RIZKA OKTARIANTI AINUN JARIAH

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2014

IDENTIFIKASI BAKTERI PENGOKSIDASI METANA DAN

GEN FUNGSIONAL ISOLAT DARI TANAH SAWAH

DAN GAMBUT

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK

CIPTA

Saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Identifikasi Bakteri Pengoksidasi

Metana dan Gen Fungsional Isolat dari Tanah Sawah dan Gambut adalah benar

karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam

bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang

berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari

penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di

bagian akhir skripsi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.

Bogor, Juli 2014

Rizka Oktarianti Ainun Jariah

NIM G84100030

*Pelimpahan hak cipta atas karya tulis dari penelitian kerja sama dengan

pihak luar IPB harus didasarkan pada perjanjian kerja sama yang terkait

ABSTRAK

RIZKA OKTARIANTI AINUN JARIAH. Identifikasi Bakteri Pengoksidasi

Metana dan Gen Fungsional Isolat dari Tanah Sawah dan Gambut. Dibimbing

oleh SYAMSUL FALAH dan I MADE SUDIANA.

Gas metana merupakan salah satu gas penyebab pemanasan global. Bakteri

metanotrof menggunakan gas metan sebagai sumber karbonnya, sehingga dapat

berperan penting dalam penurunan gas metan di atmosfer. Penelitian ini bertujuan

mengisolasi mikroba yang dapat mengoksidasi metana dan mengidentifikasi gen

pengoksidasi gas metan. Tujuh isolat bakteri metanotrof (AM1, AM2, AM3, AM4,

AM5, AM6, dan AM7) di isolasi dari tanah sawah dan tanah gambut melalui

teknik pengayaan dengan media NMS (nitrate mineral salts) yang ditambahkan

gas metana. Ketujuh isolat mampu menghabiskan 15 mL gas metan pada minggu

ke-3 inkubasi dengan rata-rata konsumsi metana 0,7 mL per hari. Identifikasi gen

yang mengkodekan enzim metan monooksigenase (pmoA) menggunakan dua

primer yaitu 189f - 682r dan 189f - 650r menunjukkan AM1, AM2, AM4, AM5,

dan AM6 memiliki gen pmoA. Identifikasi untuk gen mxaF (metanol

dehidrogenase) yang dilakukan menunjukkan semua isolat mempunyai gen mxaF.

Hasil perunutan DNA gen 16S rRNA dan analisis blast menunjukkan enam isolat

masuk ke dalam genus Methylocystis dan satu isolat masuk ke dalam genus

Mesorhizobium. Analisis filogenetik menunjukkan isolat metanotrof yang di

isolasi merupakan spesies baru.

Kata kunci: gen pmoA, gen mxaF, Methylocystis, Mesorhizobium.

ABSTRACT

RIZKA OKTARIANTI AINUN JARIAH. Identification of Methane Oxidizing

Bacteria and Functional Gene in Rice Field and Wet Land Isolates. Supervised by

SYAMSUL FALAH and I MADE SUDIANA.

Methane is one of green house gases. Methanotrophic bacteria can use

methane as their carbon sources, therefore this bacteria has important role to

reduce methane emission from soil and wet land. This research aim to isolate

methane oxidizing bacteria and identify genes responsible for methane oxidation.

Seven isolates of methanotrophic bacterias (AM1, AM2, AM3, AM4, AM5, AM6,

dan AM7) were isolated from rice field and wet land through sub-culture in NMS

(nitrate mineral salts) added by methane gases method. All of isolates could use

15 mL of methane gases at the third weeks of incubation and 0,7 mL per day in

average. Identification of methane monooxygenase (pmoA) gene used two sets

primer, 189f - 682r and 189f - 650r. The results showed isolates AM1, AM2,

AM4, AM5, and AM6 had pmoA genes. All of the isolates also had functional

methanol dehydrogenase (mxaF) gene. The result of 16S rRNA and blast analysis

confirmed that six isolates were identified as Methylocystis and one isolate was

Mesorhizobium. Phylogenetic analysis shows all strains would be novel species.

Keywords: Methylocystis, Mesorhizobium, mxaF gene, pmoA gene.

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains

pada

Departemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2014

RIZKA OKTARIANTI AINUN JARIAH

IDENTIFIKASI BAKTERI PENGOKSIDASI METANA DAN

GEN FUNGSIONAL ISOLAT DARI TANAH SAWAH

DAN GAMBUT

Judul skripsi : Identifikasi Bakteri Pengoksidasi Metana dan Gen Fungsional

Isolat dari Tanah Sawah dan Gambut

Nama : Rizka Oktarianti Ainun Jariah

NIM : G84100030

Disetujui oleh

Dr Syamsul Falah, SHut Msi Prof Dr I Made Sudiana MSc

Pembimbing II Pembimbing II

Diketahui

Dr I Made Artika, MappSc

Ketua Departemen

Tanggal lulus :

PRAKATA

Bismillahirrahmaanirrahiim

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala

karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Judul penelitian yang

dilaksanakan sejak bulan Desember 2013 ini adalah Identifikasi Bakteri Pengoksidasi

Metana dan Gen Fungsional Isolat dari Tanah Sawah dan Gambut. Terima kasih

penulis ucapkan kepada Bapak Dr Syamsul Falah, SHut, MSi dan Bapak Prof Dr I

Made Sudiana, MSc selaku pembimbing yang telah banyak memberikan pengarahan

dan saran selama masa penelitian dan penulisan. Selain itu, penghargaan penulis

sampaikan kepada Mbak Senlie, Mbak Tutus, Mbak Anis beserta seluruh staf

Laboratorium Mikrobiologi LIPI yang telah banyak membantu dan membimbing

selama masa penelitian. Secara khusus ucapan terima kasih penulisan sampaikan untuk

Ayah Agus Salim dan Ibu Saptini Darmaningrum atas doa dan dorongan semangat

untuk penulis. Penulis juga menyampaikan ucapan terima kasih kepada Kakak Amylila

MP, Adik Fitratillahilhanif, Afina, Jarvis, Biokimia 47 dan teman-teman BEM KM IPB

2013 untuk segala doa, kasih sayang, dan dukungannya sehingga tulisan ini dapat

diselesaikan.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat bagi ilmu pengetahuan khususnya

dalam pengembangan ilmu Biokimia.

Bogor, Juli 2014

Rizka Oktarianti Ainun Jariah

DAFTAR ISI

DAFTAR GAMBAR vi

DAFTAR LAMPIRAN vi

PENDAHULUAN 1 METODE 2 Bahan dan Alat 2 Metode Penelitian 3

Isolasi Bakteri Metanotrof 3 Pengukuran Aktivitas Oksidasi Bakteri 3 Pewarnaan Gram Bakteri 3 Isolasi DNA Menggunakan Nippon Gene Kit 3 Elektroforesis Gel Agarose 4

Amplifikasi DNA Primer 16S Ribosomal RNA 4 Amplifikasi DNA gen pmoA 5 Amplifikasi DNA gen mxaF 5 Perunutan DNA dan Analisis Bioinformatika 5

HASIL DAN PEMBAHASAN 6 Hasil 6

Isolasi Bakteri Metanotrof 6 Aktivitas Oksidasi Bakteri Metanotrof 7 Pewarnaan Gram Bakteri 8 Amplikon Gen 16S Ribosomal RNA 9 Amplikon Gen pmoA primer 189f-682R 9 Amplikon Gen pmoA primer 189f-650r 10 Amplikon Gen mxaF 11 Identifikasi Bakteri dan Analisis Bioinformatika 11

Pembahasan 14 Isolasi Bakteri pada Media NMS 14 Aktivitas Oksidasi Bakteri Metanotrof 14

Pewarnaan Gram Bakteri Metanotrof 16 Amplikon Gen 16S rRNA 16 Amplifikon Gen pmoA 17 Amplikon Gen mxaF 18 Identifikasi Bakteri dan Analisis Bioinformatika 18

