identifikasi polimorfisme gen delta- …repository.uinjkt.ac.id/dspace/bitstream/123456789... ·...
TRANSCRIPT
IDENTIFIKASI POLIMORFISME GEN DELTA-
AMINOLEVULINIC ACID DEHYDRATASE (ALAD) DAN
HUBUNGANNYA DENGAN KEJADIAN ANEMIA PADA
MAHASISWA PROGRAM STUDI KEDOKTERAN DAN
PROFESI DOKTER (PSKPD) UIN SYARIF
HIDAYATULLAH JAKARTA ANGKATAN 2012-2014
Laporan Penelitian ini ditulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
SARJANA KEDOKTERAN
Oleh :
Moch Rizki Ramadhan
NIM. 11141030000024
PROGRAM STUDI KEDOKTERAN DAN PROFESI DOKTER
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI
SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA
1438 H / 2017 M
ii
LEMBAR PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Dengan ini saya menyatakan bahwa :
1. Laporan penelitian ini merupakan hasil karya asli saya yang diajukan untuk
memenuhi salah satu persyaratan memperoleh gelar Strata 1 di Universitas Islam
Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.
2. Semua sumber yang saya gunakan dalam penulisan ini telah saya cantumkan
sesuai dengan ketentuan yang berlaku di UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
3. Jika di kemudian hari terbukti bahwa karya ini bukan karya asli saya atau
merupakan hasil jiplakan dari karya orang lain, maka saya bersedia menerima
sanksi yang berlaku di UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
Ciputat, 9 Juli 2017
Moch Rizki Ramadhan
iii
LEMBAR PERSETUJUAN PEMBIMBING
IDENTIFIKASI POLIMORFISME GEN DELTA – AMINOLEVULINIC ACID
DEHYDRATASE (ALAD) DAN HUBUNGANNYA DENGAN KEJADIAN ANEMIA
PADA MAHASISWA PROGRAM STUDI KEDOKTERAN DAN PROFESI
DOKTER (PSKPD) UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
ANGKATAN 2012 – 2014
Laporan Penelitian
Diajukan kepada Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter
Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
untuk Memenuhi Persyaratan Memperoleh Gelar Sarjana Kedokteran (S. Ked)
Oleh
Moch Rizki Ramadhan
NIM. 11141030000024
PROGRAM STUDI KEDOKTERAN DAN PROFESI DOKTER
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA
1438 H / 2017 M
iv
LEMBAR PENGESAHAN
Laporan Penelitian berjudul Identifikasi Polimorfisme Gen Delta – Aminolevulinic
Acid Dehydratase (ALAD) dan Hubungannya dengan Kejadian Anemia pada
Mahasiswa Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter (PSKPD) UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012 – 2014 yang diajukan oleh Moch Rizki
Ramadhan (NIM 11141030000024), telah diujikan dalam sidang di Fakultas Kedokteran
dan Ilmu Kesehatan pada tanggal 26 Juli 2017. Laporan penelitian ini telah diperbaiki
sesuai dengan masukan dan saran penguji, serta telah diterima sebagai salah satu syarat
memperoleh gelar Sarjana Kedokteran (S.Ked) pada Program Studi Kedokteran dan
Profesi Dokter.
Ciputat, 26 Juli 2017
DEWAN PENGUJI
Ketua Sidang
Chris Adhyanto, S.Si, M.Biomed, PhD
NIP. 19690511 200312 1 001
Pembimbing 1
Chris Adhyanto, S.Si, M.Biomed, PhD
NIP. 19690511 200312 1 001
Pembimbing 2
DR. Zeti Harriyati, S.Si, M.Biomed
Penguji 1
Nurlaely Mida R, S.Si, M.Biomed, DMS
NIP. 19671119 200501 2 001
Penguji 2
dr. Riva Auda, Sp.A, M.Kes
NIP. 19761217 200801 2 015
Pimpinan Fakultas
Dekan FKIK UIN Jakarta
Prof. DR. Arif Sumantri, S.KM, M.Kes
NIP. 19650808 198803 1 002
Kaprodi PSKPD UIN Jakarta
dr. Nouval Shahab, Sp.U, FICS, FACS, PhD
NIP. 19721103 200604 1 001
v
KATA PENGANTAR
Assalamualaikum Warahmatullahi Wabarakatuh,
Alhamdulillah puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan
rahmat dan ridho-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan laporan
penelitian dengan judul IDENTIFIKASI POLIMORFISME GEN DELTA –
AMINOLEVULINIC ACID DEHYDRATASE (ALAD) DAN HUBUNGANNYA
DENGAN KEJADIAN ANEMIA PADA MAHASISWA PROGRAM STUDI
KEDOKTERAN DAN PROFESI DOKTER (PSKPD) UIN SYARIF
HIDAYATULLAH JAKARTA ANGKATAN 2012 - 2014. Sholawat serta salam
semoga tetap tercurahkan kepada Nabi Muhammad SAW, yang telah membawa kita dari
zaman jahiliyah menuju zaman ilmu pengetahuan.
Penyusunan laporan penelitian ini dapat terselesaikan karena bantuan dari
berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada yang
terhormat :
1. Kedua orang tua saya, Bejo Santoso dan Nur Hanifah yang selalu memberikan
kasih sayang, restu, doa, dan semangat, sehingga memotivasi dan menguatkan
saya dalam melakukan penelitian ini,
2. Dr. KH. Asep Saifuddin Chalim, M.A. selaku kyai pondok pesantren Amanatul
Ummah yang selalu memberikan doa bagi santrinya,
3. Kementrian Agama RI yang telah menyelenggarakan PBSB sehingga kami
sebagai santri pesantren dapat memiliki kesempatan untuk menimba ilmu di FKIK
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta,
4. Prof. Dr. H. Arif Sumantri, S.KM, M.Kes. selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan
Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta,
5. dr. Nouval Shahab, Sp.U, PhD, FICS, FACS. selaku Ketua Program Studi
Kedokteran dan Profesi Dokter,
6. Chris Adhiyanto, S.Si, M.Biomed, PhD dan DR. Zeti Harriyati, M.Biomed. selaku
pembimbing yang telah membimbing, mengajarkan, memfasilitasi dan
menyemangati.
7. dr. Riva Auda, Sp.A, M.Kes dan Nurlaely Mida R, M.Biomed, DMS. selaku
penguji yang telah bersedia menguji dan mengoreksi laporan penelitian ini.
vi
8. Laboran laboratorium biokimia dan biologi, Mbak Ayi dan Mbak Sur yang telah
membantu berlangsungnya penelitian ini.
9. Adik saya tercinta, Jaziilah Naflah Naziihah yang telah memberikan semangat
dalam menyelesaikan penelitian ini.
10. Annisa Tristiana yang telah membantu membimbing dan menyemangati dalam
penyelesaian penulisan laporan penelitian ini.
11. Teman sekelompok penelitian, Raissya Armilla, Ajeng Ristia SP, Nurul
Fathimah, dan Annisa Firdausi yang telah menyemangati, membantu, dan
berjuang bersama dalam penelitian ini.
12. Semua responden yang telah bersedia untuk menjalani penelitian ini.
13. Keluarga besar CSSMoRA UIN Syarif Hidayatullah Jakarta yang selalu
memberikan dukungan.
14. Keluarga besar Alumni PP. Amanatul Ummah yang selalu menyemangati.
Penulis menyadari dalam penyusunan laporan ini masih banyak terdapat kekurangan.
Kritik dan saran yang membangun dari semua pihak akan panulis terima demi laporan
penelitian yang lebih baik. Penulis berharap penelitian ini dapat bermanfaat bagi
masyarakat. Demikian, semoga Allah selalu memberi balasan, rahmat dan ridho-Nya
kepada seluruh pihak yang membantu penelitian ini. Amin.
Wassalamualaikum warahmatullahi wabarakatuh.
Ciputat, 9 Juli 2017
Penulis
vii
ABSTRAK
Moch Rizki Ramadhan. Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter. Identifikasi
Polimorfisme Gen Delta – Aminolevulinic Acid Dehydratase (ALAD) dan
Hubungannya dengan Kejadian Anemia pada Mahasiswa Program Studi
Kedokteran dan Profesi Dokter (PSKPD) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Angkatan 2012 – 2014. 2017.
Aminolevulinic acid dehydratase (ALAD) merupakan enzim yang berfungsi mengkatalis
kondensasi dua molekul Aminolevulinic acid (ALA) menjadi Monopyrrole
porphobilinogen (PBG) dalam proses pembentukan heme. Polimorfisme gen ALAD
diketahui berperan penting pada metabolisme timbal (Pb) di dalam darah. Tujuan
penelitian ini adalah untuk mengetahui adanya polimorfisme genetik ALAD pada
mahasiswa Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter (PSKPD) UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012 – 2014 (N = 102). Metode yang digunakan adalah
Amplification Refractory Mutation System – PCR (ARMS – PCR). Hasil penelitian ini
menunjukkan bahwa genotip ALAD-1/2 memiliki proporsi terbanyak (N = 71) pada
populasi mahasiswa PSKPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012 – 2014.
Kata kunci : ALAD, Pb, ARMS – PCR
viii
ABSTRACT
Moch Rizki Ramadhan. Medicine and Physician Profession Study Program.
Identification of Delta – Aminolevulinic Acid (ALAD) Gene Polymorphism and its
Correlation with Anaemia in Students of Medicine and Physician Profession Study
Program of State Islamic University Syarif Hidayatullah Jakarta Grade 2012 –
2014. 2017.
Aminolevulinic acid dehydratase (ALAD) is an enzyme that catalyzes the condensation
of two mollecules Aminolevulinic acid (ALA) to form Monopyrrole phorpobilinogen
(PBG) in the pathway for heme synthesis. ALAD gene polymorphism is important for
Lead (Pb) metabolism in blood. The purpose of this research is to discover the existance
of ALAD gene polymorphism on the students of medicine and physician profession study
program of State Islamic University Syarif Hidayatullah Jakarta Grade 2012 – 2014 (N
= 102). The method was used Amplification Refractory Mutation System – PCR (ARMS
– PCR). The result of this research show that ALAD – 1/2 genotype has higher
frequencies (N = 71) in the students of medicine and physician profession study program
of State Islamic University Syarif Hidayatullah Jakarta Grade 2012 – 2014 population.
Keywords : ALAD, Pb, ARMS – PCR
ix
DAFTAR ISI
LEMBAR JUDUL ............................................................................................................i
LEMBAR PERNYATAAN ............................................................................................ ii
LEMBAR PERSETUJUAN.......................................................................................... iii
LEMBAR PENGESAHAN ............................................................................................iv
KATA PENGANTAR ..................................................................................................... v
ABSTRAK ..................................................................................................................... vii
ABSTRACT ................................................................................................................... viii
DAFTAR ISI ...................................................................................................................ix
DAFTAR GAMBAR ......................................................................................................xi
DAFTAR TABEL ......................................................................................................... xii
DAFTAR SINGKATAN ............................................................................................. xiii
DAFTAR LAMPIRAN.................................................................................................xiv
BAB 1 PENDAHULUAN ................................................................................................ 1
1.1.Latar Belakang ......................................................................................................... 1
1.2.Rumusan Masalah .................................................................................................... 2
1.3.Hipotesis .................................................................................................................. 3
1.4.Tujuan ...................................................................................................................... 3
Tujuan Umum ............................................................................................................. 3
Tujuan Khusus ............................................................................................................ 3
1.5.Manfaat Penelitian ................................................................................................... 3
Manfaat bagi Peneliti .................................................................................................. 3
Manfaat bagi Institusi ................................................................................................. 3
Manfaat bagi Masyarakat ........................................................................................... 4
Manfaat Klinis ............................................................................................................ 4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ..................................................................................... 5
2.1. Landasan Teori ........................................................................................................ 5
2.1.1. Pencemaran Logam Berat Pb ........................................................................... 5
2.1.2. Polimorfisme Gen ALAD ................................................................................ 9
2.1.3. Efek Terganggunya Enzim ALAD ................................................................. 13
2.1.4. Spektrofotometri UV ...................................................................................... 17
2.1.5. Amplification Refractory Mutation System – Polymerase Chain Reaction
(ARMS – PCR) ............................................................................................... 19
2.2. Kerangka Teori ..................................................................................................... 23
2.3. Kerangka Konsep .................................................................................................. 24
2.4. Definisi Operasional ............................................................................................. 24
x
BAB III METODE PENELITIAN ............................................................................... 26
3.1. Desain Penelitian .................................................................................................. 26
3.2. Waktu dan Tempat Penelitian ............................................................................... 26
3.3. Sampel Penelitian .................................................................................................. 26
3.4. Besar Sampel ........................................................................................................ 26
3.5. Teknik Pengambilan Sampel ................................................................................ 27
3.6. Kriteria Pemilihan Sampel .................................................................................... 27
3.6.1. Kriteria Inklusi ............................................................................................... 27
3.6.2. Kriteria Eksklusi ............................................................................................. 27
3.7. Cara Kerja ............................................................................................................. 27
3.7.1. Perizinan Subjek Penelitian ............................................................................ 27
3.8. Alur Penelitian ...................................................................................................... 28
3.9. Prosedur Penelitian ............................................................................................... 29
3.10. Cara Kerja Penelitian .......................................................................................... 31
3.10.1. Pengumpulan Data ....................................................................................... 31
3.10.2. Desain Primer ............................................................................................... 31
3.10.3. Isolasi DNA .................................................................................................. 32
3.10.4. Amplifikasi Genom dengan ARMS-PCR .................................................... 34
3.10.5. Elektroforesis dan Gel Docummentation System ......................................... 35
3.11. Anaisis Data ........................................................................................................ 37
3.12. Etika Penelitian ................................................................................................... 37
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................................... 38
4.1. Isolasi DNA Genom .............................................................................................. 38
4.2. Identifikasi Genetik ALAD Menggunakan ARMS-PCR ..................................... 39
4.3. Karakteristik Sampel ............................................................................................. 42
4.3.1. Karakteristik Sampel Berdasarkan Jenis Kelamin ......................................... 42
4.3.2. Karakteristik Sampel Berdasarkan Usia ......................................................... 42
4.3.3. Hasil Pemeriksaan Kadar Hemoglobin .......................................................... 43
4.3.4. Hubungan Polimorfisme Genetik ALAD dengan Jenis Kelamin .................. 44
4.3.5. Hubungan Polimorfisme Genetik ALAD dengan Kejadian Anemia ............. 45
4.4. Keterbatasan Penelitian ......................................................................................... 47
BAB V SIMPULAN DAN SARAN .............................................................................. 48
5.1. Simpulan ............................................................................................................... 48
5.2. Saran ..................................................................................................................... 48
PERNYATAAN PENELITIAN ................................................................................... 49
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................... 50
LAMPIRAN ................................................................................................................... 56
xi
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1. Mekanisme Multi – Organ Failure Akibat Paparan Pb................................ 8
Gambar 2.2. Proses Pembentukan Protein ....................................................................... 10
Gambar 2.3. Proses Pembentukan Heme ......................................................................... 12
Gambar 2.4. Proses Pembentukan PBG dari 2 Molekul ALA yang Dikatalis oleh Enzim
ALAD ......................................................................................................... 13
Gambar 2.5. Molekul Hemoglobin .................................................................................. 14
Gambar 2.6. Proses Pembentukan dan Degradasi Eritrosit ............................................. 15
Gambar 2.7. Klasifikasi Anemia Berdasarkan Indeks Eritrosit ....................................... 15
Gambar 2.8. Etiologi Anemia Mikrositik Hipokromik ................................................... 16
Gambar 2.9. Perbandingan Kadar DNA dan Protein dengan Panjang Gelombang Pada
Pemeriksaan dengan Spektrofotometri UV ................................................ 17
Gambar 2.10. Perbandingan Kadar U, MU, DMU, FU, dan Timin dengan Panjang
Gelombang Pada Pemeriksaan dengan Spektrofotometri UV .................... 18
Gambar 2.11. Desain Primer pada ARMS-PCR.............................................................. 20
Gambar 2.12. Tabel Pasangan Basa pada Desain Primer ARMS ................................... 21
Gambar 2.13. Tahap Identifikasi Polimorfisme Genetik ALAD dengan ARMS-PCR dan
Elektroforesis .............................................................................................. 22
Gambar 4.1. Deteksi Kualitatif DNA Genom dengan Elektroforesis ............................. 39
Gambar 4.2. Hasil PCR Tahap 1 ..................................................................................... 39
Gambar 4.3. Hasil PCR Tahap 2 ..................................................................................... 40
Gambar 4.4. Hubungan Polimorfisme Genetik ALAD dengan Jenis Kelamin ............... 44
Gambar 4.5. Hubungan Polimorfisme Genetik ALAD dengan Kejadian Anemia ......... 45
xii
DAFTAR TABEL
Tabel 2.1. Definisi Operasional ....................................................................................... 24
Tabel 3.1. Alat dan Bahan Penelitian .............................................................................. 29
Tabel 3.2. Primer yang Digunakan pada Proses PCR ..................................................... 31
Tabel 3.3. Tahapan Isolasi Genom DNA ........................................................................ 32
Tabel 3.4. Komposisi Mix PCR pada PCR Tahap 1 ........................................................ 34
Tabel 3.5. Komposisi Mix PCR pada PCR Tahap 2 ........................................................ 35
Tabel 3.6. Tahapan Elektroforesis ................................................................................... 36
Tabel 4.1. Data Kemurnian DNA Genom Mahasiswa Program Studi Kedokteran dan
Profesi Dokter UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012 – 2014 ..... 38
Tabel 4.2. Hasil Identifikasi Polimorfisme Genetik ALAD pada Mahasiswa Program
Studi Kedokteran dan Profesi Dokter UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Angkatan 2012 - 2014 ................................................................................... 41
Tabel 4.3. Deskripsi Sampel Berdasarkan Jenis Kelamin ............................................... 42
Tabel 4.4. Deskripsi Sampel Berdasarkan Usia .............................................................. 43
Tabel 4.5. Hasil Pemeriksaan Kadar Hemoglobin .......................................................... 43
xiii
DAFTAR SINGKATAN
ALA Aminolevulinic Acid
ALAD ẟ - Aminolevulinic Acid Dehydratase
ALAS ẟ - Aminolevulinic Acid Synthase
APA American Pediatric Association
ARMS Amplification Refractory Mutation System
CDC Centers for Disease Control and Prevention
DNA Deoxyribonucleic Acid
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
Fe Ferrum (Zat Besi)
GABA γ – Aminobutiric Acid
Hb Haemoglobin
MCH Mean Cell Haemoglobin / Mean Corpuscular Haemoglobin
MCHC Mean Cell Haemoglobin Concentration / Mean
Corpuscular Haemoglobin Concentration
MCV Mean Cell Volume / Mean Corpuscular Volume
NHANES National Health and Nutrition Examination Survey
NMDA N – Methyl – D – Aspartate
Pb Plumbum (Timbal)
PBG Phorpobilinogen
PCR Polymerase Chain Reaction
PSKPD Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
RNA Ribonucleic Acid
ROS Reactive Oxygen Species
TIBC Total Iron Binding Capacity
UIN Universitas Islam Negeri
UV Ultra Violet
Zn Zink
xiv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Lembar Persetujuan Responden ........................................................ 56
Lampiran 2. Lembar Persetujuan Etik (Ethical Approval) .................................... 57
Lampiran 3. Gen ALAD pada Manusia ................................................................. 58
Lampiran 4. Alat dan Bahan Penelitian ................................................................ 59
Lampiran 5. Hasil Isolasi DNA Genom ................................................................. 61
Lampiran 6. Hasil Kemurnian dan Konsentrasi DNA Sampel .............................. 62
Lampiran 7. Hasil PCR Tahap 1 ............................................................................ 66
Lampiran 8. Karakteristik Sampel ......................................................................... 69
Lampiran 9. Hasil Analisis Statistik ...................................................................... 75
Lampiran 10. Nilai Normal Pemeriksaan Hematologi Eritrosit ............................ 83
Lampiran 11. Curriculum Vitae Peneliti ................................................................ 84
1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Logam merupakan zat yang memiliki konduktivitas listrik yang tinggi, dan
dapat melepaskan elektronnya untuk membentuk kation. Logam ditemukan secara
bebas di alam dan komposisinya berbeda di setiap tempat. Hal ini disebabkan oleh
faktor lingkungan serta variasi sifat dari logam itu sendiri. Logam berat merupakan
polutan yang banyak ditemukan di lingkungan dan sifat toksiknya dapat
menimbulkan permasalahan yang serius dalam lingkup kesehatan. Timbal (Pb)
merupakan salah satu logam yang memiliki toksisitas tinggi dan banyak terkandung
dalam bahan industri, makanan, rokok, dan air minum. Sumber Pb ini berasal dari
bahan bakar minyak, cat, pipa, baterai, mainan dan kran.[1, 2]
Berdasarkan pemantauan Kementrian Lingkungan Hidup Republik
Indonesia, emisi transportasi terbukti sebagai penyumbang pencemaran udara
tertinggi di Indonesia yaitu sekitar 85%. Menurut Environtment Project Agency
pada kendaraan bermotor sekitar 25% Pb tetap berada di dalam mesin dan 75%
lainnya akan mencemari udara sebagai asap knalpot.[3]. Pb dapat masuk ke dalam
tubuh melalui proses pencernaan, pernapasan, dan paparan langsung terhadap kulit.
