompa LC-GA , kolom reversed phase

C-18 ukuran 4.6 x 250 mm (Vydac model 201 TP-54). 3). Krornatografi

gas (Shimadzu GC-14A) dengan detektor FID (flame ionization detector)

dilengkapi C-R7A chromatopac sebagai integrator dan kolom kapiler silika

AT-1000 (25 m x 0.25 mm, Altech); 4).Spektrofotometer (Spectronic 2000

dari Bausch and Lomb, &A). S).Kromatografi lapis tipis (Camag) dengan

alat spotting (Linomat);

111.3.1. Perlakuan Pendahuluan Terhadap CPO

111.3.1 .l. Hidrolisis enzimatis CPO

Dalam percobaan ini dipelajari hidrolisis enzimatis sebagai

perlakuan awal dari CPO sebelum proses pemekatan menggunakan

teknik SFE. Diagram hidrolisis enzimatis CPO tertera pada Gambar 14.

Pada tahap ini dilakukan 14 paket perlakuan, dimana faktor perlakuan

yang diteliti pada masing-masing paket tercantum dalam Tabel 10 dan

kondisi yang lain konstan berdasarkan paket perlakuan dengan hasil

terbaik. Perlakuan dilakukan secara berurutan.

Minyak sawit mentah (CPO)

Gas N2 ------a I

Enzim lipase .-~Erlenmeyer bertutup 4- Larutan bufer

4 Orbital thermoshaker

T,t, rpm

Pendi d ginan

4 Heksan -+ Pem~sahan , Enzim

Fasa asam lem k dlm heksan 1 1 Cuci dgn

Penggunaan ulang Heksan Evaporasi vakum

I

Campuran asa f, lemak sawit Analisis : - Derajat hidrolisis

- Kandungan karotenoid

Gambar 14. Diagram alir proses hidrolisis CPO secara enzimatis

Tabel 10. Faktor dan taraf percobaan hidrolisis CPO secara enzimatis

Prosedur percobaan hidrolisis enzimatis CPO :

No

A 1 2 3 4 5 6

7

8

B

1 2

3 4 5

6

Prosedur percobaan hidrolisis CPO di adopsi dari Lirrfield (1986)

dengan modifikasi. Sejumlah 10 gram substrat dengan konsentrasi CPO

50 %, pada bufer fosfat 0.1 M dengan pH 5.4, ditarnbahkan enzim lipase

Faktor perlakuan percobaan

dengan konsentrasi 5% (blb CPO). Carnpuran reaksi diinkubasikan

Taraf perlakuan

Hidrdisis CPO oleh lipase dari R.miehei (LipozymellM) pH bufer fosfat 0.1 M Variasi konsentrasi enzim (%b/b CPO) Konsentrasi substrat CPO (% berat) Kecepatan pengadukan (rpm) Temperatur proses (OC) Waktu proses (Jam)

lnteraksi faktor pH, konsentrasi enzirn (%bib CPO) dan konsentrasi CPO (%berat substrat)

Penggunaan ulang Lipozyme-IM (Kali)

4; 5; 5.4; 6; 7 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8 40; 50;60; 70;80;. 90 90; 150; 21 0 40; 45; 50; 55; 60 6; 12; 18; 24; 30; 36; 42; 48; 54; 60 pH: 4; 5.4; 7 Enzim: 1; 3; 5 CPO: 30; 50; 70 8

Hidrolisis CPO oleh lipase dari C.cylindmcea (Lipase-QF)

pH bufer fosfat 0.1 M Konsentrasi enzim Lipase-OF(%b/b CPO)

Konsentrasi CPO (%berat substrat) Temperatur proses (OC) Waktu proses (menit)

lnteraksi faktor pH, konsentrasi enzim(%b/b ' CPO) dan konsentrasi CPO (%berat substrat)

,

4; 5; 5.4; 6; 7 0.02; 0.04; 0.06; 0.08; 0.1 ; 0.2; 0.3 50; 60; 70; 80;90 40; 45; 50; 55; 60 1 0;20;30;40;50;60; 70; 80;90; 1 20; 1 80;2 40; 300; 360;420;48 0;540;600 pH: 4; 5; 6 Enzim: 0.04; 0.06; 0.08 CPO: 70; 80; 90

dalam orbital thermoshaking incubator dengan putaran 150 rpm dan

temperatur 45 OC selama waktu 24 jam.