SIMPULAN DAN SARAN 19 DAFTAR PUSTAKA 20 LAMPIRAN 23

DAFTAR GAMBAR

1 Pertumbuhan bakteri pada media NMS padat 6

2 Uji aktivitas oksidasi bakteri metanotrof isolat murni 7

3 Penampakan mikroskopis isolat metanotrof perbesaran 400x 8

4 Elektroforegram amplikon gen 16S rRNA 9

5 Elektroforegram amplikon gen pmoA primer 189f - 682r 10

6 Elektroforegram amplikon gen pmoA primer 189f - 650r 10

7 Elektroforegram amplikon gen mxaF 11

8 Pohon filogeni sekuen 16S RNA ribosomal 13

9 Jalur metabolisme metanotrof 15

10 Jalur metabolisme formaldehid 15

DAFTAR LAMPIRAN

1 Alur Penelitian 22

2 Isolat-isolat bakteri metanotrof yang digunakan 23

3 Hasil pengukuran aktivitas oksidasi metana 23

4 Konsentrasi DNA isolat 24

5 Sekuens primer yang digunakan 25

6 Hasil perunutan DNA 26

7 Tabel singkat hasil penelitian 29

PENDAHULUAN

Gas metana (CH4) merupakan salah satu gas yang menyebabkan pemanasan

global. Menurut Intergovernmental Panel on Climate Change, gas metana

menempati urutan kedua setelah karbon dioksida yang mempengaruhi pemanasan

global. Gas CH4 dapat menyerap radiasi inframerah 25 kali lebih efektif jika

dibandingkan dengan CO2. Emisi energi radiasi yang diserap tersebut

menyebabkan pemanasan global. Sebagian besar emisi metan ke atmosfer berasal

dari lahan sawah (IPCC 2007).

Emisi gas metan dari tanah sawah ataupun tanah basah adalah hasil dari

reaksi antagonis antara bakteri metanogen dan metanotrof. Suasana anaerob pada

bagian bawah sedimen sawah merupakan habitat yang sesuai untuk bakteri

penghasil metan (metanogen). Bakteri metanogen menggunakan CO2, metil, dan

asetat sebagai sumber karbon yang kemudian diubah menjadi metan melalui

proses metanogenesis (Dubey 2005). Madigan et al. (2009) menyatakan bahwa

emisi gas metana dari tanah sawah melibatkan berbagai proses, yaitu hidrolisis

senyawa polisakarida menjadi gula sederhana dan biokonversi monosakarida

menjadi senyawa organik terutama asam asetat dan karbondioksida pada kondisi

anaerobik. Kedua senyawa terakhir akan ditransformasikan menjadi gas metana.

Sebaliknya, pada permukaan sedimen terdapat oksigen terlarut sehingga sesuai

untuk pertumbuhan bakteri metanotrof (Mer & Roger 2001). Bakteri metanotrof

merupakan bakteri gram negatif yang menggunakan metan sebagai sumber

karbonnya serta dapat hidup pada kondisi aerob ataupun anaerob. Bakteri ini

dapat ditemukan secara alami pada tanah sawah, tanah padang rumput, sedimen,

lautan, sungai, aliran sungai, dan limbah lumpur (Willey 2011).

Enzim yang memegang peranan penting dalam jalur metabolisme bakteri

metanotrof adalah enzim metan monooksigenase (MMO) yang mempercepat

reaksi oksidasi metan menjadi metanol. Dua jenis enzim MMO adalah pMMO

(particulate MMO) dan sMMO (soluble MMO), namun enzim pMMO yang

mendominasi proses metabolisme bakteri metanotrof Berdasarkan jalur

metabolismenya, bakteri metanotorof terbagi menjadi tipe I, tipe II, dan tipe X.

Tipe I meliputi sub klas Gammaproteobacteria dan tipe II meliputi subklas

Alphaproteobacteria. Bakteri pengguna gas metana yang termasuk tipe I

menggunakan ribulosa monofosfat (RuMP) sebagai jalur metabolisme utama

dalam asimilasi formaldehid. Beberapa bakteri pengguna metan yang termasuk di

dalamnya adalah genus Methylococcus, Methylomicrobium, Methylobacter, dan

Methylomonas. Bakteri metanotrofik yang termasuk tipe II menggunakan jalur

metabolisme serin dalam asimilasi formaldehid. Beberapa bakteri pengguna metan

yang termasuk di dalamnya adalah genus Methylocystis dan Methylosinus (Knief

et al. 2003). Menurut Chistoserdova et al. (2005), bakteri metanotrofik yang

termasuk tipe X dapat menggunakan jalur metabolisme RuMP ataupun jalur

metabolisme serin untuk asimilasi formaldehid. Bakteri yang termasuk ke dalam

tipe X adalah strain anggota genus bakteri Methylococcus. Selain ketiga tipe

tersebut, Lucas et al. (2009) menyatakan bahwa terdapat bakteri genus Ralstonia

yang mempunyai enzim metan monooksigenase yang berperan penting dalam

oksidasi gas metana menjadi metanol.

2

Penelitian mengenai bakteri metanotrof terus dilakukan untuk mengetahui

keragaman bakteri metanotrof yang ada di alam dan mengembangkan potensi

bakteri metanotrof sebagai bakteri yang memiliki kemampuan untuk

mengoksidasi metan. Penelitian ini menggunakan tujuh sampel konsorsium yang

berasal dari tanah sawah dan gambut. Sebelumnya telah dilakukan penapisan

terhadap 25 sampel yang ada di laboratorium Mikrobiologi LIPI melalui uji

aktivitas gas metan dan diambil tujuh sampel yang absorpsi gas metannya paling

baik.

Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi bakteri metanotrof dari

konsorsium yang di ambil dari tanah di beberapa daerah di Indonesia,

mengidentifikasi gen fungsional serta mengukur kemampuan oksidasi dari bakteri

tersebut. Penelitian ini juga bermanfaat untuk mengetahui strain bakteri

metanotrof, sehingga kajian karakteristiknya dapat diaplikasikan dalam

pengembangan solusi alternatif penuruan gas metana. Penelitian dilaksanakan

mulai bulan Desember 2013 hingga bulan April 2014 di Lembaga Ilmu

Pengetahuan Indonesia (LIPI), Pusat Penelitian Biologi bidang Mikrobiologi,

Cibinong-Jawa Barat.

METODE

Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan adalah isolat bakteri metanotrof berasal dari Tanah

Sawah dan Tanah Gambut yang telah tersedia di Laboratorium Fisiologi

Mikrobiologi LIPI, Cibinong. Sampel diberi kode AM1 (komposit dari tanah

sawah di daerah Bogor, AM2 (tanah sawah Kampung Muara, Bogor), AM3 (tanah

gambut Kalampangan, Kalimantan Tengah), AM4 (tanah gambut Kalampangan,

Kalimantan Tengah), AM5 (tanah gambut Kalampangan, Kalimantan Tengah),

AM6 (tanah sawah Teluk Naga, Tangerang), dan AM7 (tanah gambut

Kalampangan, Kalimantan Tengah). Media selektif yang digunakan ialah nitrate

mineral salts (NMS) dengan komposisi media : MgSO4.7H2O 0,13 g, NaNO3 1,3

g, Na2HPO4.12H2O 0,65 g, KH2PO4 0,286 g, CaCl2.6H2O 0,039 g, FeSO4.H2O 2,6

mg, trace element solution (bentuk larutan) 1,3 mL. Nippon gene DNA

extraction kit, buffer TE atau ddH2 O, agarosa Takara, noble agar, TAE 1X, EtBr,

loading buffer, nuclease free water, DMSO, primer forward, primer reverse,

Taq polymerase, dan gas metana murni. Alat yang digunakan adalah botol dengan

tutup karet kedap udara, mesin GC-MS, laminar air flow cabinet syringe,

autoklaf, mikropipet, tip, eppendorf, sentrifus Hitachi CR-21F, sel elektroforesis

Biorad Mini Protean, mesin PCR takara, mesin PCR aztec, nanodrop, lampu UV

dan peralatan gelas

3

Metode Penelitian

Isolasi Bakteri Metanotrof (Asakawa et al. 2012)

Isolasi bakteri metanotrof dilakukan dengan metode pengayaan

menggunakan media NMS (Hanson 1998). Sebanyak 0,2 mL kultur yang belum

murni dimasukkan ke dalam 10 mL media NMS ke dalam botol serum 75 mL

yang ditutup sumbat karet dan penutup alminium lalu di press kemudian diisi

dengan gas metan dengan konsentrasi 20% (v/v). Sampel diinkubasi pada suhu 30

˚C dengan mesin pengocok selama 3-4 minggu. Proses sub kultur diulang hingga

tiga kali.