Pb yang masuk ke dalam tubuh akan menyebar melalui aliran darah. Bentuk kimia
Pb merupakan faktor penting yang memengaruhi sifat Pb di dalam tubuh.
Komponen Pb organik misalnya tetraethil Pb dapat langsung terabsorbsi melalui
kulit dan membran mukosa. Pb organik diabsorbsi terutama melalui saluran
pencernaan dan pernafasan. Pb akan menumpuk di dalam tubuh karena dipengaruhi
ukuran partikelnya.[4]
Paparan Pb dapat memengaruhi kesehatan manusia, salah satunya dapat
memengaruhi perkembangan intelektual pada bayi dan anak. Selain itu dapat pula
memengaruhi fungsi kognitif orang dewasa. Penelitian sebelumnya menunjukkan
bahwa jumlah Pb yang tinggi di dalam tubuh berhubungan dengan hipertensi,
penyakit vaskular perifer, naiknya angka mortalitas pada orang dewasa, kelainan
reproduksi, kelainan ginjal, dan fungsi imun.[5]
2
Setiap individu memiliki kemampuan beradaptasi terhadap adanya paparan
logam berat yang berbahaya ini. Salah satu gen yang mengontrol metabolisme Pb
didalam tubuh adalah ALAD. ALAD merupakan enzim yang berfungsi mengkatalis
langkah ke – 2 dalam proses pembentukan heme, yaitu mengubah 2 molekul
aminolevulinic acid menjadi monopyrrole porphobilinogen.[6] Interaksi antara Pb
dengan tubuh dapat memunculkan adanya variasi genetik ALAD.[7] Variasi genetik
dalam sebuah populasi sebanyak 1% atau lebih disebut dengan polimorfisme.[8, 9]
Gen yang mengkode pembentukan ALAD terletak pada kromosom 9q34 dan
diekspresikan di seluruh jaringan tubuh, namun memilki kadar lebih tinggi pada
eritrosit dan hati.[10]
Studi epidemiologi yang dilakukan di Eropa, Asia, dan Amerika
menyatakan bahwa proporsi ALAD berbeda antar populasi.[11] Variasi yang terjadi
pada gen ALAD memungkinkan seseorang mengalami gangguan terhadap
metabolisme Pb didalam tubuh. Penumpukan Pb didalam jaringan tubuh diduga
dapat menyebabkan kelainan pada organ dan penyakit.[12] Pb berkompetisi dengan
Zn pada active site enzim ALAD sehingga dapat mengganggu proses sintesis heme.
Sifat toksik Pb terhadap eritrosit sangat besar, karena 90% Pb dalam darah terikat
oleh hemoglobin. Proses sintesis heme yang terganggu menyebabkan munculnya
anemia mikrositik hipokromik. Banyak etiologi penyebab anemia mikrositik
hipokromik salah satunya adalah thalassemia dan anemia defisiensi besi.[5, 12]
Karena pentingnya peranan gen ALAD dalam perjalanan biologis Pb, maka
perlu adanya identifikasi polimorfisme genetik ALAD sehingga diharapkan dapat
meminimalisasi kemungkinan anemia dan penyakit lain yang ditimbulkan oleh
polimorfisme genetik tersebut.
1.2. Rumusan Masalah
a. Apakah terdapat polimorfisme genetik ALAD pada populasi mahasiswa
PSKPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012 – 2014 ?
b. Apakah terdapat hubungan antara polimorfisme genetik ALAD dengan
kejadian anemia pada populasi mahasiswa PSKPD UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012 – 2014 ?
3
1.3. Hipotesis
a. Terdapat polimorfisme genetik ALAD pada populasi mahasiswa
PSKPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012 – 2014.
b. Terdapat hubungan antara polimorfisme genetik ALAD dengan
kejadian anemia pada populasi mahasiswa PSKPD UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012 – 2014.
1.4. Tujuan Penelitian
1.4.1. Tujuan Umum
Tujuan umum dari penelitian ini adalah untuk mengetahui adanya
polimorfisme genetik ALAD dan hubungannya dengan kejadian anemia.
1.4.2. Tujuan Khusus
Tujuan khusus dari penelitian ini adalah:
1. Untuk mengetahui adanya polimorfisme genetik ALAD pada Mahasiswa
PSKPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012 – 2014
2. Untuk mengetahui kejadian anemia pada mahasiswa PSKPD UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012 – 2014.
3. Untuk mengetahui hubungan antara polimorfisme genetik ALAD dengan
kejadian Anemia pada mahasiswa PSKPD UIN Syarif Hidayatullah
Jakarta Angkatan 2012 – 2014.
1.5.Manfaat Penelitian
1.5.1. Manfaat bagi Peneliti
Manfaat penelitian ini bagi peneliti adalah menambah ilmu pengetahuan
tentang gen ALAD dalam bidang penelitian biomolekular.
1.5.2. Manfaat bagi Institusi
Penelitian ini dapat digunakan sebagai referensi penelitian di Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta dan juga dapat
digunakan sebagai bahan untuk melakukan penelitian lebih dalam bagi peneliti
yang lain.
4
1.5.3. Manfaat bagi masyarakat
Penelitian ini dapat memberikan informasi tentang polimorfisme genetik
ALAD yang dapat memengaruhi perbedaan perjalanan biologis Pb di dalam tubuh.
1.5.4. Manfaat klinis
Penelitian ini dapat memberikan informasi bahwa dengan mengetahui
adanya polimorfisme genetik ALAD dapat menjadi informasi / pengetahuan
tentang kepekaan seseorang terhadap toksisitas Pb dengan variasi pada gen
Diharapkan kedepannya dapat dikembangkan kegiatan berupa penyuluhan dan
pencegahan terhadap toksisitas Pb untuk mengurangi angka penyakit yang
ditimbulkan karena paparan Pb.
5
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Landasan Teori
2.1.1. Pencemaran Logam Berat Pb
Pb merupakan logam berat yang sangat toksik dan dapat menyebabkan
kontaminasi lingkungan. Karena sifatnya yang toksik tersebut, Pb dapat
menyebabkan munculnya masalah kesehatan di seluruh dunia.[1] Pb dapat masuk ke
dalam tubuh melalui proses pencernaan, pernapasan, dan paparan langsung
terhdapat kulit. Pb yang masuk ke dalam tubuh akan menyebar melalui aliran
darah.[4] Pada orang dewasa rata – rata Pb yang terabsorbsi dapat mencapai 10 –
15% dari total Pb yang masuk. Sedangkan pada bayi, anak, dan wanita hamil Pb
yang terabsorbsi dapat meningkat hingga 50%. Selain itu, kadar Pb dalam darah
juga meningkat pada anak yang mengalami kekurangan konsumsi besi, kalsium,
fosfor, dan zink.[13] Pb adalah logam yang dapat teroksidasi apabila kontak dengan
udara. Sumber Pb berasal dari bahan bakar minyak, cat rumah, pipa air, kran air,
baterai, dan juga mainan.[1]
Setelah Pb memasuki aliran darah, 99% Pb yang bersirkulasi akan berikatan
dengan eritrosit dan bertahan 30 hingga 35 hari. Pb yang bersirkulasi di dalam tubuh
ini akan tersebar ke beberapa jaringan yaitu hati, korteks ginjal, otak, paru, limpa,
gigi, dan tulang selama 4 – 6 minggu. Karena waktu paruh yang sebentar di dalam
pembuluh darah, kadar Pb dalam darah tidak dapat digunakan sebagai alat
diagnostik ketika paparan telah terjadi lebih dari 6 minggu. Pada orang dewasa 80
– 95% Pb yang masuk akan disimpan di dalam tulang. Sedangkan pada anak hanya
70% Pb saja yang disimpan di dalam tulang. Hal ini menunjukkan bahwa kadar Pb
yang berada di dalam jaringan lunak lebih besar pada anak dibandingkan dengan
dewasa. Pb disimpan di dalam tulang untuk waktu yang cukup lama yaitu 20 – 30
tahun.[14]
Studi sebelumnya mengatakan bahwa lebih dari 1/3 masa tulang orang
dewasa mengandung Pb karena adanya paparan pada masa anak dan remaja,
meskipun terdapat mekanisme bone turnover pada masa tersebut. Dari bukti
6
tersebut dapat disimpulkan bahwa kadar Pb yang berada di dalam tulang bertambah
seiring dengan bertambahnya usia. Kadar Pb di dalam tulang tibia pada usia remaja
3 µg/g, pada dewasa usia 30 – 50 tahun 17 µg/g, dan pada dewasa usia lebih dari
75 tahun mencapai 30 µg/g. Beberapa keadaan seperti kehamilan, menyusui,
osteoporosis pasca menopause, hipertiroid, dan kemoterapi sisplatin, menunjukkan
adanya peningkatan level Pb dalam darah. Hal ini terjadi akibat adanya mekanisme
bone turnover yang terjadi pada keadaan tersebut. Pb dalam tulang ibu juga dapat
ditransfer ke dalam tulang bayi melalui plasenta saat masa kehamilan.[14, 15] Pb
dapat melalui barier plasenta dimulai pada minggu ke 12 kehamilan dan terus
berlanjut hingga kelahiran. Kadar Pb di darah korda umbilikus mencapai 80 – 100%
kadar Pb darah maternal.[13]
Pb inorganik tidak dimetabolisme, namun langsung diekskresikan tanpa
diubah utamanya melalui urin. Pb dapat diekskresikan dalam jumlah sedikit melalui
feses, kuku dan keringat, sedangkan 1/3 Pb dari dalam tubuh dapat diekskresikan
melalui empedu, cairan lambung, dan saliva.[8] Pb organik atau alkyl-lead akan
dimetabolisme menjadi metabolit yang neurotoksik melalui proses dealkilasi
oksidatif. Di hati, reaksi ini dikatalis dengan sitokrom P450 – dependent
monooxygenase system.[4]
Pada tahun 2012 CDC (Centers for Disease Control and Prevention) dan
APA (American Pediatric Association) melakukan studi terkait kadar Pb dalam
darah manusia. Mereka menyimpulkan bahwa adanya peningkatan kadar Pb dalam
darah anak hingga 5 µg/dl dapat mengindikasikan anak tersebut telah terpapar oleh
Pb melebihi batas normal paparan Pb pada anak.[14, 16] Batas normal paparan Pb
pada anak didapat berdasarkan data dari NHANES (National Health and Nutrition
Examination Survey) tahun 2007 – 2008 dan 2009 – 2010.[9] Anak lebih rentan
terkena paparan Pb karena aktivitas anak yang cenderung hand-to-mouth dan
tingginya kemampuan absorbsi saluran cerna pada anak. Hingga tahun 2012, CDC
masih menetapkan bahwa kadar normal Pb dalam darah anak adalah < 10 µg/dl.[16,
17] Ketetapan tersebut juga berlaku pada bayi dan ibu hamil. Pada pekerja yang
terpapar Pb, kadar Pb dalam darah menjadi tidak aman apabila > 30 µg/dl.[14, 16]
7
Kadar Pb yang melebihi batas normal dalam darah dapat mengganggu
perkembangan dan fungsi organ tubuh. Organ yang paling sering terganggu adalah
darah, saraf, hati, dan ginjal. Pb dapat memengaruhi sintesis heme melalui 3 enzim
yaitu, ALAD (Delta Aminolevulinic Acid Dehydratase), ALAS (Delta
Aminolevulinic Acid Synthase), dan Ferrochelatase. Inhibisi enzim ALAD dimulai
dari minimal kadar Pb dalam darah 5 µg/dl. Pada kadar Pb dalam darah 16 µg/dl,
sebanyak 50% enzim ALAD menjadi tidak teraktivasi, sedangkan pada kadar Pb
dalam darah sebanyak 55 µg/dl, sebanyak 90% enzim ALAD menjadi tidak
teraktivasi. Ferrochelatase merupakan enzim yang mengkatalis pengikatan zat besi
(Fe) ke dalam cincin phorphirin. Sebagai hasil dari toksisitas Pb ini, kerja enzim
Ferrochelatase dapat terhambat dan jalur pembentukan Hb akan terganggu, atau
apabila zat besi yang adekuat tidak tersedia, zink dapat menggantikan zat besi ini
dan kadar zink-protoporphirin akan meningkat. Akibatnya adalah penurunan level
Hb yang bisa kita sebut sebagai anemia.[10, 18]
Selain memengaruhi fungsi darah, munculnya Pb dapat memengaruhi
sistem saraf pusat secara langsung. Umumnya gangguan terhadap sistem saraf
terjadi pada masa anak, saat terjadi berbagai proses pertumbuhan sel – sel saraf. Pb
dapat memengaruhi pelepasan neurotransmitter, merusak fungsi sistem
GABAergik, dopaminergik, dan kolinergik dengan cara menginhibisi kanal ion
NMDA (N- Methyl D- Aspartate) saat fase neonatus. Sebuah studi in vitro
menunjukkan bahwa Pb dapat mengaktivasi protein kinase C di sel kapiler serta
menginhibisi Na+/K+ - ATPase di membran sel sehingga mengganggu proses
metabolisme yang terjadi. Di dalam sel, Pb dapat memengaruhi pelepasan kalsium
dari mitokondria sehingga menyebabkan terbentuknya ROS (reactive oxygen
species), hal ini dapat mempercepat kematian sel.[18] Akibat dari adanya kerusakan
di dalam sel ini, dapat memengaruhi fungsi sel – sel saraf, mulai dari neuron sebagai
unit fungsional saraf, dan juga sel penyokong saraf seperti sel schwann, astrosit,
dan oligodendrosit.[19]
Pengaruh paparan Pb terhadap sel tidak hanya terjadi pada sel saraf saja
namun dapat juga memengaruhi fungsi sel di organ lainnya, salah satunya adalah
ginjal. Efek akut yang terjadi akibat paparan Pb terhadap ginjal adalah kerusakan
struktural tubulus proksimal. Dalam proses yang lebih lanjut, paparan Pb juga dapat
8
merusak struktur glomerulus, tubulus distal, dan sistem renin-angiotensin yang
sangat memengaruhi fungsi ginjal dalam mengatur cairan dalam tubuh.[20, 21]
Gambar 2.1. Mekanisme Multi-organ Failure Akibat Paparan Pb [14]
Hati merupakan organ yang memiliki fungsi detoksifikasi. Fungsi
detoksifikasi ini ditunjukkan dengan adanya CYP450 yang tersedia di dalam sel
hati. Secara umum fungsi detoksifikasi bertujuan untuk menjaga tubuh dari
9
komponen xenobiotik (bahan kimia berbahaya dari luar tubuh) yang bersifat toksik.