Pemisahan enzim dari tiap tahap proses dilakukan dengan *

melarutkan campuran reaksi dalam 20 ml heksan dan difiltrasi secara

vakum, kemudian larutan dalam heksan dievaporasi dengan vacuum

rotary evaporator pada 35 OC sampai bau heksan hilang dan diperoleh

campuran asarn lemak dan sisa trigliserida dengan karotenoid di

dalamnya. Analisis produk mencakup derajat hidrolisis (3.4.1) serta

kandungan karotenoid (3.4.2).

Pada perlakuan penggunaan ulang lipase, enzim hasil pemisahan

dengan campuran reaksi dicuci dengan heksan dan disaring dehgan filter

vakum sehingga kering dan siap digunakan kembali pada percobaan

berikutnya tanpa ada penambahan enzim baru.

111.3.1.2. Hidrolisis kimiawi CPO

Dalam percobaan ini dipelajari hidrolisis CPO secara kimiawi

diadopsi dari Vogel (1968) yang dimodifikasi dengan menggunakan

HzS04 dan HCI sefia NaOH sebagai katalis basa. Diagram hidrolisis

kimiawi CPO tertera pada Gambar 15. Pada tahap ini dilakukan 2 paket

perlakuan, dimana faktor dan taraf perlakuan yang diteliti pada masing-

masing paket tercantum dalam Tabel 11 dan kondisi yang lain konstan

berdasarkan kondisi terbiik paket percobaan sebelumnya.

label 11. Faktor dan taraf perlakuan hldtolidrr CPO swam klmlrwi

Prosedur percobaan hidrolisis CPO menggunakan katalis asam

Ke dalam 10 gram campuran substrat CPO dan air pada

perbandingan 6:4 (blb) ditambahkan HzSOs atau HCI dengan variasi v/b

CPO. Campuran reaksi dipanaskan di atas stirring hotplate yang

dilengkapi kondensor untuk refluks pada temperatur 9 0 ' ~ dengan laju

putaran 360 rpm selama 6 jam. Untuk menghindari oksidasi, tabu reaksi

ditutup dengan alumunium voil. Setelah reaksi selesai, lapisan air

dipisahkan dan lapisan asam lemak derajat hidrolisis (3.4.1) dan

kandungan karotenoidnya (3.4.2).

Prosedur percobaan hidrolisis CPO dengan katalis basa NaOH

Kedalam 4.2 gram CPO ditambahkan substrat air : metanol ( 5:5

VIV dengan total volume 10 ml) dan NaOH 5% blb CPO. Hidrolisis

dilakukan dalam orbital thermoshaking incubator pada kecepatan putar

150 rpm pada 60 OC selama 1 jam. Hasil reaksi dinetralisir dengan HCI

dan dicuci dengan air. Setiap pemisahan dilakukan dengan sentrifus dan

dianalisa derajat hidrolisis dan kandungan total karotenoidnya.

Minyak sawit mentah (CPO)

Air -1 1 ,yaIiri : - H2S04,HCI

Gas N2 - Erlenmeyer bertutup I

- NaOH +

Reflux magnetic stimng hot plate atau orbital t errnoshaker 1

Pedin inan B Fasa air - Pemisahan

1 Asam lemak sawit

Analisa : - Derajat hidrolisis - Kandungan karotenoid

Gambar 15. Diagram alir proses hidrolisis kimiawi dari CPO

. 111.3.1.3. Alkoholisis CPO secara enzimatis

Alkoholisis enzimatis CPO dilakukan dengan 10paket urutan

percobaan menggunakan 2 macam enzim Lipozyme-IM dan Novozyrne

435 seperti tercantum dalam Tabel 12. Skema percobaan alkoholisis CPO

secara enzimatis tertera pada Gambar 16.