Isolasi ke medium NMS agar dari masing-masing kultur cair umur 21 hari

dengan metode streak plate. Semua petri dimasukkan ke dalam anaerobic jar

dengan penambahan gas metan sampai tekanan dalam anaerobic jar 5 bar setiap

harinya. Pertumbuhan koloni bakteri pada NMS agar dapat diamati setelah 21 hari.

Koloni bakteri yang tumbuh diinokulasikan kembali pada medium NMS. Selama

inkubasi, kultur di injeksi gas metana 20 cc. Seleksi bakteri metanotrofik

dilakukan berdasarkan kemampuan tumbuh pada medium NMS cair (tingkat

kekeruhan medium).

Pengukuran Aktivitas Oksidasi Bakteri (Octaviana 2010)

Aktivitas oksidasi diukur pada minggu-1, minggu-2, dan minggu-3 masa

inkubasi. Laju oksidasi gas metana diukur dengan metode kromatografi gas,

dengan jenis detektor Flame Ion Detector (FID), suhu detektor 170 °C, suhu

injektor 170 °C dan suhu kolom 170 °C. Udara (100 mg/L) dalam tabung

anaerobik diambil sebanyak 50 μL, menggunakan syringe khusus dan diinjeksikan

ke alat kromatografi gas. Hasil kromatografi gas yang muncul (khusus metana)

setelah kurang lebih 3 menit operasional, waktu retensi metana adalah sekitar 0,3-

0,4 detik. Luas puncak kromatogram sampel yang terbentuk saat waktu retensi

dibandingkan dengan luas puncak kromatogram standar gas metan murni sehingga

didapatkan konsentrasi gas dalam satuan persen (%).

Pewarnaan Gram Bakteri (Lay 1994)

Isolat bakteri metanotrof digoreskan tipis pada kaca objek, diratakan dengan

air destilata dan difiksasi di atas api. Preparat ditetesi pewarna kristal violet 30

detik, dibilas dengan air (bakteri berwarna biru), ditetesi larutan lugol 30 detik,

dibilas dengan air, ditetesi larutan pemucat (alkohol 70%) 10 - 20 detik, dibilas

dengan air, ditetesi pewarna safranin 15 detik, dibilas dengan air, dan dikeringkan

dengan kertas saring. Pengamatan dilakukan di bawah mikroskop dengan

perbesaran hingga 400x. Penampakan sel berwarna ungu menunjukkan bakteri

merupakan Gram positif dan penampakan sel berwarna merah menunjukkan

bakteri merupakan Gram negatif.

Isolasi DNA Menggunakan Nippon Gene Kit (Meis & Chen 2003)

Sebanyak 0,5 mL sampel air tanah dimasukkan kedalam beads tube

kemudian ditambahkan 950 µL lysis solution BB dan lysis solution 20s kemudian

sampel dimasukkan kedalam beads beating pada 5500 rpm selama 45 detik.

Setelah itu, sampel di sentrifus pada 12000 g selama 1 menit pada temperatur

4

ruangan. Supernatan diambil dan dipindahkan 600 µL ke tube eppendorf yang

baru kemudian ditambahkan 400 µL purification solution dan dicampur,

ditambahkan 600 µL kloroform dan dikocok menggunakan vortex selama 15

menit setelah itu di sentrifus pada kecepatan 12000 g selama 15 menit. Lapisan air

sebanyak 800 µL dipindahkan ke eppendorf baru, langkah ini harus dilakukan

dengan hati-hati agar lapisan tengah larutan tidak terbawa. Sampel kemudian

ditambahkan 800 µL precipitation solution kemudian dicampur dan di sentrifus

pada kecepatan 17700 g selama 15 menit pada suhu 4 ˚C. Supernatan dibuang dan

pelet ditambah 1 mL wash solution dikocok beberapa kali kemudian di sentrifus

dengan kecepatan 17700 g selama 10 menit pada suhu 4 ˚C. Buang supernatan

dan pelet ditambah 1 mL etanol 70% dan dikocok beberapa kali, supernatan

dibuang, pelet dikeringkan dan dilarutkan dalam buffer TE (pH 8,0) 100 µL.

Pengukuran konsentrasi DNA dilakuakn menggunakan mesin Nanodrop ND 1000

thermo.

Elektroforesis Gel Agarose (Octaviana 2010)

Pembuatan Gel Agarosa 1,5%. Sebanyak 0,45 gram agarosa Takara

ditambah dengan 30 mL TAE 1X, lalu dipanaskan hingga larut. Setelah larut

dengan sempurna, larutan tersebut dituang ke dalam cetakan yang dilengkapi

dengan sisir. Campuran tersebut didiamkan selama kira-kira 30 menit sampai gel

tersebut benar-benar beku. Gel tersebut kemudian dimasukkan dalam alat

elektroforesis dan direndam dengan bufer TAE 1X.

Elektroforesis Gel Agarosa. Sebanyak 1 sampai 2 μL sampel DNA

dicampurkan dengan 1 μL loading buffer di atas parafilm dengan menggunakan

mikropipet kemudian dimasukkan ke dalam sumur elektroforesis. Setelah

elektroforesis selesai, gel dikeluarkan dari alat elektroforesis kemudian direndam

di dalam larutan EtBr selama 30 menit. Setelah direndam, gel dilihat dengan

bantuan alat Gel Doc. Profil DNA yang terlihat kemudian disimpan dalam

perangkat dokumentasi gel (gel-documentation). Perangkat dokumentasi gel

adalah alat yang terdiri atas kotak berbahan metal tempat penyinaran sinar UV

yang dihubungkan dengan kamera digital. Kamera digital tersebut terpasang pada

komputer atau laptop yang sudah terdapat software yang dapat menyimpan

fotografi dari hasil elektroforeis. Dokumentasi gel berfungsi untuk mengambil

foto gel hasil elektroforesis kemudian menyimpannya dalam bentuk data fotografi

yang dapat dicetak. Pita yang terlihat dibandingkan dengan marker untuk

menentukan ukuran basa DNA.

Amplifikasi DNA Primer 16S Ribosomal RNA (Henckel et al. 2000)

Sebanyak 1 sampai 3 μL DNA yang telah diisolasi dilarutkan dalam

campuran Taq polymerase sebanyak 12,5 μL, 9 μL nuclease free water, dan 0,5

μL DMSO kemudian ditambahkan masing-masing 0,5 μL primer 9F dan primer

1541 R. Campuran kemudian dimasukkan ke dalam mesin PCR Takara diawali

dengan dengan pradenaturasi pada suhu 95 oC selama 1 menit. Kemudian

dilanjutkan dengan denaturasi pada suhu 95 oC selama 30 detik, penempelan

primer pada 50 oC selama 30 detik, dan suhu pemanjangan 72 oC selama 1 menit

30 detik. Program ini dilakukan sebanyak 30 siklus. Proses PCR diakhiri dengan

pemanjangan akhir pada suhu 72 oC selama 5 menit. Hasil amplifikasi diverifikasi

dengan elektroforesis gel agarosa 1,5% dengan tegangan 90 volt selama ± 30

5

menit. Pita DNA yang terbentuk dibandingkan dengan marker untuk menentukan

ukuran basanya. Ukuran DNA target yang diharapkan adalah 1500 bp.

Amplifikasi DNA gen pmoA (Asakawa et al. 2012 ; Bourne 2001)

Proses amplifikasi gen pmoA menggunakan dua macam primer yaitu 189f –

682R dan 189f – 650R. Sebanyak 1 sampai 3 μL DNA yang telah di isolasi

dilarutkan dalam campuran Taq polymerase sebanyak 12,5 μL, 9 μL nuclease free

water, dan 0,5 μL DMSO kemudian ditambahkan masing-masing 0,5 μL primer

forward dan primer reverse. Primer 189f – 682R menggunakan mesin Aztec

diawali dengan pradenaturasi pada suhu 96 oC selama 2 menit. Kemudian

dilanjutkan dengan denaturasi pada suhu 96 oC selama 30 detik, penempelan

primer pada 56 oC selama 1 menit, dan suhu pemanjangan 72 oC selama 2 menit.