Paparan Pb dapat menginhibisi aktivitas CYP450, sehingga menyebabkan fungsi
detoksifikasi hati menurun. Hal ini dapat menyebabkan kerusakan pada sel hati
akibatnya dapat menurunkan berbagai fungsi hati yang sangat penting bagi
tubuh.[14, 20] Mekanisme secara ringkas dapat dilihat pada gambar 2.1
2.1.2. Polimorfisme Gen ALAD
Gen adalah unit dasar fisik dan unit herediter. Gen terbentuk dari beberapa
DNA yang berfungsi sebagai penyandi pembentukan molekul protein. Sedangkan
genom adalah suatu kesatuan gen yang secara alami dimiliki oleh organisme
prokariot maupun eukariot.[22] DNA (deoxyribonucleic acid) merupakan material
herediter pada manusia dan organisme pada umumnya. DNA terletak di 2 tempat
yaitu di dalam nukleus (nuclear DNA) dan di dalam mitokondria (mitochondrial
DNA). Informasi di dalam DNA disimpan sebagai kode yang terdiri atas 4 basa
kimia yaitu adenin (A), guanin (G), sitosin (C), dan timin (T). Basa DNA tersebut
saling berpasangan, A berpasangan dengan T, dan C berpasangan dengan G untuk
membentuk sebuah unit yang disebut pasangan basa. Setiap basa juga berpasangan
dengan molekul gula dan satu molekul fosfat yang kesatuan ini disebut sebuah
nukleotida. Nukleotida ini tersusun menjadi 2 rantai panjang berbentuk spiral yang
disebut dengan double helix. Informasi di dalam DNA dapat diperbanyak melalui
proses replikasi sel.[24]
Informasi genetik yang terkandung di dalam DNA ini akan diekspresikan
menjadi bentuk protein yang dapat meregulasi berbagai aktivitas di dalam tubuh.
Sebuah sel memiliki kemampuan untuk mengatur mana saja informasi genetik yang
akan diterjemahkan menjadi sebuah protein. Selanjutnya bagian informasi yang
sudah terpilih untuk diterjemahkan akan ditranskripsi menjadi single strain RNA
(ribonucleic acid). Kemudian RNA ini akan ditranspor ke sitoplasma untuk
mengikuti proses translasi, RNA ini disebut mRNA (mesengger ribonucleic acid).
mRNA yang sudah berada di dalam sitoplasma, tidak langsung ditranslasi begitu
saja, namun akan diseleksi mana saja mRNA yang bisa ditranslasi menjadi protein
atau didegradasi menjadi mRNA inaktif oleh ribosom. Setelah proses seleksi,
mRNA yang terpilih akan ditranslasi menjadi protein. Di dalam tubuh, protein ini
10
akan disimpan dan akan diaktivasi sesuai dengan kebutuhan tubuh. [25, 26] (Gambar
2.2)
Gambar 2.2. Proses Pembentukan Protein [25]
Gen ALAD pada manusia terletak di kromosom 9q34. ALAD memiliki
polimorfisme genetik yang memodifikasi perjalanan toksik dari Pb.[27]
Polimorfisme adalah sebuah variasi sekuens DNA yang terjadi di dalam sebuah
populasi dengan frekuensi sebanyak 1% atau lebih. Tingginya kejadian pada
populasi menunjukkan bahwa polimorfisme terjadi secara natural. Polimorfisme
dapat bersifat netral sebagai variasi saja, atau dapat bermakna sebagai alasan
munculnya permasalahan kesehatan di dalam populasi tersebut.[28]
Polimorfisme ALAD muncul dari transversi G menjadi C pada posisi basa
ke 177. Transversi ini menyebabkan munculnya 2 alel yaitu ALAD-1 dan ALAD-
2 serta munculnya 3 fenotip yaitu ALAD-1, ALAD-1/2, dan ALAD-2. Alel ALAD-
2 mengandung substitusi asam amino asparagin menjadi lisin. Enzim ALAD yang
terbentuk dari kedua alel ini memiliki fungsi yang sama, namun memiliki muatan
elektron yang berbeda. Asparagin merupakan asam amino yang bersifat netral,
sedangkan lisin merupakan asam amino yang lebih bermuatan positif. Oleh karena
itu, gen ALAD-1/2 (heterozigot) memproduksi enzim yang lebih tinggi
keelektronegatifannya dibandingkan dengan ALAD-1 (homozigot), selain itu
ALAD-2 (homozigot) memproduksi enzim yang lebih elektronegatif dibandingkan
dengan ALAD-1/2.[29]
11
Subyek yang memiliki genotip ALAD-1/2 dan ALAD-2 memiliki
kerentanan yang lebih tinggi terhadap peningkatan level Pb dalam darah
dibandingkan dengan subjek yang memiliki genotip ALAD-1.[30] Hal ini
dikarenakan Pb akan lebih kuat terikat dengan ALAD yang memiliki muatan
elektronegatif yang tinggi. Ikatan yang kuat menyebabkan Pb lebih lama bertahan
di dalam darah, sehingga efek toksik Pb akan lebih berat. Saat Pb mengikat ALAD
dan menghambat aktivitasnya, subjek yang memiliki genotip ALAD-2 lebih baik
dalam mengkompensasi Pb dibandingkan dengan ALAD-1. Hal ini lebih jelas
terjadi pada populasi dengan paparan Pb yang tinggi dan lama. Ketika Pb mengikat
active site enzim ALAD, maka ALAD akan berespon dengan cara meningkatkan
produksinya. Dengan adanya mekanisme kompensasi tersebut, pada populasi
dengan paparan Pb tinggi dan lama akan ditemukan inhibisi sintesis heme yang
lebih ringan dibandingkan dengan subjek yang memiliki genotip ALAD-1. Dapat
kita lihat bahwa kadar ALAD yang terhambat oleh karena aktivitas toksik Pb
berbanding lurus dengan kadar ALA (aminolevulinic acid) yang tidak di proses di
dalam sitoplasma sel. Sehingga dapat disimpulkan bahwa makin sedikit enzim
ALAD yang tidak aktif, maka makin banyak kadar ALA yang beredar di
sitoplasma. ALA merupakan asam yang bersifat toksik bagi tubuh.[11, 29, 30]
Studi epidemiologi yang dilakukan di Eropa, Asia, dan Amerika
menyatakan bahwa frekuensi genotip ALAD-2 tertinggi terdapat pada ras kaukasia
dengan proporsi ALAD-1/2 hanya 18% dan ALAD-1 hanya mencapai 1% saja dari
total populasi. Sebaliknya, pada populasi ras afrika dan asia sedikit ditemukan
subjek dengan genotip ALAD-2.[11] Pada subjek yang memiliki genotip ALAD-2
dan ALAD-1/2 ditemukan adanya penurunan kadar zink-protoporphirin di dalam
darah akibat afinitasnya yang lebih tinggi terhadap molekul Pb. Selain itu karena
ikatan yang lebih kuat ini menyebabkan Pb lebih banyak disimpan di dalam tulang.
Hal ini diperkuat dengan meningkatnya kadar Pb di dalam matriks tulang
dibandingkan dengan kadar Pb di korteks tulang.[11, 31]
ALAD merupakan enzim yang sangat penting bagi tubuh sehingga apabila
enzim ini tidak berfungsi akan menyebabkan munculnya manifestasi klinis yang
cukup berat bagi tubuh. ALAD merupakan enzim ke-dua dalam jalur pembentukan
heme. Enzim ini mengkatalis kondensasi 2 molekul ALA untuk membentuk 1
12
molekul PBG (phorphobilinogen).[6,10] Fungsi ALAD di dalam proses
pembentukan heme akan dijelaskan pada gambar (Gambar 2.3)
Gambar 2.3. Proses Pembentukan Heme [10]
ALAD merupakan enzim yang terletak di dalam sitoplasma. Enzim ALAD
merupakan enzim tetramer homodimer yang memiliki 8 subunit yang identik
dengan 1 active site di setiap dimernya. Enzim ini mengikat 8 atom zink di setiap
subunitnya. 4 molekul zink berfungsi sebagai katalisator dan 4 molekul zink sisanya
berfungsi sebagai stabilisator struktur tersier enzim ALAD. Setiap active site akan
mengikat 2 molekul ALA di 2 posisi yang berbeda. Satu molekul ALA
berkontribusi sebagai sisi asam asetat dan grup amino-metil dari PBG, sedangkan
satu molekul ALA yang lain berkontribusi sebagai sisi rantai propionat dan nitrogen
pirol (Gambar 2.4). Pb menginhibisi aktivitas enzim ALAD dengan cara mengganti
13
posisi atom zink dari active site enzim ALAD. Sehingga aktivitas enzim ALAD
akan terganggu. Sebagai hasilnya adalah adanya penumpukan ALA di dalam
plasma darah.[10]
Gambar 2.4. Proses Pembentukan PBG (Phorpobilinogen) dari 2 molekul ALA
(Aminolevulinic Acid) yang dikatalis oleh enzim ALAD (delta-Aminolevulinic
Acid Dehydratase) [10]
2.1.3. Efek Terganggunya Enzim ALAD
ALAD merupakan enzim yang sangat penting dalam proses sintesis
hemoglobin. Hemoglobin adalah komponen yang berfungsi sebagai alat
transportasi oksigen dan karbon dioksida. Hb tersusun dari globin (4 rantai protein
yang terdiri atas 2 unit alfa dan 2 unit beta) dan heme (mengandung atom Fe (besi)
dan porfirin yang mengandung pigmen merah darah) (Gambar 2.5). Satu gram
hemoglobin akan mengikat oksigen sebanyak 1,34 ml. Kapasitas pengangkutan
oksigen ini bergantung pada kadar hemoglobin, bukan kadar sel darah merah.
Proses pembentukan heme mayoritas berada di mitokondria dengan berbagai reaksi
kimia yang diawali dengan kondensasi glisin dengan suksinil-koA. Vitamin B6
merupakan koenzim untuk reaksi pembentukan heme ini, vitamin B6 distimulasi
oleh eritropoietin.[32, 33]
Hemoglobin berada di dalam eritrosit. Setiap eritrosit mengandung kurang
lebih 280 juta molekul hemoglobin. Eritrosit hidup hanya sekitar 120 hari karena
ketebalan membran plasma yang makin berkurang akibat adanya kemampuan
14
eritrosit untuk diapedesis atau menembus kapiler pembuluh darah. Eritrosit tidak
memiliki nukleus dan organel sehingga tidak dapat menyintesis komponen yang
dibutuhkan untuk memperbaiki bagian eritrosit yang rusak. Sehingga eritrosit akan
dihancurkan dan dibentuk kembali menjadi eritrosit yang baru.[34] (Gambar 2.6)
Gambar 2.5. Molekul Hemoglobin [34]
Anemia adalah penurunan kadar hemoglobin di bawah batas normal
menurut usia dan jenis kelamin. Penurunan kadar hemoglobin biasanya disertai
dengan turunnya kadar eritrosit dan volume sel namun bisa saja normal pada
beberapa subjek dengan kadar hemoglobin yang dibawah nilai normal. Penurunan
kadar volume plasma (pada kasus dehidrasi) dapat memunculkan anemia palsu,
sebaliknya peningkatan volume plasma (pada penderita splenomegali atau pada
kehamilan) dapat menyebabkan anemia bahkan dengan kadar eritrosit dan massa
hemoglobin yang normal bersirkulasi.[32, 35] Secara umum, jumlah hemoglobin
kurang dari 12 mg/dl menunjukkan anemia. Pada penentuan status anemia, jumlah
total hemoglobin lebih penting daripada jumlah eritrosit. Nilai normal hemoglobin
menurut Kementrian Kesehatan Republik Indonesia tahun 2011 adalah untuk pria :
13 – 18 g/dl; sedangkan pada wanita : 12 – 16 g/dl.[36]
15
Gambar 2.6. Proses Pembentukan dan Degradasi Eritrosit [34]
Selain diklasifikasikan menurut kadar Hb, klasifikasi anemia yang lebih
banyak digunakan adalah dengan mengukur indeks eritrosit. Menurut indeks
eritrosit, anemia diklasifikasikan menjadi 3 jenis yaitu, mikrositik, normositik, dan
makrositik (gambar 2.7). Metode klasifikasi menurut indeks eritrosit juga lebih
memperjelas bagaimana patofisiologi anemia tersebut.[32]
Gambar 2.7. Klasifikasi Anemia Berdasarkan Indeks Eritrosit [32]
16
Dari tabel tersebut dapat kita ketahui bahwa paparan Pb dapat menyebabkan
terjadinya anemia mikrositik hipokromik. Hal ini berhubungan dengan proses
inhibisi aktivitas ALAD oleh Pb. Secara etiologi anemia akibat paparan Pb lebih
sedikit dibandingkan dengan anemia defisiensi besi. Namun gambaran anemia
defisiensi besi sama dengan anemia akibat paparan Pb, yaitu anemia mikrositik
hipokromik. Selain itu thalassemia juga memberikan gambaran yang sama berupa
anemia mikrositik hipokromik (Gambar 2.8).[6, 32, 37] Dengan berbagai etiologi
penyebab anemia mikrositik hipokromik tersebut, dapat kita simpulkan bahwa
penanganan anemia mikrositik hipokromik harus disesuaikan dengan etiologinya.
Contohnya pada kasus anemia mikrositik hipokromik dengan etiologi defisiensi
besi tentunya memerlukan penanganan berupa suplemen besi, namun berbeda
dengan anemia mikrositik hipokromik dengan etiologi keracunan Pb yang tidak
membutuhkan suplemen besi. Apabila penanganan tidak sesuai dengan etiologinya
dapat menimbulkan komplikasi yang cukup berat. Pemberian suplemen besi pada
pasien anemia bukan karena defisiensi besi akan menimbulkan penyakit lain yang
disebut iron overload. [38, 39]
Gambar 2.8. Etiologi Anemia Mikrositik Hipokromik [32]
17
2.1.4. Spektrofotometri UV
Spektrofotometri adalah metode yang bekerja berdasarkan prinsip
kemampuan sebuah molekul untuk menyerap sinar UV. Spektrofotometri dapat
digunakan untuk mengukur konsentrasi dan kemurnian DNA dan RNA sebelum
dilakukan PCR. Purin dan pirimidin yang terkandung dalam asam nukleat DNA
atau RNA dapat mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang 260 nm.
Absorbsi 1A unit setara dengan konsentrasi DNA sebanyak 50 µg/ml dan setara
dengan konsentrasi RNA sebanyak 40 µg/ml. Sehingga dapat disimpulkan
konsentrasi DNA (µg/ml) adalah hasil perkalian Abs260 (daya serap molekul
terhadap sinar UV dalam satuan A) dikalikan 50.[40]
DNA memiliki kemampuan untuk menyerap sinar UV (Ultra Violet)
dengan baik pada panjang gelombang 260 nm. Pada panjang gelombang 280 nm
kemampuan DNA untuk menyerap sinar UV menurun hingga setengah dari
penyerapan pada panjang gelombang 260 nm (Gambar 2.9). Selain DNA, molekul
protein dan RNA juga dapat terdeteksi saat proses deteksi DNA genom
menggunakan spetrofotometer ini. Protein dapat menyerap sinar UV dengan baik
pada panjang gelombang 230 nm dan 280 nm. Ikatan peptida yang terdapat pada
molekul protein akan menyerap sinar UV pada panjang gelombang 230 nm,
sedangkan asam amino aromatik (triptofan, tirosin, dan fenilalanin) akan menyerap
sinar UV pada panjang gelombang 280 nm (Gambar 2.9).[41]
Gambar 2.9. Perbandingan Kadar DNA dan Protein dengan Panjang Gelombang
Pada Pemeriksaan dengan Spektrofotometri UV [41]
18
RNA memiliki basa nitrogen Urasil yang dapat menyerap sinar UV dengan
baik pada panjang gelombang 259 nm, sedangkan DNA memiliki basa nitrogen
Timin yang dapat menyerap sinar UV dengan baik pada panjang gelombang 265
nm. Karena selisih yang tidak jauh antara panjang gelombang Urasil (256 nm) dan
Timin (265 nm) menyebabkan RNA dan DNA sulit dibedakan menggunakan
spektrofotometri UV. Selain itu perbedaan jumlah basa nitrogen yang terkandung
di dalam RNA dan DNA dapat mempengaruhi panjang gelombang pada
spektrofotometri UV (Gambar 2.10).[42]
Gambar 2.10. Perbandingan Kadar U (Urasil), MU (Metil-Urasil), DMU (Dimetil-
Urasil), FU (Fluoro-Urasil), dan Timin dengan Panjang Gelombang Pada
Pemeriksaan dengan Spektrofotometri UV [42]
Pada penjelasan sebelumnya diketahui bahwa DNA genom akan terdeteksi
dengan baik pada 2 panjang gelombang spektrofotometri yang berbeda yaitu 260
nm dan 280 nm. Sehingga dapat digunakan rasio A260/A280 sebagai indikator
kemurnian DNA. Apabila tidak terdapat kontaminasi protein dalam hasil isolasi
DNA genom, maka nilai target pada rasio A260/280 adalah 1.8, karena pada panjang
gelombang 260 nm konsentrasi DNA terdeteksi lebih banyak ±1,8 kali
dibandingkan pada panjang gelombang 280 nm. Selain itu, karena pada panjang
gelombang 280 nm terdapat peningkatan absorbsi UV oleh protein, maka deteksi
adanya kontaminasi protein dapat diketahui melalui peningkatan pembacaan A280
namun sedikit berefek pada pembacaan A260, sehingga rasio A260/280 akan terbaca
19
lebih rendah dari 1,8. Apabila pembacaan kadar kemurnian DNA pada rasio A260/280
lebih tinggi dari 2, terdapat kemungkinan sudah terjadi degradasi DNA.[40, 41]
Selain itu, diketahui protein juga mengabsorbsi sinar UV dengan baik pada
panjang gelombang 230 nm. Sehingga dapat disimpulkan bahwa rasio A260/230 dapat
digunakan sebagai indikator adanya kontaminasi protein. Namun terdapat beberapa
perancu yang memengaruhi hasil pemeriksaan pada rasio A260/230, karena ada
molekul lain seperti Tris Buffer yang juga mengabsorbsi sinar UV pada panjang
gelombang 230 nm. Sehingga rasio A260/230 jarang digunakan untuk mendeteksi
kontaminasi protein. Faktor lain yang dapat memengaruhi perhitungan kadar
kemurnian DNA dengan spektrofotometri ini adalah fenol yang dapat
mengabsorbsi sinar UV secara maksimal pada panjang gelombang 270 nm.