Tabel 12. Faktor dan taraf percobaan alkoholisis CPO secara enzimatis

Prosedur percobaan alkoholisis enzimatis CPO

Kedalam 0.5 gram CPO dalam erlenmeyer joint bertutup gelas

ditambahkan 10 ml caknpuran pelarut-donor alkil (9:l vlv), 0.5 ml bufer

fosfat pH 7.0 dan enzim Lipozyme sebanyak 20% (bib CPO). Headspace

4

5 6

diisi dengan gas Nz. Campuran reaksi diinkubasikan dalam orbital

thermoshaker pada 60 rpm, 40 OC selama 24 jam.

Pemisahan enzim dengan campuran reaksi dilakukan dengan

melarutkan dalam 20 ml heksan. POME didapatkan dengan menguapkan

lnteraksi faktor konsentrasi enzim (%b/b CPO) dan perbandingan molar CPO: metanol

Temperatur proses (OC) Waktu proses (Jam)

pelarut menggunakan vacuum mtary evaporator. Analisis produk

Enzim: 20; 40; 40 CPO: MetOH: 1 :6; 118; 1 : lO 40,45, 50 12, 24, 36, 48, 60, 72,84

B. Alkoholisis CPO oleh Lipase dari R.miehei (Novozyme 436)

mencakup tingkat ester (3.4.5.) dan kandungan karotenoidnya (3.4.2).

1

2

3 4

Jenisdonoralkil

Konsentrasi enzim (%blb CPO)

Jumlah pelarut heksan (ml) Jumlah donor alkil (ml)

metanol, etanol, butanol, etil asetat 20; 40; '60; 80; 100; 120 1 ;2;3;4;5;6;7;8;9 3; 3.5; 4; 4.5; 5

Minyak sawit mentah ( CPO)

' Gas N2 1 i-' Pelarut organik

Enzim lipase --------+Erlenmeyer bertutup Donor alkil I +

Orbital therrnoshaker Tit, rpm

I

Pendi inan is + Heksan -b Pemisahan 7 Enzim

4 Fasa ester dlm heksan

& Evaporysi vakum

f Ester metil sawit

Analisis : - Tingkat ester - Kandungan karotenoid

Gambar 16. Diagram alir proses alkoholisis CPO secara enzimatis

111.3.1.4. Alkoholisis kimiawi CPO

Alkoholisis CPO secara kimiawi dilakukan berdasarkan metoda Ooi

(1994) dengan menggunakan katalis NaOH dalam metanol seperti tertera

pada Gambar 17. Preparasi katalis dilakukan dengan melarutkan

sejumlah NaOH kedalam metanol dengan perbandingan tertentu .

Dilakukan studi pendahuluan untuk melihat konsistensi produk

dengan memvariasikan perbandingan mot antara CPO: metanol 1: 6, 1: 8,

1 : 10, 1 : 12 (mol/mol) dan persentase NaOH 0.5, 1 .O, 1.39, 1.8 % b/b CPO.

Proses alkoholisis dilakukan pada temperatur 60 OC selama 1 jam dalam

orbital thermoshaker dengan kecepatan putar 150 rpm. Setelah reaksi

selesai, campuran reaksi disentrifus sehingga terjadi 2 lapisan. Lapisan

atas berwarna merupakan fasa ester dengan karotenoid di dalamnya dan

lapisan bawah tak bennrarna adalah fasa air. Lapisan atas dicuci dengan

air dan dipisahkan dengan sentrifus, kemudian dilihat penampakan hasil

dan pemisahan lapisannya secara kualitatif serta dianalisis tingkat ester

dan kandungan total karotennya. Proses alkoholisis diulang dengan

menggunakan satu kombinasi perlakuan terpilih dan divariasikan pada

berbagai waktu proses yaitu : 1, 1.5, 2 dan 2.5 jam.

Hasil alkoholisis dengan kondisi waktu terpilih dilanjutkan dengan

mencari kondisi pemisahan tapisan ester dan air yang paling baik.