Program ini dilakukan sebanyak 35 siklus. Ukuran DNA yang diharapkan dari

proses ini adalah 500 bp. Proses PCR diakhiri dengan pemanjangan akhir pada

suhu 72 oC selama 5 menit. Sementara itu, primer 189f – 650R, siklus diawali

dengan pradenaturasi pada suhu 96 oC selama 5 menit, dilanjutkan dengan

denaturasi pada suhu 96 oC selama 1 menit, penempelan primer pada 56 oC

selama 1 menit, dan suhu pemanjangan 72 oC selama 1 menit. Siklus diulang

sebanyak 45 kali dan diakhiri dengan pemanjangan akhir pada suhu 72 oC selama

5 menit. Ukuran DNA yang diharapkan dari proses ini adalah 500 bp Hasil

amplifikasi diverifikasi dengan elektroforesis gel agarosa 1,5% dengan tegangan

90 volt selama ± 30 menit. Pita DNA yang terbentuk dibandingkan dengan marker

untuk menentukan ukuran basanya.

Amplifikasi DNA gen mxaF (Henckel et al. 2000)

Sebanyak 1 sampai 3 μL DNA yang telah diisolasi dilarutkan dalam

campuran Taq polymerase sebanyak 12,5 μL, 9 μL nuclease free water, dan 0,5

μL DMSO kemudian ditambahkan masing-masing 0,5 μL primer 1001F

(5’GCGGCACCAACTGGGGCTGGTCGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCC

CGCCGCCCCCGCCCG-3’) dan primer 1557R (5’GGGCAGCATGAAG

GGCTCCC-3’) menggunakan mesin Aztec diawali dengan pradenaturasi pada

suhu 96 oC selama 5 menit. Kemudian dilanjutkan dengan denaturasi pada suhu

96 oC selama 30 detik, penempelan primer pada 55 oC selama 40 detik, dan suhu

pemanjangan 72 oC selama 50 detik. Program ini dilakukan sebanyak 38 siklus.

Proses PCR diakhiri dengan pemanjangan akhir pada suhu 72 oC selama 5 menit.

Hasil amplifikasi diverifikasi dengan elektroforesis gel agarosa 1% dengan

tegangan 90 volt selama ± 30 menit. Pita DNA yang terbentuk dibandingkan

dengan marker untuk menentukan ukuran basanya. Ukuran DNA yang diharapkan

adalah 550 bp.

Perunutan DNA dan Analisis Bioinformatika (Nei &Kumar 2000; Swofford

& Sullivan 2009)

Hasil amplifikasi 16S ribosomal RNA yang telah di verifikasi melalui

proses elektroforesis kemudian di proses untuk perunutan nukleotida. Perunutan

nukleotida pada DNA hasil amplifikasi dilakukan dengan menggunakan jasa

perusahan analisis molekular yang berada di Korea. Setelah didapatkan hasil

sekuensing dari primer reverse dan forward, dilakukan proses contig

menggunakan software BioEdit untuk menggabungkan sekuens reverse dan

6

forward. Hasil penggabungan sekuens lalu dibandingkan dengan data sekuen

yang terdapat pada GenBank menggunakan program BLAST-N (Basic Local

Alignment Search Tool-Nucleotida) dari situs NCBI (National Center for

Biotechnology Information) untuk mengetahui tingkat kemiripan dengan database.

Analisis selanjutnya adalah pembuatan pohon filogeni Pembuatan pohon filogeni

dimulai dengan mencari data fasta gen 16S rRNA seluruh tipe isolat bakteri

metanotrofik di gene bank http://www.ncbi.nlm.nih.gov, selanjutnya seluruh hasil

fasta tersebut di gabung dengan data sekuen hasil sekuensing gen 16S rRNA isolat

uji dan dilakukan alignment dengan program MEGA 5. Selanjutnya, di cari model

rekonstruksi pohon filogeni dibuat dengan memakai algoritma Neighbor-Joining

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil

Isolasi Bakteri Metanotrof

Tujuh isolat yang telah diseleksi kemudian dimurnikan sebanyak tiga kali di

media NMS cair. Kemurnian isolat diindikasikan dengan kemampuan absorbsi

maksimal 15 mL gas metan selama 3 minggu. Isolat murni didapatkan setelah

pengulangan proses pemurnian di NMS cair sebanyak tiga kali.

Kultur murni dari media NMS cair ditumbuhkan pada media NMS padat

kemudian diletakkan di dalam anaerobic jar dan diisi gas metan murni (Gambar

1). Bakteri metanotrof termasuk ke dalam kriteria slow growing bacteria karena

membutuhkan waktu yang cukup lama untuk tumbuh, yaitu sekitar 3 minggu

inkubasi. Kadar gas metan murni di dalam anaerobic jar habis pada minggu

ketiga.

Gambar 1 Pertumbuhan bakteri pada media NMS padat. (a) koloni AM1 berwarna

merah, masa sel banyak (b) koloni AM2 berwarna putih, masa sel

banyak (c) koloni AM3 berwarna putih, masa sel sangat sedikit (d)

koloni AM4 berwarna putih, masa sel sangat sedikit (e) koloni AM5

berwarna putih, masa sel sangat sedikit (f) koloni AM6 berwarna

putih, masa sel banyak (g) koloni AM7 berwarna putih, masa sel

sangat sedikit.

a

c

b

d

e

g f

a

AM2 AM3 AM4

AM5 AM6 AM7

AM1

7

Setelah 3 minggu, bakteri metanotrof pada masing-masing sampel dapat tumbuh

namun dengan masa bakteri dan karakteristik koloni yang berbeda-beda. Sampel

AM1 memiliki masa koloni yang sangat banyak dan koloni berwarna kemerahan.

Sampel AM2 tumbuh dengan masa koloni yang cukup banyak dan memiliki

warna koloni putih Sampel AM6 memiliki masa koloni yang banyak, berwarna

putih, berbentuk bulat kecil yang terpisah-pisah. Sementara itu, sampel AM3,

AM4, AM5, dan AM7 juga tumbuh pada media padat namun dengan masa yang

sangat sedikit, koloni yang terbentuk berwarna putih, terpisah-pisah dan berbentuk

bulat.

Aktivitas Oksidasi Bakteri Metanotrof

Sampel AM1, AM2, AM3, AM4, AM5, AM6, dan AM7 dimurnikan ke

media NMS dan ditambahkan gas metan murni sebanyak 20% v/v atau sekitar 15

mL dari volume botol. Proses pemurinan isolat dilakukan sebanyak tiga kali.

Konfirmasi kemurnian isolat dilakukan melalui pengamatan kultur dan

pengukuran gas metan secara rutin setiap minggu. Pertumbuhan bakteri

metanotrof dapat dilihat dari kekeruhan media. Kadar gas metana pada sampel

diukur setiap minggu menggunakan mesin kromatografi gas FID untuk

mengetahui aktivitas oksidasi bakteri metanotrof. Waktu retensi untuk mendeteksi

gas metan adalah 0,3 hingga 0,4 detik. Berdasarkan hasil penelitian, semua sampel

menunjukkan penurunan gas metan setiap minggu dan kadar gas metan mendekati

nol pada minggu ketiga inkubasi. Isolat yang paling cepat menggunakan gas

metan adalah AM4, AM6, dan AM7 (Gambar 2). Berdasarkan hasil perhitungan,

kadar gas metan rata-rata setiap isolat dapat menggunakan gas metan 0,7 mL

dalam sehari dan konsumsi gas metan sebanyak 15 mL habis dalam waktu 3

minggu. Peningkatan konsumsi gas metan yang meningkat setiap minggu juga

mengindikasikan pertumbuhan bakteri metanotrof yang meningkat setiap

minggunya.

Gambar 2 Uji aktivitas oksidasi bakteri metanotrof isolat murni. Kontrol

AM1 (komposit sawah) , AM2 (tanah sawah) , AM3 (tanah

gambut) , AM4 (tanah gambut) , AM5 (tanah gambut) ,

AM6 (tanah sawah) , AM7 (tanah gambut) .

0

5

10

15

20

25

0 5 10 15 20 25

Kad

ar G

as M

eta

n (

%)

Hari ke-

8

Pewarnaan Gram Bakteri

Hasil pewarnaan gram bakteri yang diamati menggunakan mikroskop

menunjukkan sampel memiliki sel berwarna merah mengindikasikan isolat

merupakan bakteri Gram negatif (Gambar 3). Isolat bakteri AM1, AM2, AM3,

AM6, dan AM7 memiliki bentuk sel batang, sedangkan untuk isolat AM 4 dan

AM5 memiliki bentuk kokus. Hasil pengamatan dapat dilihat pada gambar 3.

