AAA ATT CCT ATT GAC GGG ACT CCT GGG GAA ACC GGC ATT GTG GAG GCT AAG TAT GCT GGG TAT CAC CGG AGG CGA GGC CCC TTC CGG GGC ACG GTC TGT GCA CTC AGG GGG ATG GTA GCC CCC ATG TCT ACA GGT GTG GAG CGC TTC TG TTT AGG TAG ATC GCA GTG GGC TGC TTA TAG GGA TAG CGG ACT AAG CAG ACA C

IDENTIFIKASI GEN MER A MELALUI METODE KOMPUTASI

A. BAKTERI mer A 1

Berdasarkan hasil sekuens bakteri mer A 1 dengan hasil sebagai berikut:

Diperoleh kekerabatan melalui program BLASTX (untuk penjajaran protein melalui urutan nukleotida) dengan presentasi kedekatan sebesar 43% dengan bakteri Streptomyces tendae

Walaupun tidak memiliki kekerabatan yang dekat, namun dapat diasumsikan bahwa struktur protein kedua bakteri mirip. Berikut struktur 3D bakteri Streptomyces tendae (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi#alnHdr_157835556).

Penjelasan Ligan.

Na : bertindak sebagai ligan yang berfungsi sebagai kofaktor enzim

Sebelum berikatan

Ion Na akan berikatan dengan asam amino sisi aktif antara lain atom oksigen karbonil Ala266 dan Gly268 ditambah 4 molekul air, dan membentuk His262 jembatan garam dengan Glu269 dengan gambar sebagai berikut.

Na

6PC

FAD

Sesudah berikatan dengan ion Na (violet). (Carrell et al., 2007)

FAD : FLAVIN-ADENINE DINUCLEOTIDE (C27 H33 N9 O15 P2)

FAD akan berikatan dengan sisi aktir berupa Trp355, Phe242, Phe244, Tyr258, Phe260 yang merupakan golongan asam amino dengan rantai aromatik. Hal ini dapat mempengaruhi terjadinya interaksi dengan molekul FAD (Carrell et al., 2007).

Struktur FAD FAD dalam protein

Gambar FAD berikatan dengan sisi aktif protein (Carrell et al., 2007)

6PC : PYRIDINE-2-CARBOXYLIC ACID (C6 H5 N O2)

Sementara PCA akan berikatan dengan residu asam amino Trp355, Phe242, Phe244, Tyr258, Phe260 (Carrell et al., 2007)

Interaksi Ligan

(http://www.rcsb.org/)

Bila ditinjau kembali pohon filogenetik, isolate bakteri 1 memiliki kekerabatan dengan Pseudomonas stutzeri dengan nilai distance (D) sebesar 2,8132. Nilai D tersebut dapat mewakili kekerabatan sehingga dapat diasumsikan bahwa bakteri 1 memiliki kekerabatan dengan Pseudomonas stutzeri.

Taxonomi Pseudomonas stutzeri

cellular organisms

Bacteria    (superkingdom)

Proteobacteria    (phylum)

Gammaproteobacteria    (class)

Pseudomonadales    (order)

Pseudomonadaceae    (family)

Pseudomonas    (genus)

Pseudomonas stutzeri group    (species group)

Pseudomonas stutzeri subgroup    (species subgroup)

Pseudomonas stutzeri (species)

Reaksi redoks

Metabolism pathway

Berdasarkan gambar reaksi dan metabolism dapat disimpulkan bahwa NADPH bertindak sebagai sumber energy bagi bakteri, sehingga pada tahap reaksi akan melepaskan energy untuk mengubah Hg2+ menjadi Hg0 yang volatile.Dalam protein, NADPH akan berikatan dengan sisi aktif asam amino tertentu seperti pada gambar (Glu190, Phe348, Phe 316, Gln315, Arg169, Val186, Phe 212, Thr267, pro153)

Sehingga dalam protein akan terlihat seperti berikut

Struktur NADPH

Molekul NADPH

Interaksi NADPH dalam protein

Sedangkan ion merkuri (Hg) akan berinteraksi dengan sisi aktif asam amino yang mengandung gugus –SH, seperti sistein.

Interaksi Hg dengan sisi aktif asam amino sistein (Cys 464 dan Cys 465).

+ Hg

Enzim merkuri reduktase Enzim merkuri reduktase + Hg

Enzim merkuri reduktase + Hg (hijau)Enzim merkuri reduktase with unknown

metal (tanpa Hg)

GAGAAAGCCGGATGGGGGGGGCACCCGGGGCGGCAGCGCGGGTTGAGCAGGGCAATGGTGGTGCTGGCTGTCGTGGGAGGGGAGTCCCCCTCCCGAAGCGCGTTCACGGGCACTAACCTAGAATGACAATCCCCACCCCTAACAATGCCGCACAGCTTTTGAGTCCGGAAGCTTAGACTGTGAAGGCTACGCGAGCGTAATGAGTGAGCTAACA

B. BAKTERI mer A 2

Berdasarkan hasil sekuensing, isolate bombana 2 memiliki urutan nukleotida sebagai berikut.