Campuran reaksi diekstrak dengan berbagai pelarut organik dan

kombinasinya seperti: heksan, petroleum eter dan benzen dengan

perbandingan 1 : 1 serta dibandingkan terhadap kontrol (tanpa pelanrt).

Untuk menyempurnakah pemisahan antara dua lapisan yang terbentuk,

dilakukan optimasi terhadap kecepatan dan waktu pernutaran sentrifus

yaitu dari 1250, 2500 dan 3750 rpm selama 5, 10 dan 15 menit.

Pengaruh temperatur proses dipelajari dengan menggunakan

kombinasi perlakuan dan kondisi proses terpilih sebelumnya. Variasi

temperatur dilakukan pada 40, 45, 50, 55 dan 60 'C. Analisa produk

seluruh tahap hasil alkoholisis meliputi tingkat ester (3.4.5) dan

kandungan karotenoid (3.4.2).

+ hAetanol + MOH - Tabun~ bertutup

1 ~enyemprotan N2 di head

1 Orbital thermoshaker 60 OC, 1 50 rpm, 1 jam

1 Pendinginan 1

Ekstraksi - Kombinasi peiaNt : I - Heksan 1 - Petroleum eter

Lapisan tak t- Sentrifus

1 - Benzen

berwarna

Lapisan berwarna I +

Evaporasi

1 Pencucian dg akuades

I 4

Sentrifuse 1

Ester metil sawit

Gambar 17. Diagram alir proses alkoholisis minyak sawit

111.3.2. Pemekatan Karotenoid Dengan Teknik Fiuida C Q SuperkrMlk

Pemekatan karoten dengan teknik fluida CO;! dilakukan dengan

urutan pengerjaan seperti tercantum pada Gambar 18.

111.3.2.1. Preparasi bahan baku pemekatan karoten CPO dengan teknik fluida C02 superkritik

Preparasi bahan baku guna pemekatan karoten CPO dengan

teknik fluida superkritik merupakan hasil pemilihan proses pendahuiuan

(111.3.1) dalam skala 20 kg bahan baku CPO. Pemilihan proses perlakuan

awal CPO berdasarkan: kandungan karotenoid terbaik dan tingkat ester

atau derajat hidrolisis terbaik.

111.3.2.2. Pemekatan karoten CPO

Percobaan dilakukan dalam 2 tahap. Tahap awal dimaksudkan

untuk mencari kondisi tekanan dan temperatur optimum dengan

memvariasikan beberapa tekanan dan temperatur proses pada waktu dan

laju alir COz yang konstan.

Sejumlah 200 gram bahan baku hasil preparasi pada bagian

111.3.2.1 dimasukkan ke dalam ekstraktor pada sistem ekstraksi dengan

fluida superkritik dan ditutup rapat. Kondisi proses di set sesuai dengan

variasi perlakuan tahap awal sebagai berikut : Tekanan : 1500 , 2000,

2500,3000, 3500 psi, Temperatur : 40 ,45,50,55, 60 OC dan Waktu :

4 jam dan laju alir COz sebesar 0.56 kgdam. Tekanan dalam separator di

set pada 500 psi dan, temperatur sama dengan temperatur ekstraktor.

Banyaknya COz yang digunakan dihitung dari selisih berat sebelum dan

sesudah proses. Hasil proses ekstraksi terpisah masing-masing sebagai

ekstrak yang merupakan keluaran dari separator dan residu adalah

bagian yang masih tinggal dalam ekstraktor. Analisis produk ekstrak dan

residu mencakup perolehan produk, kandungan total karotenoid (3.4.2)

dan komposisi alp-karoten (3.4.3) serta komposisi asam lemak masing-

masing fraksi (3.4.4). Pekatan karoten dikoleksikan dalam fraksi residu.

Selanjutnya, percobaan tahap 2 dilakukan pengamatan perubahan

hasil pemekatan terhadap waktu ekstraksi : 0.5 jam - 10 jam (selang 0.5

jam) pada beberapa tekanan dan temperatur terpilih pada tahap awal.

Diagram alir sistem ekstraksi dengan fluida COz superkritik ditunjukkan

pada Gambar 18.