Gambar 3 Penampakan mikroskopis perbesaran 400x isolat metanotrof

(Keterangan: AM1= sel batang, Gram negatif, AM2= sel batang,

Gram negatif, AM 3= sel batang, Gram negatif, AM4= sel kokus,

Gram negatif, AM5= sel kokus, Gram negatif, AM6= sel batang,

Gram negatif, AM7= sel batang, Gram negatif).

AM1 AM2

AM3 AM4

AM5 AM6

AM7

9

Amplikon Gen 16S Ribosomal RNA

Setelah pengukuran aktivitas oksidasi dan kultur media padat, dilakukan

isolasi DNA semua isolat. Sampel DNA yang didapatkan diukur konsentrasinya

menggunakan mesin Nanodrop. Hasil pengukuran (Lampiran 4) menunjukkan

konsentrasi DNA tidak terlalu tinggi dengan kisaran antara 12 ng/µL - 21 ng/µL.

Hasil isolasi DNA digunakan untuk tahap selanjutnya yaitu amplifikasi gen.

Amplifikasi gen 16S rRNA dilakukan menggunakan primer 9F dan primer 1541 R

dengan tujuan identifikasi bakteri secara umum kemudian dilakukan sekuensing.

Ukuran DNA target adalah 1500 bp. Hasil amplifikasi gen 16S rRNA yang

dikonfirmasi dengan elektroforesis menunjukkan DNA memiliki ukuran sekitar

1500 bp (Gambar 4).

Gambar 4 Elektroforegram amplikon gen 16S rRNA berukuran ~1500 bp

(Keterangan: Marker: 100 bp, 1= AM1 (komposit tanah sawah), 2=

AM2 (tanah sawah), 3= AM3 (tanah gambut), 4= AM4 (tanah

gambut), 5= AM5 (tanah gambut), 6= AM6 (tanah sawah), 7= AM7

(tanah gambut))

Amplikon Gen pmoA primer 189f-682R

Amplifikasi gen pmoA pada sampel bakteri metanotrof dilakukan untuk

mengidentifikasi gen fungsional pmoA, yang berperan dalam metabolisme gas

metan. Ukuran DNA yang diharapkan adalah ~500 bp. Amplifikasi gen pmoA

dengan primer spesifik 189f - 682R menunjukkan hasil positif hanya pada sampel

AM4 (500 bp), AM5 (1500 bp dan 500 bp), dan AM6 (500 bp dengan pita DNA

yang tidak spesifik). Beberapa sampel teramplifikasi tidak pada ukuran yang

ditargetkan, sampel AM1 (~1500 bp), AM2 (~1500 bp), AM3 ( ~1500 bp, ~800

bp), sedangkan sampel AM7 tidak teramplifikasi (Gambar 5). Hasil amplikon

menunjukkan penurunan gas metan oleh sampel AM4, AM5, dan AM6

disebabkan adanya peran gen pmoA di dalam proses metabolismenya.

Marker (-) 1 2 3 4 5 6 7

1500 bp

10

Gambar 5 Elektroforegram amplikon gen pmoA primer 189f - 682r

(Keterangan: Marker: 100 bp, 1= AM1 (komposit tanah sawah), 2=

AM2 (tanah sawah), 3= AM3 (tanah gambut), 4= AM4 (tanah

gambut), 5= AM5 (tanah gambut), 6= AM6 (tanah sawah), 7= AM7

(tanah gambut))

Amplikon Gen pmoA primer 189f-650r

Amplifikasi gen pmoA pada sampel bakteri metanotrof dilakukan untuk

mengidentifikasi gen pmoA, yang berperan dalam metabolisme gas metan.

Ukuran DNA yang diharapkan adalah ~500 bp. Hasil amplifikasi gen pmoA

menggunakan primer 189f - 650r memberikan hasil positif pada sampel AM1,

AM2, AM5, AM6. Sampel AM7 teramplifikasi namun tidak sesuai dengan

ukuran yang ditargetkan (~400 bp). Pita DNA yang dihasilkan lebih baik daripada

primer 189f - 682r dengan ukuran yang lebih spesifik, namun tidak dapat

mendeteksi gen pmoA pada sampel AM3, dan AM4 seperti yang ditunjukkan

pada Gambar 6.

Gambar 6 Elektroforegram amplikon gen pmoA primer 189f - 650r (Keterangan:

Marker: 100 bp, , 1= AM1 (komposit tanah sawah), 2= AM2 (tanah

sawah), 3= AM3 (tanah gambut), 4= AM4 (tanah gambut), 5= AM5

(tanah gambut), 6= AM6 (tanah sawah), 7= AM7 (tanah gambut))

Marker (-) 1 2 3 4 5 6 7

Marker 1 2 3 4 5 6 7

1500 bp

500 bp

100 bp

500 bp

11

Amplikon Gen mxaF

Gambar 7 Elektroforegram amplikon gen mxaF (Keterangan: Marker: 100 bp,

1= AM1 (komposit tanah sawah), 2= AM2 (tanah sawah), 3= AM3

(tanah gambut), 4= AM4 (tanah gambut), 5= AM5 (tanah gambut), 6=

AM6 (tanah sawah), 7= AM7 (tanah gambut))

Tahap selanjutnya adalah identifikasi gen fungsional mxaF menggunakan

primer spesifik 1001f - 1557r. Ukuran yang diharapkan dengan menggunakan

primer ini adalah 550 bp. Gen mxaF mengkode protein pembentuk enzim metanol

dehidrogenase (MDH) dapat terdeteksi di semua sampel dengan ukuran ~500 bp -

~600 bp dan pada beberapa sampel terbentuk lebih dari satu pita. Sampel AM1

menghasilkan DNA dengan ukuran ~500 bp, AM2 berukuran ~600 bp, AM3

berukuran ~500 bp, AM4 membentuk pita DNA lebih dari satu pada ukuran ~500

bp, ~1000 bp, ~1500 bp, AM5 juga membentuk pita DNA lebih dari satu ukuran

~600 bp, ~900 bp, ~1500 bp, AM6 menghasilkan pita pada ukuran ~500 bp, dan

sampel AM7 pada ukuran 500 bp dan ~900 bp (Gambar 7). Hasil PCR yang

menunjukkan DNA masih belum murni atau masih adanya pengotor sehingga

ukuran pita DNA yang terbentuk belum spesifik.

Identifikasi Bakteri dan Analisis Bioinformatika

Hasil amplifikasi 16S rRNA kemudian diproses dalam taham perunutan

basa DNA. Hasil perunutan DNA dari primer reverse dan forward kemudian

digabung menggunakan program BioEdit. Tahap selanjutnya adalah identifikasi

spesies bakteri yang terdekat dengan ketujuh sampel bakteri data pada GeneBank

menggunakan program blast-N dari situs NCBI (National Center for

Biotechnology Information). Setelah didapatkan bakteri yang homolog, dicari

beberapa spesies bakteri terdekat melalui situs Ribosomal Database Project

(RDP). Setelah data didapatkan, pohon filogenetik dibuat menggunakan program

Mega 5.0 untuk dilihat kedekatannya dengan sampel yang dianalisis dan

kemungkinan ditemukannya spesies baru.

Berdasarkan hasil blast seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1, didapatkan

bahwa enam isolat (AM1, AM2, AM3, AM4, AM6, dan AM7) homolog dengan

spesies Methylocystis sp sedangkan AM5 homolog dengan spesies Mesorhizobium.

Marker (-) 1 2 3 4 5 6 7

7

500 bp

12

Nilai % identitas berkisar antara 77% hingga 94%, menunjukkan isolat sudah

cukup homolog dengan database yang ada. Analisis selanjutnya adalah analisis

pohon filogenetik untuk mengetahui kekerabatan dengan beberapa bakteri dengan

genus Methylocystis dan Mesorhizobium (Gambar 8). Isolat AM1, AM3, AM4,

AM5, AM6, dan AM7 berada pada satu kelompok dan memiliki kekerabatan yang

dekat satu sama lain. Isolat AM6 memiliki kekerabatan yang dekat dengan

Methylobacter luteus, sedangkan isolat AM2 berbeda kelompok dengan keenam

isolat lainnya dan berada di kelompok Methylocystis. Skala 0.1 menunjukkan

jarak evolusi pada panjang cabang, sedangkan angka pada cabang menunjukkan

nilai bootstrap.