Sehingga dapat memengaruhi hasil perhitungan kadar kemurnian DNA pada rasio
A260/280.[41]
2.1.5. Aplification Refractory Mutation System-Polymerase Chain Reaction
(ARMS-PCR)
PCR merupakan teknik yang digunakan dalam bidang biomolekular untuk
mengamplifikasi satu atau beberapa salinan dari 1 potong sekuens DNA. Saat ini
PCR merupakan teknik umum dan sangat dibutuhkan untuk berbagai penerapan
penelitian medis dan biomolekular. Terdapat 3 langkah utama yang terkandung
dalam teknik PCR yaitu denaturation, annealing, dan extension.[43] Terdapat
berbagai macam metode PCR yang sering digunakan yaitu Amplification
Refractory Mutation System (ARMS), Restriction Fragment Length Polymorphism
(RFLP), dan sekuensing. Apabila dilihat dari segi biaya ARMS merupakan metode
yang membutuhkan biaya lebih murah dibandingkan dengan RFLP dan sekuensing.
Selain biaya yang murah ARMS membutuhkan waktu yang lebih singkat jika
dibandingkan dengan RFLP dan sekuensing. ARMS dan RFLP merupakan metode
yang memiliki sensitifitas tinggi dan banyak digunakan. Namun RFLP memiliki
kekurangan yaitu dapat terjadi misdiagnosis karena enzim restriksi yang tidak
sempurna memotong produk PCR, selain itu RFLP membutuhkan jumlah sampel
DNA yang lebih banyak. [44, 45, 46, 47]
20
ARMS adalah metode PCR yang menggunakan primer alel spesifik. Metode
ini menggunakan sebuah primer oligonukleotida yang memiliki terminal-3’. Primer
ini akan menjadi pelengkap atau pasangan untuk sekuens DNA spesifik yang terjadi
mutasi atau polimorfisme dan ditambahkan dengan primer common (primer umum)
yang digunakan dalam satu reaksi PCR.[48] ARMS PCR membutuhkan 2 macam
primer yaitu primer common dan primer ARMS. Primer common didesain seperti
primer PCR lainnya. Namun primer ARMS memiliki syarat tertentu yaitu :
1. Primer ARMS merupakan oligonukleotida yang memiliki panjang 30
basa.
2. Untuk primer mutant (M), terminal-3’ dari primer ARMS harus dapat
berpasangan dengan point mutasi, untuk primer normal (N) terminal-3’
harus berpasangan dengan sekuens normal. (Gambar 2.11)
Gambar 2.11. Desain Primer pada ARMS PCR [49]
3. Penambahan desain mismatch dapat dilakukan pada basa ke-dua
sebelum terakhir (penultimate) pada primer ARMS untuk menaikkan
spesifitas reaksi ARMS. Karena mismatch yang berbeda ditemukan
dapat memiliki efek kestabilan yang berbeda. Hal ini dibutuhkan untuk
menjaga ikatan pada terminal-3’. Apabila ikatan pada terminal-3’ kuat,
maka dibutuhkan mismatch pada basa penultimate yang ikatannya lebih
lemah, demikian pula sebaliknya. (Gambar 2.12)
21
Gambar 2.12. Tabel Pasangan Basa pada Desain Primer ARMS [49]
4. Sisa dari primer ARMS yang tidak spesifik harus berpasangan dengan
sekuens target.
5. Desain primer common harus memiliki panjang 30 basa; memiliki
kurang lebih 50% pasangan basa G-C; tidak memiliki pasangan
terminal-3’ yang sama dengan primer ARMS; dan tidak memiliki
sekuens yang berulang; karena fungsinya sebagai primer kontrol maka
harus dapat menghasilkan produk PCR 150 – 250 bp.[49, 50]
Sensitifitas dan spesifitas pada teknik ARMS PCR dipengaruhi oleh
beberapa kondisi yaitu, desain primer yang bagus; temperatur annealing yang
tinggi; dan jumlah siklus yang cukup penting untuk mengurangi hasil positif palsu.
Jumlah siklus yang terlalu banyak dapat memunculkan hasil positif palsu.[51]
Saat ini bayak penelitian yang menggunakan teknik ARMS PCR. Hal ini
menunjukkan bahwa teknik ARMS PCR cocok untuk semua jenis mutasi, selain itu
teknik ARMS PCR ini relevan untuk penelitian dengan jumlah sampel yang banyak
dan untuk mendeteksi 1 atau lebih titik mutasi. ARMS PCR dapat secara spesifik
mengamplifikasi sekuens mutan yang jarang di dalam sebuah populasi. Sehingga
teknik ARMS PCR ini cocok digunakan untuk skrining titik spesifik DNA yang
mengalami mutasi atau polimorfisme.[44]
22
Proses identifikasi polimorfisme genetik ALAD dengan menggunakan metode
ARMS-PCR dan elektroforesis dapat secara ringkas ditunjukkan pada gambar 2.13.
Gambar 2.13. Tahap identifikasi polimorfisme genetik ALAD dengan ARMS-
PCR dan elektroforesis [53]
23
2.2. Kerangka Teori
Pencemaran
lingkungan oleh Pb
Pb masuk ke dalam
tubuh
Pb diabsorbsi dan
beredar ke dalam
darah
Pb mensubtitusi Zn
pada active site
ALAD
ALAD-1/2 (GC) ALAD-1 (GG) ALAD-2 (CC)
Elektronegatif
rendah
Elektronegatif
sedang
Elektronegatif
tinggi
Afinitas ALAD-2
untuk mengikat Pb
lebih kuat (Pb
bermuatan postitif)
Pb menimbulkan
stress oksidatif
Enzim ALAD tidak
bekerja
Pembentukan heme
terhambat
Hemoglobin tidak
terbentuk
Anemia mikrositik
hipokromik
Kerusakan selular
Akumulasi ALA di
dalam darah dan
urin
Neurotoksik
Hepatotoksik
Nefrotoksik
24
2.3. Kerangka Konsep
2.4. Definisi Operasional
Dalam penelitian ini peneliti menggunakan istilah – istilah yang
didefinisikan sebagai berikut.
Tabel 2.1. Definisi Operasional
No. Variabel Definisi Cara Ukur Skala
1 Gen ALAD
(ALAD-1,
ALAD-1/2,
dan ALAD-2)
ALAD merupakan
enzim ke-dua dalam
jalur pembentukan
heme. Enzim ini
mengkatalis kondensasi
2 molekul ALA untuk
membentuk 1 molekul
PBG
(phorphobilinogen)
Teridentifikasi
adanya pita
DNA melalui
elektroforesis
Nominal
Mahasiswa PSKPD
UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta
Angkatan 2012 - 2014
Identifikasi
Polimorfisme Genetik
ALAD
ALAD-1/2 ALAD-2 ALAD-1
Kadar Hemoglobin
25
No. Variabel Definisi Cara Ukur Skala
2 Kadar
Hemoglobin
Kadar metaloprotein
(protein yang
mengandung zat besi)
di dalam sel darah
merah yang berfungsi
sebagai pengangkut
oksigen dari paru ke
seluruh tubuh.
Dinyatakan dalam
satuan g/dl.
Strip dan Alat
cek kadar Hb
(Easy Touch®
GCHb meter)
Ordinal
26
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1. Desain Penelitian
Penelitian ini menggunakan metode deskriptif analitik dengan desain cross
sectional.
3.2. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Agustus 2015 hingga Maret 2016.
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Kultur Sel, Biokimia, dan Biologi
Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, UIN Syarif Hidayatullah Jakarta, serta
Laboratorium Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Universitas Negeri Jakarta.
3.3. Sampel Penelitian
Sampel pada penelitian ini adalah responden laki – laki dan perempuan
mahasiswa Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter UIN Syarif Hidayatullah
Jakarta angkatan 2012 – 2014.
3.4. Besar Sampel
Besar sampel pada penelitian ini ditentukan menggunakan rumus besar
sampel deskriptif analitik sebagai berikut,
N = Zα2 x P x Q
d2
N = (1,96)2 x 0,5 x 0,5
(0,1)2
N = 96,04 → 97
Keterangan :
N = besar sampel
Zα = deviasi baku alfa
P = proporsi kategori variabel yang diteliti
Q = (1 – P)
d = presisi
27
Pada penelitian ini peneliti menetapkan alfa sebesar 5% sehingga nilai Zα =
1,96, dengan kesalahan prediksi yang masih bisa diterima (presisi, d) ditetapkan
sebesar 10%. Untuk nilai P, ditetapkan oleh peneliti sebesar 50% karena belum ada
nilai dari kepustakaan sebelumnya. Nilai P = 50% dipilih karena perkalian antara P
dan Q akan menunjukkan hasil yang maksimal apabila nilai P = 50%. Apabila
prediksi peneliti benar, maka peneliti akan memperoleh prevalensi sebesar 50% ±
10% = 40% - 60%. Apabila dihitung nilai N x P, akan didapatkan minimal 40% x
97 = 38,8 dan maksimal 60% x 97 = 58,2. Nilai keduanya > dari 5. Dengan
demikian, besar sampel 97 boleh digunakan karena memenuhi syarat N x P > 5 dan
N x (1 – P) > 5 dalam penelitian deskriptif analitik.[52]
3.5. Teknik Pengambilan Sampel
Teknik pengambilan sampel yang digunakan adalah Simple Random
Sampling.
3.6. Kriteria Pemilihan Sampel
3.6.1. Kriteria Inklusi
Kriteria inklusi pada penelitian ini adalah Mahasiswa Program Studi
Kedokteran dan Profesi Dokter angkatan 2012 – 2014.
3.6.2. Kriteria Eksklusi
Kriteria eksklusi pada penelitian ini adalah Mahasiswa Program Studi
Kedokteran dan Profesi Dokter angkatan 2012 – 2014 yang memiliki riwayat
infeksi kronik sebelumnya.
3.7. Cara Kerja
3.7.1. Perizinan Subjek Penelitian
Subjek penelitian diberikan informasi terkait manfaat penelitian dan efek
yang diakibatkan oleh penelitian ini. Informasi diberikan secara tertulis serta
penjelasan secara lisan oleh peneliti. Subjek penelitian juga diberikan lembar
persetujuan tertulis yang menyatakan bahwa subjek tersebut bersedia mengikuti
penelitian ini.
28
3.8. Alur Penelitian
Mahasiswa PSKPD UIN
Syarif Hidayatullah
Jakarta Angkatan 2012 -
2014
Sampel Darah
Isolasi Genom
DNA Genom
ARMS-PCR
Elektroforesis
Interpretasi :
ALAD-1, ALAD-1/2,
ALAD-2
Pemeriksaan kadar Hb
Hubungan Polimorfisme
Genetik ALAD dengan
kejadian anemia
29
3.9. Prosedur Penelitian
Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdapat di dalam tabel
berikut.
Tabel 3.1. Alat dan bahan penelitian
Alat Bahan Keterangan
Pengambilan sampel (darah)
Spuit 3cc
Torniquet
EDTA tube
Handscoen
Alcohol swab
Pengukuran kadar hemoglobin
Easy Touch® CGHb meter Blood Hemoglobin
Test Strips
Alcohol swab
Isolasi genom DNA dari darah
Microsentrifuge tube 1,5 ml
steril
Whole blood 300 µl
900 µl dan
100 µl
200 µl
Water bath AS ONE TRW-42
TP, 60oC
RBC Lysis Buffer
GB Buffer
GD column Ethanol Absolute 200 µl
2ml Collection tube W1 Buffer 400 µl
Microcentrifuge Eppendorf
5417 R
Wash Buffer
Elution Buffer
Vortex DAAD
Micropipet Nichipet EX
Nichiryo ukuran 2 – 20 µl dan
20 – 200 µl
Micropipet BIORAD ukuran
100 – 1000 µl
30
Bahan
Lanjutan Tabel 3.1
Keterangan Alat
Microtip Biologix ukuran 10
µl, 200 µl, dan 1000 µl
Biomedical freezer SANYO
Aluminium foil
Pengukuran kemurnian dan konsentrasi hasil isolasi DNA
Maestro nano drops Genom DNA 1 µl
Aquadest
Micropipet
Tip
Elektroforesis genom DNA
Elektroforesis ATTO My
Power II 300 AE-8135
Agarose
Ethidium bromide
TAE Buffer 1x
100 bp DNA
Ladder (size
marker)
Wrap plastic
1,5 gram
1 µl
100 ml
5 µl
Microwave SHARP Low
Wattage
Timbangan analitik
Adventure™
Gel doc system
Printgraph ATTO AE-6905
CF CCD camera controller
Penggaris sumur
Gelas kimia
Gelas ukur sibata
Botol reaksi
ARMS PCR
PCR Applied Biosystems 2720
Thermal Cycler
KAPA 2G Fast
ReadyMix 2x
12,5 µl
Primer Forward
(1 pmol)
2 µl
Primer Reverse
(1 pmol)
2 µl
31
Alat
Bahan
Lanjutan Tabel 3.1
Keterangan
Primer Common
(1 pmol)
2 µl
Primer Mutant
(1 pmol)
2 µl
Primer Normal
(1 pmol)
2 µl
DNA Template
(100 ng/µl)
3 µl
ddH2O 5,5 µl
3.10. Cara Kerja Penelitian
3.10.1. Pengumpulan Data
Penelitian ini menggunakan data primer dari responden yang telah mengisi
lembar informed consent. Data responden diperoleh dengan cara tes kadar Hb
menggunakan alat Easy Touch® CGHb meter dan pungsi vena sebanyak 3cc darah.
Kemudian darah yang diambil melalui pungsi vena diletakkan ke dalam tabung
EDTA dan diberi label, selanjutnya disimpan di Biomedical freezer dengan suhu
40C.
3.10.2. Desain Primer
Primer yang kami gunakan merupakan modifikasi dari studi yang dilakukan
oleh Yamashiro[53,59]. Primer yang digunakan ditampilkan dalam tabel berikut.
Tabel 3.2. Primer yang digunakan pada proses PCR
Jenis Primer Susunan Sekuens
Primer ALAD Forward (F) 5’-GCCTCAGTCTTCCCTCCTATTTAGT-3’
Primer ALAD Reverse (R) 5’-TCCCTTCTTAGCCCTTCCTTTGATT-3’
Primer ALAD Common (C) 5’-TTCTGTCCTGGGGGCTTGAG-3’
Primer ALAD Normal (N) 5’-TCAGCATCTCTTCCAGCCGC-3’
Primer ALAD Mutant (M) 5’-TCAGCATCTCTTCCAGCCGG-3’
32
3.10.3. Isolasi DNA
Langkah selanjutnya adalah mengisolasi DNA untuk mendapatkan genom
DNA dari sampel darah responden. Isolasi DNA pada penelitian ini menggunakan
Genomic DNA Mini Kit (Blood/Cultured Cell) Geneaid GB100 dengan langkah
kerja yang akan kami jelaskan dalam tabel 3.3.
Hasil isolasi DNA dinilai jumlah konsentrasi DNA-nya menggunakan
Maestro Nano Drops. Sampel diambil sebanyak 1 µl, lalu diletakkan di lensa nano,
kemudian ditutup dan dianalisa. Hasil kemurnian dan konsentrasi akan langsung
terbaca di layar dan tersimpan.
Tabel 3.3. Tahapan isolasi genom DNA[54]
Persiapan Sampel 1. Menyiapkan Microsentrifuge tube dan diberi label
sesuai dengan kode sampel
2. Memasukkan darah sampel sebanyak 300 µl ke
dalam Microsentrifuge tube ukuran 1,5 ml
3. Menambahkan 900 µl RBC Lysis buffer kemudian
mengocok Microsentrifuge tube
4. Menyentrifugasi Microsentrifuge tube selama 5
menit dengan kecepatan 3000 rpm
5. Membuang supernatan
6. Menambahkan 100 µl RBC Lysis buffer untuk
mensuspensi endapan leukosit kemudian
mengocok Microsentrifuge tube
Langkah 1
Cell Lysis
7. Menambahkan 200 µl GB buffer ke dalam
Microsentrifuge tube
8. Menginkubasi tabung selama 10 menit pada suhu
600C untuk memastikan bahwa sel telah lisis
9. Menyiapkan tabung berisi Elution buffer sebanyak
50 µl dan inkubasi pada suhu 600C, Elution buffer
akan digunakan pada proses selanjutnya.