Filtrasi

Alkoholisis * Kimiawi Enzimatis + NaOMe + Lipase

Hidrdisis * Kimiawi * Enzimatis

+ HCI, HzS04 + Lipase

perlakuan idrotisis1 - Tingkat ester

Preparasi dengan

I , Pemekat:n karotenoid dgn teknik SFE

1

Gambar 18. Diagram alir proses pemekatan karotenoid sawit dengan teknik ekstraksi fluida COz superkritik

Dalam tahap pemekatan ini dipelajari :

1. Hubungan antara solubilitas komponen utama CPO terhadap pelamt

COz superkritik sebagai fungsi dari berbagai kondisi proses.

2. Berdasarkan hasil dari kajian tahap pengaruh tekanan dan temperatur

dicari kondisi operasi yang optimum.

3. Bersamaan dengan proses di atas, dipelajari model kinetika pemekatan

P-karoten pada kondisi proses terpilih.

Setiap percobaan dilakukan dengan 2 ulangan. Data diuji dengan

analisis sidik ragam dan bila berbeda nyata, dilakukan uji Duncan taraf

5%. Kecenderungan pengaruh kondisi proses terhadap hasil pemekatan

digunakan metoda permukaan respon (Respon surface methoddogy

111.4. METODA ANALISIS

111.4.1. Derajat Hidrolisis, Metoda titrimetri ( Linfield, 1988)

Derajat hidrolisis merupakan kemampuan suatu proses

menghidrolisa lemak menjadi asam-asam lemaknya. Sampel ditimbang 2

gram kedalam erlenmeyer 200 ml, ditambahkan 50 ml alkohol (etanol

absolut), kemudian dipanaskan dalam penangas air pada temperatur

90'~ selama 10 menit sambil diaduk. Selanjutnya dititrasi dengan KOH

0.1 N dan indikator fenolftalein 1% dalam alkohol, sampai terlihat warna

merah jambu. Sebagai kontrol dilakukan titrasi terhadap sampel sebelum

dihidrolisis. Derajat hidrolisis didefinisikan sebagai berat asam yang

terhidrolisa per berat sampel :

B - A Derajat h'idrolisis = X N X M

10 x G

Dimana : A : jumlah ml KOH untuk titrasi CPO sebelum dihidrolisis B : jumlah ml KOH untuk titrasi sampel setelah dihidrolisis N : normalitas larutan KOH

* G : berat sampel (gram) M : berat molekul asam lemak yang dominan dalam minyak atau

lemak (rata-rata campuran asam lemak CPO = 263)

111.4.2. Kadar Karotenoid Total Metoda Spektrofotometri (Parker, 1992)

Contoh minyak sebanyak 0.5 gram didispersikan dalam 6 ml KOH

5% dalam metanol, di dalam tabung reaksi 18 ml bertutup teflon (alufo).

Headspace diisi dengan gas nitrogen, kemudian di saponifikasi pada

temperatur 60-70 OC selama 1 jam di dalam penangas air dengan kondisi

gelap. Setiap 10 menit di kocok dengan pengocok tabung. Setelah itu

didinginkan dan ditambahkan 2 ml air bebas ion dan 6 ml heksan.

Headspace diisi nitrogen, ditutup dan dikocok selama I menit. Kemudian

disentrifus, larutan bagian atas dipindahkan ke tabung reaksi 18 ml yang

bersih. Bagian bawah hasil ekstrak pertama diekstrak ulang dengan 6 ml

heksan, disentrifus dan lapisan atas ditambahkan ke ekstrak pertama.

Selanjutnya kumpulan ekstrak ditambahkan 3 ml asam asetat 5%

(didalam air) dan headspace diisi gas nitrogen, ditutup dan dikocok

selama 3 menit, disentrifus dan lapisan atas dipindahkan ke dalam tabung

reaksi bersih dan dievaporasi vakum pada 40 OC, hasil ekstrak ditimbang.