Tabel 1 Analisis sekuens DNA sampel bakteri metanotrof dengan menggunakan

program blast N

Isolat Sekuens bakteri yang

homolog

Spesies bakteri

terdekat % identitas No. Akses

AM1 Methylocystis sp.

partial 16S rRNA gene,

strain KS8a

Methylocystis sp. 77% AJ458493.1

AM2 Methylocystis sp. LW5

16S ribosomal RNA

gene, partial sequence

Methylocystis sp. 80% AF150790.1

AM3

Methylocystis sp. 5FB1

partial 16S rRNA gene,

strain 5FB1

Methylocystis sp. 93 % AJ868421.1

AM4 Methylocystis sp.

IMET 10484 partial

16S rRNA gene, strain

Methylocystis sp. 92% AJ458470.1

AM5

Mesorhizobium

amorphae strain JN37

ribosomal RNA gene

Mesorhizobium sp. 94% KF150349.1

AM6 Uncultured

Methylocystis sp. Slobe

Pad-11 16S ribosomal

RNA gene

Methylocystisis sp. 93% JX50528.1

AM7 Methylocistis sp. R-

49796 partial 16S

rRNA gene

Methylocystis sp. 93% HF558989.1

13

Gambar 8 Pohon filogeni sekuen 16S RNA ribosomal

14

Pembahasan

Isolasi Bakteri pada Media NMS

Isolasi bakteri metanotrof menggunakan metode pengayaan yang

sebelumnya telah dilakukan dalam penelitian Asakawa et al. (2012). Isolat dari

tanah sawah dan tanah gambut diseleksi dengan metode sub-kultur sebanyak tiga

kali. Parameter kemurnian isolat adalah kekeruhan yang homogen dan absorbsi

gas metan yang tinggi dan stabil. Isolat air yang telah murni akan digunakan untuk

isolasi pada media NMS padat dan isolasi DNA bakteri. Menurut Rodriquez dan

Fraga (2000), medium yang biasa digunakan untuk menumbuhkan bakteri

metanotrofik pada umumnya adalah medium mineral garam nitrat (NMS).

Medium NMS tidak mengandung sumber karbon dan selain gas metan yang

diinjeksikan selama inkubasi. Bakteri metanotrof menggunakan metana sebagai

substrat utama untuk metabolismenya.

Sampel diinokulasikan di medium NMS padat dan diinkubasi dalam

anaerobic jar yang diisi dengan gas metana murni. Setelah masa inkubasi selama

3 minggu, gas metana di dalam anaerobic jar berkurang. Berdasarkan hasil

penelitian, semua sampel memiliki kemampuan tumbuh di media NMS padat

namun dengan kecepatan tumbuh yang berbeda-beda. Pertumbuhan di media

padat membutuhkan waktu yang lebih lama dibandingkan dengan di media cair

karena penyerapan gas metan pada media cair lebih efektif dibanding penyerapan

gas metan pada media padat di dalam anaerobic jar. Hasil inokulasi di media

padat menunjukkan bahwa isolat bakteri metanotrof cukup murni karena koloni

yang terbentuk pada setiap cawan cenderung seragam dan tidak terpisah-pisah.

Aktivitas Oksidasi Bakteri Metanotrof

Karakterisik utama metabolisme bakteri metanotrofik adalah mampu

mengoksidasi metana menjadi karbondioksida dan melepaskannya ke atmosfer.

Bakteri metanotrofik mengoksidasi metana, sebagai satu-satunya sumber karbon

dan energi untuk pertumbuhan yang tergantung pada kondisi lingkungan. Proses

oksidasi metana oleh bakteri metanotrof dapat berlangsung secara aerobik maupun

anaerobik (Christoserdova et al. 2005). Metabolisme metanotrof secara umum

ditunjukkan oleh Gambar 9. Metan dioksidasi oleh bakteri metanotrof menjadi

metanol dengan bantuan enzim metan monooksigenase (MMO). Hanson dan

Hanson (1996) menyatakan bahwa enzim MMO terdiri dari metan

monooksigenase partikel (pMMO) dan metan monooksigenase terlarut (sMMO).

Enzim pMMO terdapat dalam membran intrasitoplasmik, sedangkan sMMO

terdapat dalam sitoplasma. Enzim pMMO memiliki spesifikasi substrat yang lebih

kecil jika dibandingkan dengan sMMO dan enzim oksigenase lainnya. Enzim

monooksigenase mampu mereduksi ikatan O=O menjadi dioksigen. Satu atom

oksigen tereduksi menjadi H2O dan yang lain berikatan dengan metana

membentuk methanol (Lipscomb 1994).

Proses selanjutnya adalah konversi metanol menjadi formaldehid, yang

merupakan senyawa antara utama sebelum memasuki jalur metabolisme

berikutnya. Enzim yang berperan dalam proses ini adalah metanol dehidrogenase

(MDH) (Knief et al. 2003). Proses konversi oleh MDH merupakan proses kunci

15

Gambar 9 Jalur metabolisme metanotrof (Hanson & Hanson 1996)

dalam metabolisme bakteri pengguna karbon tunggal (C1) seperti metilotrof.

Formaldehid dapat memasuki dua jalur metabolisme yaitu jalur metabolisme

ribulosa monofosfat (RuMP) atau jalur serin seperti yang ditunjukkan pada

Gambar 10. Hasil asimilasi formaldehid berupa CO2 dan sintesis senyawa

multikarbon (Madigan et al. 2009).

Jalur RuMP digunakan oleh bakteri metanotrof tipe I. Oksidasi

formaldehida melalui jalur ini tidak membutuhkan kekuatan reduksi sehingga

seluruh sumber karbonnya digunakan sebagai bahan untuk membuat materi sel.

Dua enzim unik pada jalur ini adalah heksulose-6-fosfat sintase dan heksulose

fosfat isomerase (Hanson & Hanson 1996). Jalur RuMP membutuhkan satu

molekul ATP untuk setiap pembentukan satu molekul gliseraldehida-3-fosfat.

Bakteri metanotrof tipe I memiliki jumLah sel yang lebih banyak dibandingkan

dengan metanotrof tipe II karena perbedaan penggunaan energi (Madigan et al.

2006). Sedangkan menurut Hanson & Hanson (1996), jalur serin membutuhkan

dua molekul NADH dan ATP sebagai sumber energi untuk pembentukan satu

molekul asetil koA dan satu molekul CO2. Asetil koA kemudian digunakan untuk

membentuk materi sel yang baru. Enzim spesifik yang teridentifikasi pada jalur

serin adalah serin hidroksimetil transferase (STHM), hidroksipiruvat reduktase

(HPR), dan malil koenzim A liase (MCI).

Gambar 10 Jalur metabolisme formaldehid; A) Jalur Serin dan B) Jalur RuMP

(Hanson & Hanson 1996)

A

B A

16

Sampel bakteri metanotrof diinokulasi di media NMS cair pada suhu 30 ˚C.

Media NMS tidak mengandung sumber karbon dan gas metana diinjeksikan

selama inkubasi, sehingga hanya bakteri yang menggunakan metana sebagai

substrat utama yang dapat tumbuh. Keberhasilan inokulasi bakteri metanotrofik

dapat diukur melalui tingkat pengurangan gas metana yang dilakukan oleh bakteri

tersebut (Vishwakarma et al. 2009). Pengukuran tingkat absorpsi gas metana

dilakukan setiap minggu melalui analisis kromatografi gas – FID. Pertumbuhan

bakteri metanotrof ditandai dengan kekeruhan media NMS dan penurunan kadar

gas metan setiap minggunya. Berdasarkan hasil pengukuran dengan kromatografi,

semua sampel memiliki kemampuan aktivitas oksidasi yang baik. Kadar gas

metan pada sampel terus menurun hingga minggu ke-3 (Lampiran 3). Gas metan

yang diinjeksikan pada awal inkubasi sebanyak 20% v/v habis pada akhir minggu

ke-3 inkubasi. Penurunan gas metan setiap minggu juga menunjukkan bahwa

jumLah bakteri metanotrof yang ada di dalam media bertambah ditandai juga

dengan kekeruhan media yang semakin meningkat. Sesuai dengan pernyataan

Octaviana (2010), metana sebagai sumber karbon pada bakteri metanotrof akan

digunakan membentuk biomassa bakteri melalui jalur ribulosa monofosfat

ataupun serin. Bakteri metanotrof termasuk ke dalam slow growing bacterias

karena membutuhkan waktu yang lama, selama 3 minggu, untuk tumbuh secara

optimal.