10. Mendinginkan Micosentrifuge tube sampel pada
suhu ruangan
33
Lanjutan Tabel 3.3
Langkah 2
DNA Binding
11. Menambahkan 200 µl Ethanol absolute ke dalam
Microsentrifuge tube kemudian mengocok tabung
selama 10 detik
12. Menyiapkan GD column pada 2 ml Collection tube
13. Memindahkan campuran Microsentrifuge tube ke
dalam GD column
14. Menyentrifugasi GD column selama 5 menit pada
kecepatan 14.000 – 16.000 rpm
15. Membuang cairan yang tidak tersaring pada
Collection tube
16. Menempatkan kembali GD column ke Collection
tube
Langkah 3
Wash
17. Menambahkan 400 µl W1 buffer ke dalam GD
column kemudian menyentrifugasi selama 1 menit
pada kecepatan 14.000 – 16.000 rpm
18. Membuang cairan yang tidak tersaring pada
Collection tube
19. Menempatkan kembali GD column ke Collection
tube
20. Menambahkan 600 µl Wash buffer ke dalam GD
column
21. Menyentrifugasi GD column selama 1 menit pada
kecepatan 14.000 – 16.000 rpm
22. Membuang cairan yang tidak tersaring pada
Collection tube
23. Menempatkan kembali GD column ke Collection
tube
24. Menyentrifugasi GD column selama 1 menit pada
kecepatan 3.000 rpm untuk mengeringkan matriks
column
34
Lanjutan Tabel 3.3
Langkah 4
DNA elution
25. Memindahkan GD column yang sudah kering ke
dalam Microsentrifuge tube yang steril
26. Menambahkan 50 µl Elution buffer yang telah
diinkubasi ke dalam GD column dan dibiarkan
selama 3 menit
27. Menyentrifugasi Microsentrifuge tube selama 1
menit pada kecepatan 14.000 – 16.000 rpm untuk
mendapatkan hasil.
3.10.4. Amplifikasi Genom dengan ARMS-PCR
Setelah dilakukan isolasi genom DNA, tahap selanjutnya adalah
mengamplifikasi genom DNA. Peneliti menggunakan metode ARMS-PCR yang
terdiri atas 2 tahapan PCR. PCR tahap 1 bertujuan untuk mengamplifikasi fragmen
gen ALAD, menggunakan komposisi primer forward dan reverse (Tabel 3.4)
sedangkan PCR tahap 2 bertujuan untuk identifikasi polimorfisme gen ALAD,
menggunakan primer normal dan mutant (Tabel 3.5).
Tabel 3.4. Komposisi MixPCR pada PCR Tahap 1 [53]
Komponen dan konsentrasi bahan Volume akhir dalam larutan
KAPA 2G Fast ReadyMix 2X 12,5 µl (1x)
Primer forward (1 pmol) 2 µl
Primer reverse (1 pmol) 2 µl
DNA template (100 ng/ µl) 3 µl
ddH2O 55,5 µl
Total volume reaksi 25 µl
Pada PCR tahap 1 berlangsung selama 40 siklus diawali dari fase
predenaturasi pada suhu 940C selama 3 menit, kemudian dilanjutkan pada fase
denaturasi pada suhu 940C selama 30 detik. Tahap berlanjut pada fase penempelan
primer (annealing) pada suhu 600C selama 30 detik. Tahap berikutnya adalah fase
pemanjangan (extension) pada suhu 720C selama 30 detik. Tahap terakhir adalah
35
fase pemanjangan akhir pada suhu 720C selama 1 menit. Produk amplifikasi adalah
306 bp.
Tabel. 3.5. Komposisi MixPCR pada PCR Tahap 2[53]
Komponen dan konsentrasi bahan Volume akhir dalam larutan
KAPA 2G Fast ReadyMix 2X 12,5 µl (1x)
Primer common (1 pmol) 2 µl
Primer normal/mutant (1 pmol) 2 µl
DNA template (100 ng/ µl) 3 µl
ddH2O 55,5 µl
Total volume reaksi 25 µl
PCR tahap 2 menggunakan primer common dan normal untuk
mengidentifikasi sampel normal (GG). Primer common dan mutant untuk
mengidentifikasi sampel mutan (CC). Pada PCR tahap 2 ini 1 sampel DNA dibagi
menjadi 2 bagian yang akan diberikan primer normal dan primer mutant, sehingga
setiap 1 sampel DNA akan memiliki 2 hasil yang dapat dilihat. Untuk
menginterpretasikan hasil PCR tahap 2 dilakukan elektroforesis yang akan
dijelaskan di pembahasan selanjutnya. Sampel DNA yang digunakan merupakan
produk dari PCR tahap 1.
PCR tahap 2 berlangsung selama 32 siklus diawali dengan fase
predenaturasi pada suhu 940C selama 3 menit, dan fase denaturasi pada suhu 940C
selama 30 detik. Selanjutnya memasuki fase annealing pada suhu 600C selama 15
detik. Tahap berikutnya adalah pase extension pada suhu 720C selama 10 detik.
Tahap terakhir adalah fase pemanjangan akhir pada suhu 720C selama 1 menit.
Program PCR ini sudah melalui hasil optimalisasi.
3.10.5. Elektroforesis dan Gel Docummentation System
Setelah dilakukan PCR dengan metode ARMS-PCR, produk PCR
dikategorikan menjadi bentuk normal (Homozigot GG/ ALAD-1), carier
(Heterozigot GC/ ALAD-1/2), dan mutant (Homozigot CC/ ALAD-2)
36
menggunakan elektroforesis. Tahapan elektroforesis akan dijelaskan dalam tabel
3.6.
Tabel 3.6. Tahapan Elektroforesis
Pembuatan Gel
Elektroforesis
1. Mengambil agarose sebanyak 1,5 gram yang
ditimbang menggunakan timbangan analitik
2. Mencampur agarose dengan 100 ml TAE di dalam
botol reaksi untuk mendapatkan gel dengan
konsentrasi 1,5% (konsentrasi 1,5% cocok
digunakan untuk DNA yang memiliki ukuran 300 –
3.000 bp)
3. Memanaskan campuran gel elektroforesis dengan
Microwave low wattage selama 3 menit
Persiapan Tray 4. Menyiapkan tray gel elektroforesis dan
menyediakan cetakan sumur. Karena sampel yang
banyak, peneliti menggunakan cetakan sumur
dengan lubang sebanyak 17 buah agar lebih efektif
5. Menuangkan 1 µl Ethidium bromide ke atas tray
dengan zigzag secara merata menggunakan
micropipet
Pembuatan
Cetakan Gel
Elektroforesis
6. Menuangkan cairan gel elektroforesis ke dalam tray
hingga batas maksimum tray dan memastikan tidak
ada gelembung udara
7. Meratakan Ethidium bromide yang telah dituangkan
sebelumnya menggunakan micropipet
8. Meletakkan cetakan sumur ke dalam tray dan
menunggu selama 20 menit hingga gel
elektroforesis mengeras
37
Lanjutan Tabel 3.6
Memulai
Elektroforesis
9. Setelah gel elektroforesis mengeras, cetakan sumur
diangkat kemudian meletakkan gel elektroforesis ke
dalam kotak elektroforesis yang telah terisi buffer
dengan arah elektroda negatif menuju positif
10. Memasukkan 7 µl produk PCR ke dalam sumur
(Pada sampel ALAD ini tidak menggunakan
Loading dye karena sudah memiliki warna hijau
sebagai penanda)
11. Memasukkan 3 µl DNA ladder 100 bp sebagai
marker
12. Menyalakan mesin elektroforeisis selama 30 menit
dengan tegangan 100 Volt
Gel documment
system
13. Memindahkan gel elektroforesis yang telah
dielektroforesis ke dalam wadah bersih
14. Memindahkan ke dalam Transilluminator untuk
melihat hasil elektroforesis di bawah sinar UV
15. Menginterpretasikan hasil. Gen ALAD akan terlihat
di sepanjang 168 bp
3.11. Analisis Data
Data yang telah diperoleh berupa gen ALAD, usia, jenis kelamin, dan kadar
hemoglobin dianalisis menggunakan software IBM SPSS Statistics 22. Data yang
didapatkan dianalisis menggunakan uji Chi-Square untuk mengetahui frekuensi
polimorfisme genetik ALAD pada mahasiswa PSPD serta hubungannya dengan
kejadian anemia. Data yang didapat disajikan dalam bentuk tabel dan diagram.
3.12. Etika Penelitian
Penelitian ini mendapatkan ethical clearance (lampiran 2) dari Tim Kaji Etik
Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
38
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Isolasi DNA Genom
Jumlah responden yang sesuai dengan kriteria inklusi dan eksklusi dalam
penelitian ini adalah sebanyak 102 orang. Hasil isolasi DNA Genom dilihat secara
kuantitatif menggunakan spektrofotometer nano drop (Lampiran 6) dan secara
kualitatif menggunakan elektroforesis (Lampiran 5) untuk melihat kemurnian dan
konsentrasi DNA genom. Hasil kemurnian DNA dapat dilihat pada tabel berikut.
Tabel 4.1. Data kemurnian DNA genom mahasiswa program studi kedokteran dan
profesi dokter UIN Syarif Hidayatulah Jakarta angkatan 2012 – 2014
Kategori kemurnian DNA
genom (A260/280)
Frekuensi Persentase (%)
<1,8 48 47,1
1,8 – 2,0 45 44,1
>2,0 9 8,8
Total 102 100
Pada tabel 4.1 terlihat kemurnian DNA dari sampel yang diperiksa dengan
spektrofotometer nano drop. Pada tabel diketahui bahwa dari 102 sampel; 45 orang
sampel memiliki kategori kemurnian 1,8 – 2,0 pada rasio panjang gelombang
A260/280; 9 orang memiliki kemurnian lebih dari 2,0; dan 48 orang memiliki
kemurnian kurang dari 1,8. Nilai kemurnian lebih dari 2,0 dapat disebabkan karena
adanya degradasi DNA, selain itu nilai kemurnian kurang dari 1,8 dapat disebabkan
karena adanya kontaminasi protein, fenol, serta konsentrasi asam nukleat yang
rendah (< 10 ng/µl). Secara keseluruhan, nilai kemurnian terendah adalah 1,102
dan nilai kemurnian tertinggi adalah 2,331 pada rasio panjang gelombang A260/A280
(Lampiran 6).
39
Deteksi selanjutnya dilakukan secara kualitatif menggunakan
elektroforesis. Pada gambar 4.3 terdapat 17 contoh sampel DNA genom hasil
isolasi (nomor sampel 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 80, 81, 82,
83) dari total 102 sampel yang diisolasi. Pita yang terlihat pada visualisasi 17
sampel tersebut menunjukkan keberhasilan isolasi DNA genom. Pada penelitian ini
102 sampel yang diisolasi terlihat pita dengan visualisasi Gel docummentation
system. Pada gambar 4.1 pita terlihat tebal dan tidak terdapat smear.
Gambar 4.1. Deteksi kualitatif DNA Genom dengan Elektroforesis
4.2. Identifikasi Genetik ALAD Menggunakan ARMS-PCR
Pada penelitian ini identifikasi polimorfisme genetik ALAD menggunakan
metode 2 tahap ARMS-PCR, yaitu tahap 1 untuk mengamplifikasi genetik ALAD
dan tahap 2 untuk mengidentifikasi polimorfisme genetik ALAD (Gambar 4.2).
Hasil PCR Tahap 1 ditunjukkan pada Gambar 4.2. Pada hasil visualisasi tersebut
ditemukan pita sepanjang 306 bp. Dari 102 sampel yang dilakukan PCR Tahap 1
seluruhnya ditemukan pita sepanjang 306 bp.
Gambar 4.2. Hasil PCR Tahap 1. Terlihat Pita pada 306 bp.
(M adalah marker; Huruf A – K adalah label sampel)
1000 bp
800 bp
500 bp
300 bp
100 bp
306 bp
A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, M
78
62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 80, 81, 82, 83
40
Selanjutnya dilakukan PCR tahap 2 bertujuan untuk mengidentifikasi
polimorfisme genetik ALAD. Hasil PCR Tahap 2 disajikan pada Gambar 4.3.
Gambar 4.3. Hasil PCR Tahap 2. Terlihat Pita pada 168 bp
Dari gambar 4.3.didapatkan pita dengan ukuran 168 bp. Apabila pita
muncul pada lajur yang mengandung primer C (mutant) dan tidak muncul pada lajur
yang mengandung primer G (normal) maka dapat diambil kesimpulan bahwa
sampel memiliki genetik ALAD-2. Sebaliknya apabila tidak ditemukan pita pada
lajur yang mengandung primer C (mutant) dan muncul pada lajur yang
mengandung primer G (normal) maka dapat diambil kesimpulan bahwa sampel
memiliki genetik ALAD-1. Apabila pita muncul di kedua lajur yang mengandung
primer C dan G, maka dapat ditarik kesimpulan bahwa sampel memiliki genetik
ALAD-1/2 (heterozygot). [53]
Pada gambar 4.3 terlihat bahwa pada sampel nomor 28, kedua lajur tidak
ditemukan adanya pita, ini menunjukkan bahwa proses elektroforesis tidak berjalan
dengan baik. Hal ini dapat dipengaruhi beberapa faktor seperti konsetrasi DNA
yang kurang, dan konsentrasi primer PCR Tahap 2 yang kurang. Untuk mengatasi
hal ini, peneliti mengulang kembali proses PCR Tahap 2 dengan memodifikasi
konsentrasi DNA dan primer PCR Tahap 2. Selanjutnya sampel nomor 28 yang
telah dilakukan proses koreksi ditemukan pita di sepanjang 168 bp. Pada contoh
visualisasi hasil elektroforesis pada gambar 4.3 terlihat smear dengan tipe high
mollecular weight sehingga smear terlihat di bagian atas pita. Hal ini bisa
disebabkan oleh konsentrasi DNA yang terlalu banyak, sehingga migrasi DNA
dalam gel agarose terhambat. [55]
28, 29, 30, 31, 32 M
41
Pada penelitian ini didapatkan adanya smear dengan tipe high mollecular
weight, pada hasil elektroforesis dapat pula ditemukan smear dengan tipe low
mollecular weight yang dapat muncul akibat adanya sisa pemanjangan oleh primer
PCR. Sisa pemanjangan primer ini memiliki berat molekul yang lebih ringan
sehingga dapat terus bermigrasi hingga sepanjang 100 bp. Sisa pemanjangan primer
bisa terjadi akibat adanya sisa primer yang tidak dapat dengan sendirinya berhenti
memanjangkan templatenya, atau karena adanya pemanjangan dengan primer yang
lainnya di dalam sebuah reaksi PCR. Sisa pemanjangan primer yang menumpuk
dan membuat sebuah pita kecil di sepanjang 100 bp disebut dengan primer
dimer.[55,56] Selain itu smear dengan tipe low mollecular weight dapat disebabkan
karena DNA terdegradasi oleh enzim nuklease, adanya kontaminasi RNA (RNA
dapat bermigrasi lebih cepat dibandingkan dengan DNA), dan kondisi
elektroforesis yang tidak tepat sehingga dapat merusak struktur DNA. Gambar 4.3
juga menunjukkan adanya pita DNA hasil elektroforesis yang tervisualisasi tidak
terlalu tebal dapat disebabkan oleh beberapa faktor, yaitu kurangnya konsentrasi
DNA yang dimasukkan ke dalam gel elektroforesis, kurangnya pewarnaan pada
DNA, adanya DNA yang keluar saat elektroforesis, dan DNA yang berdifusi di
dalam gel elektroforesis. [55. 57]
Selanjutnya identifikasi polimorfisme genetik ALAD pada Mahasiswa
Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
angkatan 2012 – 2014 disajikan dalam tabel 4.2.
Tabel 4.2. Hasil Identifikasi Polimorfisme Genetik ALAD Pada Mahasiswa
Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Angkatan 2012 – 2014.
Genotip Frekuensi Persentase (%)
ALAD-1 22 21,6
ALAD-1/2 71 69,6
ALAD-2 9 8,8
Total 102 100
42
Dari tabel tersebut diketahui bahwa sampel yang memiliki genetik ALAD-
1 sebesar 21,6 %, genetik ALAD-1/2 sebesar 69,6 %, dan ALAD-2 sebesar 8,8 %.
Hasil ini sesuai dengan studi epidemiologi yang telah dilakukan sebelumnya yang
menyatakan bahwa secara umum, ras kaukasia memiliki frekuensi genotip ALAD-
2 tertinggi dengan proporsi ALAD-1/2 hanya 18% dan ALAD-1 hanya mencapai
1% saja dari total populasi ras kaukasia. Sebaliknya, pada populasi ras afrika dan
asia sedikit ditemukan subjek dengan genotip ALAD-2.[11]
4.3. Karakteristik Sampel
4.3.1. Karakteristik Sampel Berdasarkan Jenis Kelamin
Sampel penelitian ini berjumlah 102 orang yang terdiri atas 37 orang laki –
laki dan 65 orang perempuan.
Tabel 4.3. Deskripsi Sampel Berdasarkan Jenis Kelamin
Jenis Kelamin Frekuensi Persentase (%)
Laki – Laki 37 36,3
Perempuan 65 63,7
Total 102 100
Dari tabel tersebut dapat diketahui bahwa perempuan memiliki proporsi
lebih banyak dibandingkan dengan laki – laki. Dengan persentase perempuan 63,7
% dan laki – laki 36,3 %.