Selanjutnya dilarutkan dengan 3 ml pelarut asetonitril : metanol :

diklorometan (75205) dan diukur absorbansinya pada h = 450 nm

dengan spektrofotometer. Kandungan total karotenoid dalam sampel

dihitung dengan menggunakan nilai E'% (1 cm) untuk p-karoten = 2600.

Perhitungan :

10 v [ Karoten ] = X A X F P X

E'" (1 cm) B

Dimana : [Karoten]

E '% (1 cm)

= konsentrasi karoten dalam CPO contoh dalam satuan pglg

= faktor konversi dari persen kadar p-karoten menjadi satuan mglml atau pglpl

= nilai koefisien ekstinsi 9-karoten dalam asetonitril : metanol : diklorometan (75205) pada panjang gelombang 450 nm adalah 2600 (Parker, 1992)

= nilai absorbansi pada panjang gelombang 450 nm

= faktor pengenceran pada saat pengukuran absorbansi

= volume yang diukur absorbansinya adalah 3000 PI

= berat CPO yang diekstrak P-karotennya (gram)

111.4.3. Komposisi a- dan p- karoten Dengan Metoda Kromatografi '

Cair Kinerja Tinggi (KCKT) ( modifikasi Parker, 1992). . Sampel dipreparasi seperti pada penentuan total karoten sampai

hasil ekstrak akhir dilarutkan dalam 3 ml eluen asetonitril : metanol :

diklormetan (75:20:5) , pada botol amber dan disimpan pada -14 '~

sebelum digunakan.

Teknik KCKT yang digunakan adalah nonaqueous reversed

phase (NARP-HPLC) dengan UV-Vis Photo diode array detector SPD-

M6A dan SCL-GA sistem kontrol dari Shimadzu. Sebagai eluen dipakai

campuran asetonitiril : metanol : diklorometan : 75 : 20 : 5 (vlv),

kecepatan alir eluen 1 mllmenit dengan temperatur kolom : temperatur

+ ruang dengan tekanan kolom : 17 kgflan' serta jelajah panjang

gelombang 420-480 nm. Volume sampel atau standar yang diinjeksikan

: 10 pI dan sebelumnya disaring dengan membran filter nylon 0.45 pm.

Konsentrasi p-karoten dalam contoh mengikuti perhitungan :

Ac [ contoh ] = - x FP x [ standar ]

As dimana :

[ contoh ] : konsentrasi beta karoten dalam eontoh (ppm) [ standar ] : konsentrasi beta karoten standar (ppm) As : luas area kromatogram standar Ac : luas area kromatogram contoh FP : faktor pengenceran

111.4.4. Komposisi Asam Lemak Dengan Metoda Kromatografi Gas (GC) (modifikasi Morrison dan Smith, 1964)

Preparasi sampel dilakukan dengan cara sebagai berikut : 2 tetes

(0.04 gram) sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup.

Kemudian ditambahkan 1.5 ml BF3 -metanol (12% beraffvolume) dan 1.5

ml benzen. Campuran dipanaskan dalam penangas air selama 1 jam pada

temperatur 6 0 ' ~ sambil dikocok dengan vorteks setiap 15 menit. Setelah

itu campuran didinginkan, ditambah 2 ml heksan dan 2 rnl aquadest.

Campuran disentrifus dan terbentuk dua lapisan. Lapisan atas diambil,

sedangkan lapisan bawah disentrifus kembali setelah ditambahkan 2 ml

heksan. Lapisan atas yang terbentuk diambil dan dicampurkan dengan

lapisan atas yang pertama, kemudian disaring melalui Na2S04 anhidrat.