Pewarnaan Gram Bakteri Metanotrof

Semua isolat memiliki sifat Gram negatif ditunjukkan dengan hasil

pengamatan mikroskop dengan hasil pewarnaan sel berwarna merah. Hal ini

sesuai dengan sifat bakteri metanotrofik yang dipaparkan dalam buku karakter

bakteri metanotrofik Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Bowman cit.

Brenner et al. 2005). Komponen pewarnaan Gram adalah kristal violet, lugol,

alkohol dan safranin. Prinsip pewarnaan gram terletak pada perbedaan susunan

dinding sel bakteri. Bakteri Gram negatif mengandung lipid yang lebih banyak

pada dinding selnya. Kompleks yang terbentuk antara kristal violet dengan lugol

terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme Gram positif

sedangkan pada Gram negatif penucian dengan alkohol dapat menghilangkan zat

lipid pada dinding sel. Mekanisme ini membuat zat warna safranin dapat masuk

ke dalam dinding sel bakteri menyebabkan sel menjadi berwarna merah

sedangkan pada Gram negatif dinding selnya terhidrasi oleh mekanisme

pencucian alkohol (Entjang 2003).

Amplikon Gen 16S rRNA

Sekuen 16S umumnya digunakan dalam penentuan hubungan kekerabatan

strain bakteri melalui proses penyejajaran. Sekuen 16S digunakan karena bersifat

spesifik untuk prokariot, sehingga kesalahan (galat) yang terjadi selama proses

penyejajaran nukleotida dapat diminimalisir, yang membedakannya dengan

eukariot. Sekuen 16S ribosomal DNA merupakan materi genetika yang terletak

pada ribosom subunit kecil. Satuan S (Svedberg) menunjukan kemampuan DNA

untuk mengalami sedimentasi pada waktu 10-13 detik (Cole et al. 2013). Hasil

amplifikasi menunjukkan semua isolat merupakan jenis bakteri ditunjukkan

17

dengan terbentuknya pita DNA dengan ukuran sesuai dengan target, yaitu 1500 bp.

Amplikon 16S rRNA kemudian digunakan untuk proses perunutan basa.

Amplifikon Gen pmoA

Keberadaan enzim metan monooksigenase pada bakteri dapat diketahui

dengan mengidentifikasi gen-gen pembentuk MMO. Seperti yang telah dijelaskan

sebelumnya, enzim MMO akan mempercepat reaksi oksidasi metana menjadi

methanol melalui reaksi berikut :

Enzim MMO terdiri dari metan monooksigenase partikel (pMMO) dan metan

monooksigenase terlarut (sMMO). Enzim pMMO yang dikodekan oleh gen pmoA

terdapat dalam membran intrasitoplasmik, sedangkan sMMO yang dikodekan

oleh gen mmoB terdapat dalam sitoplasma (Hanson & Hanson 1996). Secara

struktur, enzim MMO terdiri atas tiga komponen protein yaitu komponen B,

reduktase dan hidoksilase (MMOH), merupakan sisi aktif yang mengandung situs

hydro-bridged dinuclear yang menjadi sisi katalitik (Lipscomb 1994). Dalam

penelitian ini, hanya gen pmoA yang akan diidentifikasi. Identifkasi gen pmoA

menggunakan primer spesifik 189f – 682r dan 189f - 650r.

Susunan oligonukleotida primer 189f - 682r di rangkai untuk amplifikasi

fragmen internal yang mengodekan gen untuk kompleks enzim pMMO dan AMO

(amonia monooksigenase) (Holmes et al. 1999). Amplifikasi dengan primer ini

dikonfirmasi menggunakan elektroforesis dan diamati dengan gel doc. Hasil

penelitian mengindikasikan bahwa AM4, AM5, AM6 memiliki gen pmoA karena

DNA dapat teramplifikasi oleh primer spesifik, dengan ukuran pita yang terbentuk

sesuai target yaitu ~500 bp namun hasil elektroforesis juga menunjukkan adanya

pita dengan ukuran lain yang terbentuk. Sampel AM1, AM2, AM3 dan AM7 tidak

menunjukkan hasil yang positif karena pita DNA terbentuk bukan pada ukuran

yang ditargetkan (Gambar 5). Menurut Bourne (2001), primer 682r memiliki

empat redundansi di dalam urutan sekuens sehingga diduga menyebabkan

multiple-banding pada analisis elektroforesis. Selain itu, primer 682r dirangkai

terbatas untuk isolat bakteri yang berasal dari lingkungan dengan jumLah populasi

metanotrofnya tinggi (McDonald 1997). Selain beberapa faktor primer dan

lingkungan asal isolat, suhu penempelan primer juga merupakan salah satu faktor

penting yang mempengaruhi hasil amplifikasi. Suhu penempelan yang terlalu

tinggi dapat menyebabkan primer tidak menempel pada DNA template dan suhu

yang terlalu rendah dapat menyebabkan penempelan lebih di satu situs (Yuwono

2008).

Analisis gen pmoA juga dilakukan menggunakan primer 189f – 650r.

Hasil positif ditunjukkan oleh sampel AM1, AM2, AM5, dan AM6 dengan pita

DNA cukup spesifik menghasilkan ukuran DNA berkisar 500bp, sesuai dengan

yang di targetkan. Sampel AM7 juga menunjukkan adanya pita namun pada

ukuran 400 bp (Gambar 6). Bourne (2001) menyatakan bahwa primer 650r

memiliki spesifitas yang lebih baik dibanding dengan 682r karena dirangkai tanpa

memiliki redundansi dan tidak dapat mengamplifikasi gen amoA (amonia

monooksigenase). Hasil amplifikasi menggunakan kedua primer ini menunjukkan

isolat AM1, AM2, AM4, AM5, dan AM6 memiliki gen pmoA yang berperan

dalam proses oksidasi gas metan.

CH4 + NADPH + H+ + O2 H2O + NADP+ + CH3OH

18

Amplikon Gen mxaF

Metanol yang terbentuk sebagai awal dari proses metabolisme metanotrof

akan dioksidasi oleh enzim metanol dehidrogenase menjadi format kemudian

dioksidasi kembali oleh format dehidrogenase menjadi CO2. Enzim MDH

merupakan protein pertama pada rantai transpor eletron terlarut Enzim MDH

merupakan enzim dehidrogenase yang memiliki prostetik grup berupa

pyrroloquinoline quinone (PQQ), yang merupakan komplek sitokrom. Secara

struktur, MDH memiliki 4 sistein di subunit alfa, dua macam sistein di subunit

beta, dan struktur ini mengindikasi jika semua senyawa sistein ini terlibat dalam

pembentukan jembatan sulfida (Blake 1994).

Berdasarkan hasil penelitian, tujuh isolat memiliki gen mxaF. Karena

DNA sampel dapat teramplifikasi (menunjukkan hasil positif) menggunakan

primer spesifik mxaF. Hasil elektroforegram menunjukkan sampel AM1 – AM7

memiliki ukuran pita antara 500 bp – 600 bp. Beberapa sampel menghasilkan pita

DNA lebih dari satu. Hal ini dapat dipengaruhi oleh suhu penempelan yang tidak

sesuai. Suhu penempelan primer adalah salah satu parameter penting yang perlu

disesuaikan dalam reaksi amplifikasi. Primer akan membentuk jembatan hidrogen

dengan DNA genom pada daerah sekuen yang komplementer dengan sekuen pada

primer (Yuwono 2006). Selain itu, pembentukan pita tambahan yang berukuran

lebih kecil menunjukkan pembentukan dimer primer (miss priming) (Ulrich et al.

2008). Oleh karena itu, optimasi suhu penempelan primer perlu disesuaikan

dengan tujuan untuk meningkatkan spesifitas reaksi amplifikasi agar primer

menempel pada sekuen yang tepat.