4.3.2. Karakteristik Sampel Berdasarkan Usia
Sampel pada penelitian ini diikuti oleh mahasiswa Program Studi
Kedokteran dan Profesi Dokter UIN Syarif Hidayatullah Jakarta dari 3 angkatan
yang berbeda yaitu angkatan 2012, 2013, dan 2014. Usia sampel paling rendah
adalah 18 tahun berjumlah 27 orang, dan paling tinggi 23 tahun berjumlah 3 orang.
43
Tabel 4.4. Deskripsi Sampel Berdasarkan Usia
Usia (Tahun) Frekuensi Persentase (%)
18 27 26,5
19 23 22,5
20 33 32,4
21 16 15,7
23 3 2,9
Total 102 100
Dari data tersebut diketahui bahwa sampel didominasi oleh usia 20 tahun
sebanyak 33 orang. Selain itu dari 102 sampel tidak terdapat sampel dengan usia
22 tahun.
4.3.3. Hasil Pemeriksaan Kadar Hemoglobin
Pada penelitian ini selain dilakukan pengambilan darah vena, dilakukan
juga pemeriksaan kadar Hb responden melalui darah perifer. Kemudian peneliti
mengelompokkan kadar Hb menjadi Anemia dan Normal sesuai dengan kriteria
Kementrian Kesehatan Republik Indonesia yaitu untuk Laki – Laki dikelompokkan
sebagai Anemia apabila Hb kurang dari 13 g/dl, dan Perempuan dikelompokkan
sebagai Anemia apabila Hb kurang dari 12 g/dl.[36]
Tabel 4.5. Hasil Pemeriksaan Kadar Hemoglobin
Kriteria Hb Frekuensi Persentase (%)
Normal 41 40,2
Anemia 61 59,8
Total 102 100
44
Dari tabel 4.5 dapat diketahui bahwa dari 102 sampel terdapat 41 orang
(40,2 %) yang memiliki Hb normal, dan terdapat 61 orang (59,8%) yang mengalami
anemia menurut kriteria Kementrian Kesehatan Republik Indonesia.
4.3.4. Hubungan Polimorfisme ALAD dengan Jenis Kelamin
Polimorfisme yang didapatkan dapat dihubungkan dengan jenis kelamin,
hasil ditampilkan dalam gambar 4.4.berikut
Gambar 4.4. Hubungan Polimorfisme Genetik ALAD dengan Jenis Kelamin
Pada Gambar 4.4 dapat diketahui bahwa pada sampel laki – laki terdapat 10
orang yang memiliki genotip ALAD-1, 25 orang memiliki genotip ALAD-1/2, dan
2 orang memiliki genotip ALAD-2. Sedangkan pada sampel perempuan terdapat
12 orang yang memiliki genotip ALAD-1, 46 orang memiliki genotip ALAD-1/2,
dan 7 orang memiliki genotip ALAD-2.
Dari data tersebut dapat disimpulkan bahwa pada jenis kelamin laki – laki
dan perempuan ALAD-1/2 memiliki proporsi paling banyak.
1012
25
46
2
7
0
10
20
30
40
50
60
Laki - Laki Perempuan
Mah
asis
wa
(Ora
ng)
Polimorfisme ALAD
ALAD-1 ALAD-1/2 ALAD-2
45
4.3.5. Hubungan Polimorfisme Genetik ALAD dengan Kejadian Anemia
Gambar 4.5. Hubungan Polimorfisme Genetik ALAD dengan Kejadian Anemia
Pada Gambar 4.5 dapat diketahui bahwa pada genotip ALAD-1 terdapat 9
orang yang masuk dalam kriteria kadar Hb normal, dan terdapat 13 orang yang
masuk dalam kriteria anemia. Kemudian pada genotip ALAD-1/2 terdapat 29 orang
yang masuk dalam kriteria kadar Hb normal, dan terdapat 42 orang yang masuk
dalam kriteria anemia. Selanjutnya pada genotip ALAD-2, terdapat 3 orang yang
memiliki kriteria kadar Hb normal, dan terdapat 6 orang yang masuk dalam kriteria
anemia.
Telah diketahui sebelumnya bahwa ALAD adalah enzim yang berperan
penting terhadap proses pembentukan heme, sehingga mengidentifikasi adanya
hubungan polimorfisme genetik ALAD dengan kadar Hb penting untuk menunjang
diagnosis pasien. Dari hasil uji Chi-Square didapatkan nilai harapan (expected
count) < 5 adalah 16,7 % (di bawah 20 %), sehingga nilai signifikansi dari Pearson
Chi-Square dapat digunakan. Nilai signifikansi yang didapat adalah 0,908 (p value
> 0,05).[58] Sehingga dapat disimpulkan bahwa tidak terdapat hubungan yang
9
13
29
42
36
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Normal Anemia
Mah
asis
wa
(Ora
ng)
Polimorfisme ALAD
ALAD-1 ALAD-1/2 ALAD-2
46
signifikan antara polimorfisme genetik ALAD dengan kejadian anemia (Lampiran
10).
Tidak adanya hubungan yang bermakna antara data polimorfisme genetik
ALAD dengan kejadian anemia ini dapat mengindikasikan adanya mekanisme
adaptasi dari tubuh terhadap perubahan lingkungan terutama yang diakibatkan oleh
Pb. Individu dengan genotip ALAD-2 memiliki kemampuan mengikat Pb lebih
kuat sehingga Pb tetap terikat pada siklus aktif enzim ALAD. Kondisi ini
berdampak pada proses penghambatan Pb selanjutnya terhadap enzim
ferrochelatase. Sehingga individu dengan genotip ALAD-2 memiliki kemampuan
lebih baik terhadap penggunaan ion besi (Fe) pada sintesis Hb. Berbeda halnya pada
individu dengan genotip ALAD-1 yang memiliki ikatan terhadap Pb lebih lemah,
sehingga Pb yang masuk ke dalam tubuh akan lebih banyak menghambat kerja
enzim ferrochelatase. Oleh karena itu perlu adanya pemeriksaan kadar Pb dalam
darah pada penelitian selanjutnya.
Untuk menentukan tata laksana anemia perlu memperhatikan faktor – faktor
yang berkaitan dengan jumlah dan morfologi eritrosit seperti hematokrit, hitung
eritrosit, MCH (Mean Cell Haemoglobin), MCV (Mean Cell Volume), MCHC
Mean Cell Haemoglobin Concentration), dan hitung jenis retikulosit. Selain itu
untuk membedakan dengan diagnosis anemia karena defisiensi besi dan defisiensi
asam folat perlu adanya pemeriksaan tambahan seperti kadar Fe serum, TIBC
(Total Iron – Binding Capacity), ferritin serum, Vit. B12 serum, asam folat serum,
dan Red Cell Folate.[32]
47
4.4. Keterbatasan Penelitian
Penelitian ini memiliki keterbatasan antara lain :
1. Tidak diukurnya kriteria diagnosis lain untuk menentukan anemia dan non
- anemia seperti pemeriksaan hapusan darah tepi, dan pemeriksaan
hematologi eritrosit.
2. Tidak mencari data Pb serum dan data paparan Pb pada responden untuk
mengetahui hubungan paparan Pb terhadap kriteria kadar Hb (anemia dan
non – anemia).
3. Tidak mencari data mengenai status menstruasi pada responden perempuan
untuk mengetahui kemungkinan penyebab lain terjadinya anemia.
48
BAB V
SIMPULAN DAN SARAN
5.1. Simpulan
1. Terdapat polimorfisme genetik ALAD pada populasi mahasiswa PSKPD
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012 – 2014.
2. Genotip ALAD-1/2 memiliki proporsi terbanyak dengan frekuensi
sebanyak 71 orang dari 102 sampel pada populasi mahasiswa PSKPD UIN
Syarif Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012 – 2014.
3. Tidak terdapat hubungan yang signifikan antara polimorfisme gen ALAD
dengan kejadian anemia pada populasi mahasiswa PSKPD UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta Angkatan 2012 – 2014.
5.2. Saran
1. Diperlukan pemeriksaan lebih lanjut untuk diagnosis anemia seperti
hapusan darah tepi dan pemeriksaan hematologi eritrosit.
2. Diperlukan pemeriksaan kadar Pb serum untuk mengetahui hubungannya
dengan polimorfisme genetik ALAD.
3. Diperlukan kuesioner tambahan terkait gaya hidup dan siklus menstruasi
responden untuk menunjang diagnosis anemia.
4. Perlu dilakukan penelitian lanjutan dengan jumlah sampel yang lebih
banyak.
49
PERNYATAAN PENELITIAN
Penelitian ini adalah bagian dari kerjasama penelitian antara Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan (FKIK) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta dengan
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) Universitas Negeri
Jakarta dengan tema penelitian Hemoglobinopati dan Genetik.
50
DAFTAR PUSTAKA
[1] Jaishankar M, Tseten T, Anbalagan N, Matthew B, Beeregowda KN. Toxicity,
mechanism and health effects of some heavy metals. Interdiscip Toxicol.
2014;7:60-72.
[2] Suherni. Keracunan timbal di Indonesia. 2010 Sept 16 [diakses tanggal 23
Agustus 2016]. Tersedia di www.lead.org.au/
[3] Gusnita D. Pencemaran logam berat timbal (Pb) di udara dan upaya
penghapusan bensin bertimbal. LAPAN. 2010:1-7.
[4] Santi DN. Pencemaran udara oleh timbal (Pb) serta penanggulangannya. USU
Digital Library. 2001:1-6.
[5] Warrington NM, Zhu G, Dy V, Heath AC, Madden PAF, Hemani G, et.al.
Genome-wide association study of blood lead shows multiple associations
near ALAD. Hum Mol Genet. 2015;13:3871-9.
[6] Sakamoto D, Kudo H, Inohaya K, Yokoi H, Narita T, Naruse K, et.al. A
mutation in the gene for ẟ-aminolevulinic acid dehydratase (ALAD) causes
hypochromic anemia in the medaka, Oryzas latipes. Mech Dev.
2004;121:747-52.
[7] Karki R, Pandya D, Elston RC, Ferlini C. Defining mutation and polymorphism
in the era of personal genomics. BMC Med Genom. 2015;8:37.
[8] Huijun Z. Delta amino levulinic acid dehydratase (ALAD) polymorphism and
its effect on human susceptibility to renal toxicity by inorganic lead [tesis].
[Lower Kent Ridge Rd]: National University of Singapore; 2005.
[9] van Bemmel DM, Li Y, McLean J, Chang MH, Dowling NF, Graubard B, et.al.
Blood lead levels, ALAD gene polymorphisms, and mortality. Epidemiology.
2011;22:273-8.
[10] Ajioka RS, Philips JD, Kushner JP. Biosynthesis of heme in mammals.
Biochemica et Biophysica Acta. 2006;1763:723-36.
51
[11] Kelada SN, Shelton E, Kaufmann RB, Khoury MJ. ẟ-Aminolevulinic acid
dehydratase genotype and lead toxicity: A HuGE Review. Am J Epidemiol.
2001;154:1-13.
[12] van Bemmel DM, Boffetta P, Liao LM, Berndt SI, Menashe I, Meredith Y,
et.al. Comprehensive analysis of 5-aminolevulinic acid dehydrogenase
(ALAD) variants and renal cell carcinoma risk among individuals exposed to
lead. PLoS ONE. 2011;6:1-7.
[13] Papanikolau NC, Hatzidaki EG, Belivanis S, Tzanakakis GN, Tsatsakis AM.
Lead toxicity update. A brief review. Med Sci Monit. 2005;11:329-36.
[14] Patrick L. Lead toxicity a review of the literature. Part 1: Exposure, Evaluation
and Treatment. Altern Med Rev. 2006;11:2-22.
[15] Patocka J. Organic lead toxicology: Review Article. Acta Medica (Hradec
Kralove). 2008;51:209-13.
[16] Centers for Disease Control and Prevention. Blood lead levels in children.
2017 May 17 [diakses tanggal 20 Mei 2017]. Tersedia di
www.cdc.gov/nceh/lead/acclpp/blood_lead_levels.htm
[17] Shah F, Kazi TG, Afridi HI, Baig JA, Khan S, Kolachi NF, et.al.
Environmental exposure of lead and iron deficit anemia in children age ranged
1-5 years: A Cross Sectional Study. Sci Total Environ. 2010;408:5325-30.
[18] Mason LH, Harp JP, Han DY. Pb neurotoxicity: Neurophysiological effects of
lead toxicity. BioMed Res. 2014;10:1-8.
[19] Yun L, Zhang W, Qin K. Relationship among maternal blood lead, ALAD
gene polymorphism and neonatal neurobehavioral development. Int J Clin
Exp Pathol. 2015;8:7277-81.
[20] Wan H, Wu J, Sun P, Yang Y. Investigation of delta-aminolevulinic acid
dehydratase polymorphism affecting hematopoietic, hepatic, and renal
toxicity from lead in Han subjects of southwestern China. A Physiol.
2014;1:59-66.
52
[21] Neslund-Dudas C, Levin AM, Rundle A, Dimmer JB, Bock CH, Nock NL,
et.al. Case-only gene-environtment interaction between ALAD tagSNPs and
occupational lead exposure in prostate cancer. Prostate. 2014;74:637-46.
[22] Lister Hill National Center for Biomedical Communications. Help me
understand genetics: Cells and DNA. 2016 May 16 [diakses tanggal 19 Mei
2016]. Tersedia di: https://ghr.nlm.nih.gov/
[23] US National Library of Medicine. Your guide to understanding genetic
conditions: Genetics Home Reference. 2016 Aug 16 [diakses tanggal 18
Agustus 2016]. Tersedia di https://ghr.nlm.gov/gene/ALAD/
[24] Reece JB, Urry LA, Cain ML, Wasserman SA, Minorsky PV, Jackson RB.
Genetics. The molecular basis inheritance. In: Campbell Biology. Edisi ke –
9. San Francisco: Pearson; 2011. h. 305 – 340.
[25] Alberts B, Bray D, Hopkin K, Johnson AD, Lewis J, Raff M, et.al. Control of
gene expression chapter 8. In: Essential Cell Biology. Edisi ke-4. Garland
Science; 2016. h. 261-86.
[26] Susman M. Genes: Definition and Structure. Encyclopedia of Life Sciences.
2001;1-7.
[27] Scinicariello F, Murray HE, Moffet DB, Abadin HG, Sexton MJ, Fowler BA.
Lead and ẟ-aminolevulinic acid dehydratase polymorphism: Where Does It
Lead? A Meta-Analysis. Environ Health Perspect. 2007;115:35-41.
[28] Scripichai O, Fucharoen S. Genetic polymorphisms and implications for
human diseases. J Med Assoc Thai. 2007;90:394-8.
[29] Yang Y, Wu J, Sun P. Effects of delta-aminolevulinic acid dehydratase
polymorphisms on susceptibility to lead in Han subjects from southwestern
China. Int J Environ Res Public Health. 2012;9:2326-38.
[30] Miyaki K, Lwin H, Masaki K, Song Y, Takahashi Y, Muramatsu M, et.al.
Association between a polymorphism of aminolevulinate dehydrogenase
(ALAD) gene and blood lead levels in Japanese subjects. Int J Environ Res
Public Health. 2009;6:999-1009.
53
[31] Rajan P, Kesley KT, Schwartz JD, Bellinger DC, Weuve J, Sparrow D, et.al.
Lead burden and psychiatric symptoms and the modifying influence of the ẟ-
aminolevulinic acid dehydratase (ALAD) polymorphism: The VA Normative
Aging Study. Am J Epidemiol. 2007;166:1400-108.
[32] Hoffbrand AV, Moss PAH. Essential haematology. Edisi ke-6. Oxford: Wiley-
Blackwell; 2011. H. 1-47.
[33] Weaver VM, Schwartz BS, Jear BG, Ahn KD, Todd AC, Lee SS, et.al.
Association of uric acid with polymorphisms in the ẟ-aminolevulinic acid
dehydratase, vitamin D receptor, and nitric oxide synthase genes in Korean
lead workers. Environ Health Prespect. 2005;11:1-7.
[34] Tortora GJ, Derrickson B. Development of blood vessels and blood. In:
Principles of Anatomy & Physiology. Edisi ke-14. USA: John Wiley & Sons;
2014. h. 791-2.
[35] Hattangadi SM, Wong P, Zhang L, Flygare J, Lodish HF. From stem cell to
red cell: Regulation of Erythropoiesis at Multiple Levels by Multiple Proteins,
RNAs, and Chromatin Modifications. Blood. 2011;118:6258-68.
[36] Kementrian Kesehatan Republik Indonesia. Pedoman interpretasi data klinik.
Jakarta; 2011. h. 8-27.
[37] Lambert JF, Beris P. Pathophysiology and differential diagnosis of anaemia:
Chapter 4. In : The Handbook Disorders of Erythropoiesis, Erythrocytes, and
Iron Metabolism. Pagina; 2009. h. 108-141.
[38] Souza RM, Freitas LAR, Lyra AC, Moraes CF, Braga EL, Lyra LGC. Effect
of iron overload on the severity of liver histologic alterations and on the
response to interferon and ribavirin theraphy of patients with hepatitis C
infection. Braz J Med Biol Res. 2006;39:79-83.
[39] Siddique A, Kowdley KV. Review Article: The iron overload syndromes.
Aliment Pharmacol Ther. 2012;35:876-93.
[40] GE Healthcare Life Sciences. Spectrophotometry handbook.
Buckinghamshire: GE Company; 2013. h. 1-10.