Larutan yang tersaring dimasukkan kedalam labu takar 5 ml, diencerkan

dengan heksan sampai 5 ml dan siap disuntikan ke GC. Volume

Oenyuntikan 5 - 15 PI. Pengukuran standar eksternal langsung

disuntikkan sebanyak 1-10 PI setelah diencerkan dengan pelarut yang

sama (heksan) ke GC. Alat kromatografi gas yang digunakan adalah

Shimadzu GC - 14A dilengkapi C-R 7 A chromatopac sebagai integrator,

dengan kondisi :

Perhitungan :

Instrumen Kolom

Gas pembawa Volume injeksi Temperatur detektor FID Temperatur injektor Teknik injeksi Split ratio Attenuasi Range kepekaan Waktu sampling Prog.Temperatur : - Temperatur awal - Laju kenaikan temperatur - Temperatur akhir

1. Kurva kalibrasi standar eksternal

Shimadzu GC-14A Heliflex AT-1000, capillary column, 25 m x 0.25 mm x 0.2pm He, P=1.4 kgIcm2 5-15 p1 275 OC 250 OC

Grob split dan splitless 100 :1 0 (paling peka direkorder) 1 oZ( kepekaan diatat terpeka 10") 15 menit 100 'C ditahan selarna 1 menit

10 'Clmin 180 OC selama 11 rnenit dan 200 "C selama 38 menit

Dari data dilakukan regresi linear sehingga mendapatkan persamaan :

Y = a X + b

Dimana : Y = berat asam lemak X = luas area a,b = konstanta regresi

2. Berat asam lemak sampel diketahui berdasarkan persamaan kalibrasi

di atas dengan memasukkan nilai luas area sampel dan diperoleh M, . Berat asam lemak awal di dapat dengan persamaan :

dimana : Vl = volume sampel yang disuntikkan (pi) Vz = volume total pengencerean awal (pl) Mi = berat asam lemak bebas dalam V, (pg) Mz = berat asam lemak bebas dalam Vz (pg)

3. Komposisi asam lemak :

111.4.5. Tingkat Ester, Metode Kromatografi Lapis Tipis (Modifikasi GanshirtJ969)

Sampel ester metil yang akan diuji tingkat estemya, terlebih

dahulu diencerkan menggunakan pelarut petroleum eter : dietil eter :

asam asetat (90 : 10 : 1). Penotolan sampellstandar pada pelat silika

(Kieselgel 60) dilakukan dengan alat Linomat sebanyak 1-5 pI. Setelah itu

pelat silika tersebut dimasukkan kedalam ruang KLT yang telah jenuh

dengan eluen petroleu'm eter : dietil eter : asam asetat (90:10:1). Jika

eluen telah mencapai garis akhir, pelat silika diangkat dan dikeringkan

dalam udara terbuka. Untuk memperjelas bentuk spot yang terjadi, pelat

silika tersebut dimasukan dalam ruang jenuh lod. Setelah beberapa menit,

terlihat noda-noda hasil pemisahan dan ditandai dengan pinsil kemudian

dijiplak dikertas tipis dan dipotong sekelilingnya untuk di lakukan

perhitungan secara 'potong-timbang'. Pelat silika disimpan dalam

eksikator.

Perhitungan : Berat jiplakan kertas sampel

[ Sarnpel ] = X FP X [ Standar ] Berat kertas jiplakan standar

Dimana : [Sampel] : konsentrasi ester sawit total yang ada dalam sampel

(glliter) [Standar] : konsentrasi standar ester-ester asam lemak palmitat,

stearat, oleat, linoleat dan linolenat) ( Miter) FP : faktor pengenceran

111.4.6. Perolehan Produk

Perolehan produk didefinisikan sebagai perbandingan berat hasil

akhir produk setelah pemisahan dengan produk lain terhadap berat total

substrat awal yang direaksikan. Sebagai contoh pada pemekatan dengan

SFE ( Bagian 3.3.2.2):

Berat fraksi ekstrak Perolehan ekstrak (%) = - ~ 1 0 0 %

Berat bahan baku yang diekstrak

Berat fraksi residu Perolehan residu (%) = ~ 1 0 0 %

Berat bahan baku yang diekstrak

111.4.7. Rendemen . Rendemen didefinisikan sebagai perbandingan berat suatu

komponen tertentu dalam produk terhadap berat komponen tersebut

dalam bahan baku yang diproses. Contoh pada pemekatan karotenoid

dengan teknik fluida superkritik (3.2.2.2):

Berat karotenoid dalam ekstrak Rendemen karotenoid terekstrak (%) : ~ 1 0 0 %

Berat karotenoid dalam bahan baku