Urutan nukleotida ini kemudian di olah kedalam software MEGA 5.1 untuk melihat kekerabatan bakteri dengan database yang sudah ada melalui pohon filogenetik.

Berdasarkan pohon filogenetik, isolate bombana 2 memiliki kekerabatan yang cukup dekat dengan Pseudomonas aeruginosa dengan nilai D (jarak) sebesar 1,3857. Nilai D merupakan indicator kekerabatan suatu mikroorganisme satu dengan yang lainnya, semakin rendah nilai D maka semakin dekat pula kekerabatan antar bakteri tersebut, begitu pun sebaliknya. Hal ini berbeda dengan hasil yang sebelumnya bahwa isolate bombana 2 memiliki kedekatan dengan bakteri Streptomyces coelicolor A3 dengan nilai D sebesar 1,9604. Ini memberikan keterangan bahwa isolate bombana 2 lebih dekat dengan bakteri Pseudomonas aeruginosa.

Hal ini dibuktikan juga pada hasil blastN di NCBI bahwa isolate bombana 2 memiliki kekerabatan dengan bakteri Pseudomonas aeruginosa dengan presentasi kedekatan 29-57%.

Berdasarkan hasil penjajaran BlastN dan pohon filogenetik, dapat diasumsikan bahwa isolate bombana 2 memiliki kedekatan dengan bakteri Pseudomonas aeruginosa.

Taksonomi Pseudomonas aeruginosa

Metabolism merkuri dalam bakterio Sistem detoksifikasi merkuri oleh sel bakteri yang paling umum adalah sistem

terinduksi (inducible system) yang melibatkan dua macam enzim yaitu merkuri

reduktase (EC.1.161.1) dan organomerkuri liase (EC.4.99.1.2.)serta satu sistem

pengangkutan Hg2+. Ketiganya dikode oleh gen-gen yang terdapat pada plasmid dan

transposon. Enzim merkuri reduktase merupakan enzim yang bertanggung jawab

terhadap reduksi Hg2+menjadi Hg0. Sedangkan enzim organomerkuri liase bekerja

dengan memutuskan ikatan karbon-merkuri seperti pada senyawa metil (CH3Hg+) dan

senyawa etil (C6H5Hg+) menjadi senyawa Hg2+ yang kemudian direduksi oleh enzim

merkuri reduktase menjadi Hg0(Prasetyawati, 2009).

o Enzim merkuri reduktase mengandung residu sistein yang aktif melakukan reduksi

oksidasi merkuri pada sisi aktifnya yang melibatkan pemindahan elektron dari NADH

ke FAD, kemudian ke sisi aktif disulfida dan pada akhirnya ke Hg2+yang terkhelat

(William dan Silver dalam Prasetyawati, 2009).

Karakter enzim merkuri reduktase1. Reaksi

2. Molekul 3D enzim merkuri reduktase

3. Ligan-ligano 2,4,6-trinitrobenzenasulfonat + NADPH

FAD

NADH

Hg2+ Hg2+

Enzim merkuri reduktase Enzim merkuri reduktase

o NADPH

NADPH melekat pada asam-asam amino Phe212, Thr267, Pro153, Arg269, Val189, Phe316, Phe348.

NADPH in enzyme

NADPH

o FAD

FAD

FAD in enzim

FAD melekat pada asam-asam amino Ala117, Asp309, Ala15,Val317, Thr41, Glu34, Cys47, Lys51.

o SO4

Molekul Sulfat

4. Kofaktor dan Senyawa activatora. NADPH dan FAD

NADPH merupakan substrat alami yang dimiliki oleh enzim merkuri reduktase. Dimana NADPH berperan sebagai sumber energy yang dilepaskan ketika enzim mengikat logam. Sedangkan Flavin Adenin Dinukleotida (FAD) merupakan Gugus prostetik yang terikat pada enzim dan sukar terlepas dari enzimnya. FAD berperan dalam mediasi transfer electron antara NADPH dengan Hg2+.

Skema hipotetis untuk reaksi antara merkuri reduktase dan piridin nukleotida.

b. SisteinSistein berperan dalam pengikatan logam merkuri dalam enzim merkuri reduktase. Sehingga, bila sistein ditambahkan kedalam enzim merkuri reduktase,

Molekul Sulfat berikatan dengan asam-asam amino Ser275 dan Arg35

maka laku reaksi pengikatan Hg akan meningkat pula. Hal ini didukung melalui penelitian yang dilakukan Sandstrom dan Lindskog (1987) dimana pada konsentrasi sistein 1 mM, 30 menit preincubation, tingkat awal relatif 121%, dan setelah dinaikkan konsentrasi sistein menjadi 30 mM, 30 menit preincubation, tingkat awal relatif menjadi 200%.

5. Inhibitor6. Konstanta kinetika