54
[41] Rothman R. Determination of DNA concentration and purity by ultraviolet
spectrophotometry. 2015 Jan 4 [diakses tanggal 6 Juni 2017]. Tersedia di
https://people.rit.edu/rhrsbi/GEPages/LabManualPDF5ed/
[42] Gustavsson T, Banyasz A, Lazzarotto E, Markovitsi D, Scalmani G, Frisch
MJ, et.al. Singlet excited-state behavior of uracil and thymine in aqueous
solution: A Combined Experimental and Computational Study of 11 Uracil
Derivatives. J Am Chem Soc. 2006;128:607-619.
[43] Joshi M, Deshpande JD. Polymerase chain reaction: Methods, Principles, and
Application. Int J Biomed Res. 2010;1:81-97.
[44] Duta-Cornescu G, Simon-Gruita A, Constantin N, Stanciu F, Dobre M, Banica
D, et.al. A comparative study of ARMS-PCR and RFLP-PCR as methods for
rapid SNP identification. Rom Biotechnol Lett. 2009;14:4845-50.
[45] Caren H. ARMS test for analyzing SNPs and association study of SPINK5
polymorphisms in an asthma material [tesis]. [Gothenburg]: Goteborg
University; 2002.
[46] Ye S, Dhillion S, Ke X, Collins AR, Day INM. An efficient procedure for
genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Res. 2001;88:1-
8.
[47] Fateh A, Aghasadeghi M, Siadat SD, Vaziri F, Sadeghi F, Fateh R, et.al.
Comparison of three different methods for detection of IL28 rs12979860
polymorphisms as a predictor of treatment outcome in patients with hepatitis
C virus. Osong Public Health Res Perspect. 2016;7:83-9.
[48] Zhang C, Liu Y, Ring BZ, Nie K, Yang M, Wang M, et.al. A novel multiplex
tetra-primer ARMS-PCR for the simultaneous genotyping of six single
nucleotide polymorphisms associated eith female cancers. PLoS ONE. 2013;
8:1-8.
[49] Little S. Amplification-refractory mutation system (ARMS) analysis of point
mutation. Hum Genet. 2000;9.8:1-12.
55
[50] Medrano RFV, de Oliveira CA. Guidelines for the tetra-primer ARMS-PCR
technique development. Mol Biotechnol. 2014;56:599-608.
[51] Najmabadi H, Teimourian S, Khatibi T, Neishabury M, Pourfarzad F, Jali-
Nejad S, et.al. Amplification refractory mutation system (ARMS) and reverse
hybridization in the detection of beta-thalassemia mutation. Arch Irn Med.
2014;4:165-70.
[52] Dahlan MS. Penelitian Deskriptif. In: Besar Sampel dan Cara Pengambilan
Sampel dalam Penelitian Kedokteran dan Kesehatan. Edisi ke-3. Jakarta:
Salemba Medika; 2013. h. 56-60.
[53] Yamashiro Y, Hattori Y, Ferania M, Kentaro M. Delta-aminolevulinic acid
dehydratase (ALAD) gene amplification by PCR and amplification-refractory
mutation system (ARMS). Materi dipresentasikan pada kegiatan UNJ
Workshop of Molecular Genetics, Universitas Negeri Jakarta, Jakarta. 25
Maret 2014.
[54] Geneaid. Blood/ cell DNA mini kit (GB100/GB300). 2017 Feb 10 [diakses
tanggal 30 Juni 2017]. Tersedia di
http://www.geneaid.com/products/genomic-dna-purification/dna-extraction-
kit-blood-cultured-cell-miniprep.
[55] Lorenz TC. Polymerase chain reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting
and Optimization Startegies. J Vis Exp. 2012;63:1-15.
[56] Thermo fisher scientific. Troubleshooting guide for DNA electrophoresis.
2012 [diakses tanggal 7 Juni 2017]. Tersedia di www.fermentas.com
[57] Magdeldin S. Gel electrophoresis: Principle and Basics. Croatia: In Tech;
2012. h. 25-41.
[58] Tantur S. Panduan penelitian untuk skripsi kedokteran & kesehatan. Jakarta;
2017. h. 102-5.
56
[59] Firdausi A. Identifikasi polimorfisme gen levulinat dehydratase (ALAD) pada
populasi anak yang mengalami anemia dan non anemia di Sekolah Dasar
Negeri 03 Kalideres, Jakarta Barat [skripsi]. [Rawamangun, Jakarta Timur]:
Universitas Negeri Jakarta; 2017.
57
Lampiran 1. Lembar Persetujuan Responden
SURAT PERSETUJUAN PENELITIAN
IDENTIFIKASI POLIMORFISME GEN DELTA – AMINOLEVULINIC ACID
EHYDRATASE (ALAD) DAN HUBUNGANNYA DENGAN KEJADIAN
ANEMIA PADA MAHASISWA PROGRAM STUDI KEDOKTERAN DAN
PROFESI DOKTER (PSKPD) UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
ANGKATAN 2012 – 2014
Saya Moch Rizki Ramadhan mahasiswa PSKPD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
angkatan 2014 sedang melakukan penelitin dengan judul “Identifikasi
Polimorfisme Gen Delta – Aminolevulinic Acid Dehydratase (ALAD) dan
Hubungannya dengan Kejadian Anemia pada Mahasiswa Program Studi
Kedokteran dan Profesi Dokter (PSKPD) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Angkatan 2012 – 2014”. Pada penelitian ini saya akan melakukan dua kali
pemeriksaan. Pemeriksaan pertama dilakukan dengan mengukur Hb darah
menggunakan alat Easy Touch® GCHb. Pemeriksaan ke dua dilakukan
pengambilan darah sebanyak 3 cc darah. Darah tersebut akan dibawa ke
laboratorium untuk dilakukan identifikasi polimorfisme gen ALAD. Pengambilan
darah dilakukan sesuai standar oleh analis yang sudah berpengalaman.
Pengambilan darah dapat menimbulkan komplikasi berupa nyeri dan hematoma.
Keluhan yang muncul setelah pengambilan darah akan ditatalaksana langsung.
Peneliti sudah mempersiapkan perangkat pencegahan dan pengobatan apabila
komplikasi muncul. Komplikasi Untuk itu, dengan hormat saya memohon
kesediaan Anda untuk ikut serta dalam penelitian ini.
Setelah membaca penjelasan di atas, bahwa yang bertanda tangan di bawah ini :
Nama : ______________________________________________
Umur : ________________________________________ Tahun
Alamat :______________________________________________
Dengan sukarela ikut serta dalam penelitian ini. Segala hal yang menyangkut
kerahasiaan tentang partisipan akan terjaga dengan baik oleh peneliti.
Ciputat, Mei 2015
Moch Rizki Ramadhan
Peneliti
No. Telpon : 085606644465
_________________
Mahasiswa
58
Lampiran 2. Lembar Persetujuan Etik
59
Lampiran 3. Gen ALAD pada Manusia[53]
agacgtcgtggcagaggctgttgcagaagggagctgaactgcagatgggagttca
aaaagagggcctcgaaggagccttccacagccgaattccggagctctgctactca
ggGCCTCAGTCTTCCCTCCTATTTAGTggatgcatccctgccccttctgtcctgg
gggcttgagccctcctggtgccatatgcagcttggtttctaacagaggcacacag
tgtggtggggtccggaggaccgttgcctgggacctgccttccttcaacccctcta
cccacacccacacagGTATGGTGTGAAGCGGCTGGAAGAGATGCTGAGGCCCTTG
GTGGAAGAGGGCCTACGCTGTGTCTTGATCTTTGGCGTCCCCAGCAGAGTTCCCA
AGgtgaagAATCAAAGGAAGGGCTAAGAAGGGAggttgcgctcacgcccgtaatc
ccagcactttgggaggccaaagtgggtggatcacttgagcccaggattttgagac
cagcctggacaacatggcaaaacccatctctacaaaaaatacaaa
Primer PCR
Primer ALAD Forward : 5’-GCCTCAGTCTTCCCTCCTATTTAGT-3’
Primer ALAD Reverse : 5’-TCCCTTCTTAGCCCTTCCTTTGATT-3’
60
Lampiran 4. Alat dan Bahan Penelitian
Easy Touch® GCHb
Hemoglobin Strip Test dan Blood
Lancets
Biomedical freezer
Vertical Laminar Flow Cabinet
ESCO Airstream
Timbangan Analitik Adventurer™
Microwave SHARP Low Wattage
Elektroforesis ATTO My Power II 300
AE-8135
Tray and Comb Elektroforesis
61
Printgraph ATTO AE-6905 CF CCD
Camera Controller
PCR Applied Biosystems 2720
Thermal Cycler
Microtip dan Microsentrifuge Tube
Microsentrifuge Eppendorf 5417 R
Waterbath AS ONE TRW-42 TP
Micropipet
Vortex
Genomic DNA Mini Kit Geneaid GB
100
62
Lampiran 5. Hasil Isolasi DNA Genom
63
Lampiran 6. Hasil Kemurnian dan Konsentrasi DNA Sampel
No. A230 A260 A280 A260/230 A260/280 Konsentrasi
1 0,262 0,515 0,251 1,963 2,053 25,77
2 1,209 2,18 1,108 1,802 1,968 108,99
3 0,177 0,348 0,166 1,97 2,094 17,4
4 0,899 2,267 1,129 2,523 2,007 113,35
5 0,242 0,337 0,234 1,395 1,438 16,86
6 0,588 1,105 0,587 1,881 1,881 55,25
7 -0,062 0,57 0,307 -9,226 1,858 28,51
8 -0,042 0,426 0,232 -10,04 1,835 21,32
9 0,129 0,413 0,213 3,208 1,935 20,64
10 -0,076 0,125 0,063 -1,66 1,986 6,27
11 -0,196 0,18 0,086 -0,921 2,089 9,02
12 0,457 0,923 0,499 2,019 1,849 46,13
13 -0,017 0,279 0,128 -16,772 2,175 13,95
14 -0,007 0,107 0,061 -14,587 1,775 5,37
15 -0,203 0,288 0,141 -1,423 2,042 14,42
16 -0,151 0,306 0,178 -2,028 1,72 15,32
17 -0,301 0,12 0,063 -0,4 1,912 6,01
18 0,054 0,496 0,352 9,182 1,409 24,79
19 -0,225 0,235 0,119 -1,043 1,973 11,75
20 -0,219 0,2 0,105 -0,914 1,898 10
21 -0,001 0,723 0,392 -847,665 1,845 36,13
22 -0,012 0,828 0,421 -71,179 1,964 41,38
23 0,22 0,951 0,504 4,325 1,887 47,55
24 0,247 1,097 0,621 4,438 1,768 54,87
25 -0,22 0,237 0,141 -1,081 1,684 11,87
26 -0,163 0,441 0,197 -2,704 2,235 22,06
27 -0,25 0,195 0,107 -0,782 1,827 9,75
28 0,425 0,982 0,739 2,31 1,329 49,08
29 0,097 1,009 0,485 10,382 2,081 50,46
30 0,143 0,801 0,532 5,609 1,505 40,05
31 2,57 2,265 1,623 0,881 1,395 113,23
32 0,867 1,46 1,039 1,684 1,406 73,01
33 0,092 0,836 0,463 9,122 1,805 41,78
34 1,256 3,73 2,151 2,971 1,734 186,52
35 0,111 1,081 0,53 9,734 2,04 54,05
36 1,202 2,128 1,364 1,771 1,56 106,42
37 0,842 1,627 1,113 1,933 1,462 81,35
64
Lanjutan
No. A230 A260 A280 A260/230 A260/280 Konsentrasi
38 0,211 0,715 0,558 3,387 1,281 35,73
39 0,097 1,013 0,511 10,468 1,98 50,63
40 0,186 1,19 0,601 6,385 1,98 59,49
41 0,868 1,481 1,056 1,707 1,403 74,07
42 -0,17 0,347 0,195 -2,042 1,78 17,36
43 0,143 1,101 0,544 7,681 2,022 55,04
44 1,015 2,162 1,376 2,129 1,571 108,1
45 -0,147 0,356 0,212 -2,418 1,679 17,81
46 -0,118 0,414 0,252 -3,51 1,641 20,7
47 -0,099 0,648 0,309 -6,562 2,1 32,42
48 0,722 1,304 0,867 1,804 1,503 65,18
49 0,969 1,121 0,838 1,157 1,339 56,06
50 0,277 1,253 0,648 4,532 1,934 62,66
51 -0,144 0,302 0,153 -2,105 1,972 15,1
52 0,461 1,444 0,796 3,131 1,815 72,22
53 0,272 0,965 0,559 3,554 1,725 48,24
54 0,636 1,285 0,878 2,019 1,464 64,24
55 0,575 1,94 0,944 3,371 2,054 96,98
56 -0,29 0,047 0,022 -0,162 2,11 2,35
57 -0,283 0,016 0,009 -0,055 1,654 0,78
58 -0,333 0,011 0,009 -0,034 1,247 0,57
59 -0,309 0,118 0,05 -0,381 2,331 5,88
60 1,302 1,541 1,398 1,183 1,102 77,03
61 -0,288 0,22 0,105 -0,765 2,102 11
62 0,468 1,783 1,01 3,81 1,766 89,14
63 0,149 0,945 0,548 6,324 1,724 47,27
64 0,32 1,008 0,614 3,145 1,642 50,4
65 0,306 1,261 0,686 4,118 1,838 63,03
66 0,194 1,021 0,593 5,251 1,72 51,05
67 0,271 1,214 0,662 4,474 1,835 60,72
68 0,603 1,356 0,942 2,248 1,439 67,78
69 0,217 1,095 0,586 5,05 1,869 54,73
70 -0,132 0,407 0,229 -3,076 1,775 20,35
71 0,082 0,852 0,51 10,417 1,671 42,62
72 -0,004 0,757 0,42 -186,279 1,804 37,87
73 0,236 0,992 0,581 4,2 1,709 49,61
74 -0,02 0,683 0,378 -33,861 1,806 34,16
75 -0,122 0,473 0,246 -3,872 1,92 23,64
65
Lanjutan
No. A230 A260 A280 A260/230 A260/280 Konsentrasi
76 0,08 0,816 0,487 10,173 1,676 40,8
77 0,114 0,86 0,548 7,513 1,571 43,01
78 0,017 0,685 0,47 39,492 1,459 34,27
79 0,178 0,988 0,715 5,564 1,382 49,4
80 0,211 0,937 0,541 4,446 1,732 46,86
81 0,416 1,207 0,697 2,899 1,733 60,37
82 0,587 2,023 0,96 3,448 2,108 101,16
83 2,678 5,249 3,034 1,96 1,73 262,43
84 1,137 1,644 0,909 1,446 1,808 82,2
85 0,625 1,182 0,821 1,892 1,44 59,1
86 0,038 0,911 0,427 23,765 2,136 45,56
87 0,072 0,874 0,418 12,113 2,092 43,72
88 0,279 0,992 0,507 3,557 1,958 49,6
89 2,394 3,807 3,01 1,591 1,265 190,37
90 1,004 1,619 1,134 1,613 1,428 80,95
91 0,199 1,149 0,608 5,783 1,891 57,47
92 0,669 1,39 0,842 2,078 1,652 69,51
93 0,547 1,19 0,626 2,177 1,901 59,5
94 1,508 1,979 1,113 1,313 1,778 98,96
95 0,195 0,943 0,459 4,829 2,055 47,14
96 0,764 2,306 1,11 3,02 2,077 115,31
97 0,437 1,697 0,788 3,885 2,152 84,84
98 0,501 0,842 0,519 1,681 1,622 42,08
99 0,019 0,707 0,347 37,568 2,038 35,36
100 1,247 2,727 1,524 2,186 1,79 136,37
101 0,247 1,117 0,59 4,521 1,893 55,83
102 -0,191 0,251 0,129 -1,311 1,944 12,53
66
Lampiran 7. Hasil PCR Tahap 2
67
Lanjutan
68
Lanjutan
69
Lampiran 8. Karakteristik Sampel
No. Sampel Jenis Kelamin Usia (Tahun) Hb (g/dl) Kriteria Kadar Hb Alel ALAD Gen ALAD
1 Perempuan 21 14,0 Normal GG ALAD-1
2 Perempuan 21 12,7 Normal GC ALAD-1/2
3 Perempuan 20 9,3 Anemia GC ALAD-1/2
4 Perempuan 20 10,1 Anemia GC ALAD-1/2
5 Perempuan 20 8,1 Anemia GC ALAD-1/2
6 Laki-Laki 21 11,7 Anemia GG ALAD-1
7 Laki-Laki 21 15,2 Normal GC ALAD-1/2
8 Perempuan 20 10,5 Anemia GG ALAD-1
9 Perempuan 20 13,1 Normal GG ALAD-1
10 Perempuan 23 11,2 Anemia GC ALAD-1/2
11 Laki-Laki 20 14,9 Normal CC ALAD-2
12 Laki-Laki 20 11,0 Anemia GG ALAD-1
13 Laki-Laki 21 15,3 Normal GG ALAD-1
14 Laki-Laki 23 13,1 Normal GG ALAD-1
15 Laki-Laki 21 13,2 Normal GG ALAD-1
16 Perempuan 20 13,1 Normal GC ALAD-1/2
70
Lanjutan
No. Sampel Jenis Kelamin Usia (Tahun) Hb (g/dl) Kriteria Kadar Hb Alel ALAD Gen ALAD
17 Perempuan 21 8,8 Anemia GG ALAD-1
18 Perempuan 21 11,6 Normal GG ALAD-1
19 Perempuan 21 8,4 Anemia GC ALAD-1/2
20 Perempuan 21 9,7 Anemia GC ALAD-1/2
21 Perempuan 20 8,6 Anemia GC ALAD-1/2
22 Laki-Laki 20 18,5 Normal CC ALAD-2
23 Laki-Laki 20 10,0 Anemia GC ALAD-1/2
24 Perempuan 21 11,1 Anemia GG ALAD-1
25 Perempuan 21 8,0 Anemia GC ALAD-1/2
26 Perempuan 23 8,6 Anemia GC ALAD-1/2
27 Laki-Laki 20 14,1 Normal GC ALAD-1/2
28 Laki-Laki 21 13,3 Normal GC ALAD-1/2
29 Laki-Laki 20 12,3 Anemia GC ALAD-1/2
30 Perempuan 20 9,5 Anemia GC ALAD-1/2
31 Perempuan 20 10,4 Anemia GC ALAD-1/2
32 Perempuan 21 9,5 Anemia CC ALAD-2
71
Lanjutan
No. Sampel Jenis Kelamin Usia (Tahun) Hb (g/dl) Kriteria Kadar Hb Alel ALAD Gen ALAD
33 Perempuan 21 12,9 Normal GC ALAD-1/2
34 Laki-Laki 20 12,0 Anemia GG ALAD-1
35 Perempuan 21 11,4 Anemia GG ALAD-1
36 Perempuan 20 12,8 Normal GC ALAD-1/2
37 Laki-Laki 20 15,0 Normal GC ALAD-1/2
38 Laki-Laki 20 14,6 Normal GG ALAD-1
39 Laki-Laki 20 8,4 Anemia GC ALAD-1/2
40 Laki-Laki 20 12,7 Normal GC ALAD-1/2
41 Perempuan 20 13,1 Normal GC ALAD-1/2
42 Laki-Laki 20 12,0 Anemia GC ALAD-1/2
43 Laki-Laki 20 13,9 Normal GC ALAD-1/2
44 Perempuan 20 10,7 Anemia GC ALAD-1/2
45 Perempuan 20 12,0 Normal GC ALAD-1/2
46 Laki-Laki 20 14,8 Normal GC ALAD-1/2
47 Perempuan 20 9,8 Anemia GC ALAD-1/2
48 Perempuan 20 8,9 Anemia GC ALAD-1/2
72
Lanjutan
No. Sampel Jenis Kelamin Usia (Tahun) Hb (g/dl) Kriteria Kadar Hb Alel ALAD Gen ALAD
49 Perempuan 20 9,7 Anemia GC ALAD-1/2
50 Perempuan 20 12,6 Normal GC ALAD-1/2
51 Perempuan 20 12,0 Normal GC ALAD-1/2
52 Perempuan 20 8,7 Anemia CC ALAD-2
53 Laki-Laki 18 11,2 Anemia GC ALAD-1/2
54 Laki-Laki 18 11,9 Anemia GC ALAD-1/2
55 Laki-Laki 18 11,0 Anemia GC ALAD-1/2
56 Perempuan 19 10,1 Anemia GC ALAD-1/2
57 Perempuan 19 10,2 Anemia GC ALAD-1/2
58 Perempuan 18 12,1 Normal GC ALAD-1/2
59 Perempuan 18 11,2 Anemia CC ALAD-2
60 Perempuan 18 8,2 Anemia GG ALAD-1
61 Laki-Laki 18 13,8 Normal GC ALAD-1/2
62 Perempuan 18 9,3 Anemia GC ALAD-1/2
63 Perempuan 18 12,6 Normal GC ALAD-1/2
64 Perempuan 18 11,0 Anemia GC ALAD-1/2
73
Lanjutan
No. Sampel Jenis Kelamin Usia (Tahun) Hb (g/dl) Kriteria Kadar Hb Alel ALAD Gen ALAD
65 Perempuan 18 12,9 Normal GC ALAD-1/2
66 Perempuan 18 10,0 Anemia GC ALAD-1/2
67 Perempuan 18 8,8 Anemia CC ALAD-2
68 Perempuan 18 11,1 Anemia GC ALAD-1/2
69 Perempuan 18 8,7 Anemia GC ALAD-1/2
70 Perempuan 18 12,7 Normal GC ALAD-1/2
71 Laki-Laki 18 13,8 Normal GC ALAD-1/2
72 Laki-Laki 18 11,4 Anemia GC ALAD-1/2
73 Laki-Laki 18 12,3 Anemia GG ALAD-1
74 Laki-Laki 18 16,4 Normal GC ALAD-1/2
75 Perempuan 18 11,3 Anemia CC ALAD-2
76 Perempuan 18 10,9 Anemia GG ALAD-1
77 Perempuan 18 12,0 Normal GC ALAD-1/2
78 Perempuan 18 11,4 Anemia CC ALAD-2
79 Perempuan 18 9,8 Anemia GC ALAD-1/2
80 Perempuan 18 12,8 Normal CC ALAD-2
74
Lanjutan
No. Sampel Jenis Kelamin Usia (Tahun) Hb (g/dl) Kriteria Kadar Hb Alel ALAD Gen ALAD
81 Laki-Laki 19 11,8 Anemia GC ALAD-1/2
82 Perempuan 19 12,6 Normal GC ALAD-1/2
83 Perempuan 19 13,1 Normal GC ALAD-1/2
84 Perempuan 18 12,6 Normal GG ALAD-1
85 Perempuan 19 11,2 Anemia GC ALAD-1/2
86 Perempuan 19 11,1 Anemia GC ALAD-1/2
87 Laki-Laki 19 15,1 Normal GG ALAD-1
88 Perempuan 19 11,1 Anemia GG ALAD-1
89 Perempuan 19 9,9 Anemia GC ALAD-1/2
90 Perempuan 19 10,5 Anemia GG ALAD-1
91 Perempuan 19 8,0 Anemia GC ALAD-1/2
92 Laki-Laki 19 12,0 Anemia GC ALAD-1/2
93 Laki-Laki 19 12,1 Anemia GG ALAD-1
94 Perempuan 19 10,0 Anemia GC ALAD-1/2
95 Perempuan 19 11,1 Anemia GC ALAD-1/2
96 Laki-Laki 19 13,1 Normal GC ALAD-1/2
75
Lanjutan
No. Sampel Jenis Kelamin Usia (Tahun) Hb (g/dl) Kriteria Kadar Hb Alel ALAD Gen ALAD
97 Laki-Laki 19 10,4 Anemia GC ALAD-1/2
98 Perempuan 19 10,4 Anemia GC ALAD-1/2
99 Laki-Laki 19 13,2 Normal GC ALAD-1/2
100 Laki-Laki 19 14,7 Normal GC ALAD-1/2
101 Laki-Laki 19 10,5 Anemia GC ALAD-1/2
102 Perempuan 19 15,7 Normal GC ALAD-1/2
Keterangan :
Kriteria Kadar Hb Menurut Kementrian Kesehatan Republik Indonesia 2011 [36]
Jenis Kelamin Pria Wanita
Hb Normal 13 – 18 g/dl 12 – 16 g/dl
76
Lampiran 9. Hasil Analisis Statistik
A. Jenis Kelamin
Statistics
Jenis_Kelamin
N Valid 102
Missing 0
Jenis_Kelamin
Frequency Percent Valid Percent
Cumulative
Percent
Valid Laki-Laki 37 36.3 36.3 36.3
Perempuan 65 63.7 63.7 100.0
Total 102 100.0 100.0
B. Usia (Tahun)
Statistics
Usia
N Valid 102
Missing 0
Usia
Frequency Percent Valid Percent
Cumulative
Percent
Valid 18 27 26.5 26.5 26.5
19 23 22.5 22.5 49.0
20 33 32.4 32.4 81.4
21 16 15.7 15.7 97.1
23 3 2.9 2.9 100.0
Total 102 100.0 100.0
Descriptive Statistics
N Minimum Maximum Mean Std. Deviation
Usia 102 18 23 19.49 1.208
Valid N (listwise) 102
77
Lanjutan
C. Hemoglobin (g/dl)
Statistics
Hemoglobin_Kadar
N Valid 102
Missing 0
Hemoglobin_Kadar
Frequency Percent Valid Percent
Cumulative
Percent
Valid 8.0 2 2.0 2.0 2.0
8.1 1 1.0 1.0 2.9
8.2 1 1.0 1.0 3.9
8.4 2 2.0 2.0 5.9
8.6 2 2.0 2.0 7.8
8.7 2 2.0 2.0 9.8
8.8 2 2.0 2.0 11.8
8.9 1 1.0 1.0 12.7
9.3 2 2.0 2.0 14.7
9.5 2 2.0 2.0 16.7
9.7 2 2.0 2.0 18.6
9.8 2 2.0 2.0 20.6
9.9 1 1.0 1.0 21.6
10.0 3 2.9 2.9 24.5
10.1 2 2.0 2.0 26.5
10.2 1 1.0 1.0 27.5
10.4 3 2.9 2.9 30.4
10.5 3 2.9 2.9 33.3
10.7 1 1.0 1.0 34.3
10.9 1 1.0 1.0 35.3
11.0 3 2.9 2.9 38.2
11.1 5 4.9 4.9 43.1
11.2 4 3.9 3.9 47.1
11.3 1 1.0 1.0 48.0
11.4 3 2.9 2.9 51.0
11.6 1 1.0 1.0 52.0
78
11.7 1 1.0 1.0 52.9
11.8 1 1.0 1.0 53.9
11.9 1 1.0 1.0 54.9
12.0 6 5.9 5.9 60.8
12.1 2 2.0 2.0 62.7
12.3 2 2.0 2.0 64.7
12.6 4 3.9 3.9 68.6
12.7 3 2.9 2.9 71.6
12.8 2 2.0 2.0 73.5
12.9 2 2.0 2.0 75.5
13.1 6 5.9 5.9 81.4
13.2 2 2.0 2.0 83.3
13.3 1 1.0 1.0 84.3
13.8 2 2.0 2.0 86.3
13.9 1 1.0 1.0 87.3
14.0 1 1.0 1.0 88.2
14.1 1 1.0 1.0 89.2
14.6 1 1.0 1.0 90.2
14.7 1 1.0 1.0 91.2
14.8 1 1.0 1.0 92.2
14.9 1 1.0 1.0 93.1
15.0 1 1.0 1.0 94.1
15.1 1 1.0 1.0 95.1
15.2 1 1.0 1.0 96.1
15.3 1 1.0 1.0 97.1
15.7 1 1.0 1.0 98.0
16.4 1 1.0 1.0 99.0
18.5 1 1.0 1.0 100.0
Total 102 100.0 100.0
Descriptive Statistics
N Minimum Maximum Mean Std. Deviation
Hemoglobin_Kadar 102 8.0 18.5 11.627 2.0708
Valid N (listwise) 102
Lanjutan
79
Lanjutan
D. Hemoglobin Kategori
Statistics
Hemoglobin_Kategori
N Valid 102
Missing 0
Hemoglobin_Kategori
Frequency Percent Valid Percent
Cumulative
Percent
Valid Normal 41 40.2 40.2 40.2
Anemia 61 59.8 59.8 100.0
Total 102 100.0 100.0
E. Alel ALAD
Statistics
Gen
N Valid 102
Missing 0
Gen
Frequency Percent Valid Percent
Cumulative
Percent
Valid GG 22 21.6 21.6 21.6
GC 71 69.6 69.6 91.2
CC 9 8.8 8.8 100.0
Total 102 100.0 100.0
80
F. Gen ALAD
Statistics
Gen
N Valid 102
Missing 0
Gen
Frequency Percent Valid Percent
Cumulative
Percent
Valid ALAD-1 22 21.6 21.6 21.6
ALAD-1/2 71 69.6 69.6 91.2
ALAD-2 9 8.8 8.8 100.0
Total 102 100.0 100.0
G. Hubungan Polimorfisme Genetik ALAD dengan Jenis Kelamin
Case Processing Summary
Cases
Valid Missing Total
N Percent N Percent N Percent
Gen * Jenis_Kelamin 102 100.0% 0 0.0% 102 100.0%
Gen * Jenis_Kelamin Crosstabulation
Jenis_Kelamin
Total Laki-Laki Perempuan
Gen ALAD-1 Count 10 12 22
% within Gen 45.5% 54.5% 100.0%
% within Jenis_Kelamin 27.0% 18.5% 21.6%
ALAD-1/2 Count 25 46 71
% within Gen 35.2% 64.8% 100.0%
% within Jenis_Kelamin 67.6% 70.8% 69.6%
ALAD-2 Count 2 7 9
% within Gen 22.2% 77.8% 100.0%
% within Jenis_Kelamin 5.4% 10.8% 8.8%
Total Count 37 65 102
% within Gen 36.3% 63.7% 100.0%
% within Jenis_Kelamin 100.0% 100.0% 100.0%
81
H. Hubungan Polimorfisme Genetik ALAD dengan Usia
Gen * Usia Crosstabulation
Usia
Total 18 19 20 21 23
Gen ALAD-1 Count 4 4 5 8 1 22
% within Gen 18.2% 18.2% 22.7% 36.4% 4.5% 100.0%
% within Usia 14.8% 17.4% 15.2% 50.0% 33.3% 21.6%
ALAD-1/2 Count 18 19 25 7 2 71
% within Gen 25.4% 26.8% 35.2% 9.9% 2.8% 100.0%
% within Usia 66.7% 82.6% 75.8% 43.8% 66.7% 69.6%
ALAD-2 Count 5 0 3 1 0 9
% within Gen 55.6% 0.0% 33.3% 11.1% 0.0% 100.0%
% within Usia 18.5% 0.0% 9.1% 6.3% 0.0% 8.8%
Total Count 27 23 33 16 3 102
% within Gen 26.5% 22.5% 32.4% 15.7% 2.9% 100.0%
% within Usia 100.0% 100.0% 100.0% 100.0% 100.0% 100.0%
Case Processing Summary
Cases
Valid Missing Total
N Percent N Percent N Percent
Gen * Usia 102 100.0% 0 0.0% 102 100.0%
82
I. Hubungan Polimorfisme Genetik ALAD dengan Kejadian Anemia
Case Processing Summary
Cases
Valid Missing Total
N Percent N Percent N Percent
Gen * Hemoglobin_Kategori 102 100.0% 0 0.0% 102 100.0%
Gen * Hemoglobin_Kategori Crosstabulation
Hemoglobin_Kategori
Total Normal Anemia
Gen ALAD-1 Count 9 13 22
% within Gen 40.9% 59.1% 100.0%
% within
Hemoglobin_Kategori 22.0% 21.3% 21.6%
ALAD-1/2 Count 29 42 71
% within Gen 40.8% 59.2% 100.0%
% within
Hemoglobin_Kategori 70.7% 68.9% 69.6%
ALAD-2 Count 3 6 9
% within Gen 33.3% 66.7% 100.0%
% within
Hemoglobin_Kategori 7.3% 9.8% 8.8%
Total Count 41 61 102
% within Gen 40.2% 59.8% 100.0%
% within
Hemoglobin_Kategori 100.0% 100.0% 100.0%
Chi-Square Tests
Value df
Asymp. Sig. (2-
sided)
Pearson Chi-Square .193a 2 .908
Likelihood Ratio .197 2 .906
Linear-by-Linear Association .084 1 .772
N of Valid Cases 102
a. 1 cells (16.7%) have expected count less than 5. The minimum
expected count is 3.62.
83
Lampiran 10. Nilai Normal Pemeriksaan Hematologi Eritrosit [32, 36]
Pemeriksaan
Indikator Normal Dewasa
Laki – Laki Perempuan Laki – Laki
dan
Perempuan
Hemoglobin (g/dl) 13 – 18 12 – 16
Hematokrit (%) 40 – 50 35 – 45
Eritrosit (sel/mm3) 4,4 x 106 –
5,6 x 106
3,8 x 106 –
3,5 x 106
MCV (fL) 80 – 100
MCH (pg/sel) 28 – 34
MCHC (g/dl) 32 – 36
Retikulosit (%) 0,5 – 2
Ferritin Serum (µg/L) 40 – 340 14 – 150
Fe Serum (µmol/L) 10 – 30
TIBC (µmol/L) 40 – 75
Transferrin (g/L) 2 – 4
Vit. B12 serum (ng/L) 160 – 925
Asam Folat serum
(nmol/L)
3 – 15
Red Cell Follate (µg/L) 160 – 640
84
Lampiran 11. Curriculum Vitae Peneliti
CURRICULUM VITAE
A. Identitas Diri
Nama : Moch Rizki Ramadhan
Jenis Kelamin : Laki – Laki
Tempat, Tanggal Lahir : Sidoarjo, 8 Januari 1998
Glongan Darah : B +
Agama : Islam
E-mail : [email protected]
Alamat : Perum Jala Griya TNI – AL Blok C10 No.
25, RT.27, RW.08, Kedung
Kendo, Candi, Sidoarjo, Jawa Timur.
B. Pendidikan
Sekolah Dasar : MI Maarif Candi, Sidoarjo, Jawa Timur
Sekolah Menengah Pertama : MTs Unggulan Prog. Akselerasi Ponpes.
Amanatul Ummah, Kembang Belor, Pacet,
Mojokerto Jawa Timur.
Sekolah Menengah Atas : MA Unggulan Prog. Akselerasi Ponpes.
Amanatul Ummah, Kembang Belor, Pacet,
Mojokerto Jawa Timur.
Universitas : UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
C. Pengalaman Organisasi
1. Sekretaris HMPS PD UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 2015 – 2017
2. Wakil Ketua CSSMoRA UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 2016 – 2017
3. Kadiv Scientech MERCY UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 2015 – 2017
D. Penghargaan
1. Juara 1 Try Out SD Se – Kab. Sidoarjo 2010
2. 20 Besar Try Out SD/MI Se – Gerbangkertasusilapas 2010
3. Juara Harapan 3 Try Out SMP/MTs Se – Jawa Timur 2012
4. Delegasi International Indonesian Medical Olympiad FK UPH 2016
Cabang Neuropsikiatri.