Identifikasi Bakteri dan Analisis Bioinformatika

Sekuensing DNA isolat dilakukan untuk mengetahui urutan basa dari

DNA sampel selanjutnya digunakan untuk analisis kekerabatan sampel dengan

spesies bakteri terdekat berdasarkan database yang ada. Hasil sekuen yang

diperoleh dibandingkan dengan sekuen DNA yang tersedia pada database di

NCBI melalui proses penyejajaran (nucleotide blast). Hasil blast menunjukkan

tingkat kehomologan semua sampel berkisar antara 77% - 94%, nilai

kehomologan lebih dari 70% sudah cukup untuk mengidentifikasi suatu bakteri

dalam suatu genus (Li & Graur 2000). Kekerabatan terdekat ditunjukkan oleh

isolat AM5 dan spesies Mesorhizobium amorphae strain JN37 ribosomal RNA

gene. Berdasarkan hasil ini juga maka diketahui bahwa spesies bakteri

Mesorhizobium dapat menggunakan gas metan sebagai sumber karbonnya, serta

memiliki gen pmoA dan mxaF. Selain isolat AM5, enam isolat lainnya

teridentifikasi sebagai golongan Alphaproteobacteria spesies Methylocystis sp.

Bakteri yang termasuk ke dalam genus Methylocystis merupakan bakteri

metanotrof tipe II, di dalam selnya mengandung membran intrasitoplasmik yang

disusun sebagai lapisan bertingkat sepanjang dinding selnya, serta menggunakan

jalur metabolisme serin dalam proses asimilasi formaldehid. Karakteristik lainnya

adalah bersifat aerobik, dapat tumbuh pada suhu 25-30 ˚C, pH 7,0, dan selnya

berbentuk batang dengan ukuran kecil (Bowman cit Brenner et al. 2005).

Karakteristik ini sesuai dengan hasi penelitian yang mendukung bahwa isolat

merupakan genus Methylocystis.

19

Filogenetik adalah ilmu yang mempelajari mengenai hubungan antar

organisme kaitannya dengan proses evolusi. Data yang digunakan untuk

mempelajari filogeni berupa data morfologi dan data molekular. Filogeni yang

dipelajari menggunakan data molekular disebut molekular filogenetik.

Keuntungan menggunakan molekular filogenetik di antaranya adalah didasarkan

pada pewarisan genetik yang jelas, bersifat tidak ambigu, pola evolusi yang

digambarkan menggunakan aturan yang tetap, dan dapat dianalisis secara

kuantitatif (Li & Graur 2000). Analisis pohon filogenetik dibuat untuk

mengetahui kekerabatan semua isolat dengan beberapa spesies Methylocystis dan

Methylobacter. Beberapa sekuens bakteri diambil dari Ribosomal Database

Project (RDP), kemudian dilakukan proses penyejajaran dengan program MEGA

5.0 dan dibuat pohon filogenetiknya. Isolat AM1, AM3, AM4, AM5, AM6, dan

AM7 berada pada kelompok yang sama dan kekerabatannya dekat dengan spesies

Methylocystis. Keenam isolat yang saling berdekatan ini berada pada kelompok

yang berbeda dengan spesies lainnya. Isolat AM2 yang terpisah dari isolat lainnya

memiliki kekerabatan yang dekat Methylocystis hirsuta.

Angka bootstrap menunjukkan kehomologan antar satu spesies dengan

yang lainnya, semakin besar angka yang ditunjukkan, maka kedua bakeri tersebut

merupakan spesies yang berbeda. Angka bootstrap dapat mengindikasikan adanya

novel spesies pada isolat yang telah diisolasi. Prinsip dari analisis bootstrap

adalah dengan penghasilan dataset semu (pseudo-dataset) yang setara dengan

dataset awal kita. Dataset yang dimaksud adalah total nukleotida hasil alignment

yang menjadi dasar untuk rekonstruksi pohon. Tahapan awal dari bootstrap ini

adalah penghasilan dataset sejumLah replikasi yang kita inginkan (umumnya

antara 200 hingga 2000 replikasi). Pseudo-dataset yang dihasilkan dari proses

bootstrap sama dalam hal jumLah nukleotida, namun berbeda dalam komposisi

nukleotidanya. Jadi ada daerah/situs dalam alignment tersebut yang disampel

lebih dari satu kali, namun juga ada daerah yang tidak disampel sama sekali dalam

penghasilan replikasinya. Penggunaan bootstrap bertujuan untuk melihat

konsistensi clade pada pohon filogeni hasil rekonstruksi (Swofford & Sullivan

2009). Angka bootstrap antara isolat AM6 dan isolat lainnya dalam satu

kelompok adalah 100, hal ini mengindikasikan kemungkinan bahwa enam isolat

merupakan spesies Methylocystis baru dan berbeda dengan isolat lainnya.

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Tujuh isolat bakteri metanotrof dapat menghabiskan 15 mL gas metan

selama 3 minggu dengan rata-rata konsumsi 0.7 mL per hari. Sampel AM1, AM2,

AM4, AM5, dan AM6 memiliki gen pmoA (metana monooksigenase) yang

merupakan enzim kunci dalam metabolisme metana. Semua sampel memiliki gen

mxaF (metanol dehidrogenase) yang berperan penting dalam metabolisme gas

metana. Enam isolat masuk ke dalam genus Methylocystis, termasuk ke dalam

bakteri metanotrof tipe II. Selain Methylocystis, isolat AM5 yang diidentifikasi

20

sebagai Mesorhizobium menunjukkan kemampuan dalam metabolisme gas metana

Hasil analisis filogenetik juga menunjukkan isolat merupakan spesies baru.

Saran

Perlu dilakukan optimasi lebih lanjut untuk proses amplifikasi pmoA dan

mxaF sehingga menghasilkan pita DNA yang lebih spesifik. Selain itu perlu

dilakukan uji karakterisasi lebih lanjut seperti uji inkubasi di suhu yang berbeda,

uji fiksasi nitrogen, uji pertumbuhan di media yang mengandung garam dan

mineral tertentu, seta uji-uji spesifik lainnya untuk menentukan identifikasi lebih

lanjut. Perlu dilakukan pengamatan morfologi bakteri menggunakan scanning

electron microscopy (SEM) atau transmission electron microsopy (TEM).

DAFTAR PUSTAKA

Asakawa S, Ogiso T, Ueno, dan Diaonou D. 2012. Methylomonas koyamae sp.

Nov a type I methane oxidizing bacterium froom floodwater of a rice

paddy field. International Journal of Systematic and Evolutionary

Microbiology. 62:1832 – 1837.

Blake CCF, Ghosh M, Harlos K, Avezoux A, dan Anthony C. 1994. The active

site of methanol dehydrogenase contains a disulphide bridge between

adjacent cysteine residues. Structural biology. 1 (2):102 – 105.

Bourne DG, McDonald IR, dan Murrell JC. 2001. Comparison of pmoA PCR

primer Sets as Tools for Investigating Methanotroph Diversity in Three

Danish Soils. Applied and Environmental Microbiology. 67(9):3802 -

3809.

Bowman JP. 2005. Family I. Methylocystaceae fam. nov. In Bergey's Manual of

Systematic Bacteriology, 2nd ed, vol. 2 (The Proteobacteria). Edited by D.

J Brenner, NR Krieg, JT Staley & GM Garrity. New York (US): Springer.

Chistoserdova L, JA Vorholt, dan ME Lidstrom. 2005. A genomic view of

methane oxidation by aerobic bacteria and anaerobic archae. Genome

Biology. 6:208.

Cole JR et al.. 2013. Ribosomal database project : data and tools for high

throughput rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 42: 633-642.

Dubey SK. 2005. Microbial Ecology of Methane Emission in Rice Ecosystem.

Applied and Ecological Environment. 3: 1-27.

Entjang I. 2003. Mikrobiologi dan Parasitologi untuk Akademi Keperawatan. PT

Jakarta (ID): Citra Aditya Bakti.

Fitiriani AR. 2012. Karakterisasi gen particulate methane monooxygenase

(pMMO) bakteri metanotrof asal sawah. [skripsi]. Bogor (ID): Institut

Pertanian Bogor.

21

Hanson RS dan Hanson TE. 1996. Methanotrophic bacteria. Microbiological

reviews. 60(2):439-471.

Henckel T, M Friedrich, dan R Conrad. 1999. Molecular analyses of the

methaneoxidizing microbial community in rice field soil by targeting the

genes of the16SrRNA, particulate methane monooxygenase and methanol

dehydrogenase. Applied and Environmental Microbiology. 65:1980–1990.

Holmes AJ, Semrau JD, Chistoserdov, J Lebron, A Costello, J Davagnino. 1999.

Particulate methane monooxygenase genes in methanotrophs. Journal of

Bacteriology. 177(11):3071-3079.

[IPCC] Intergovernmental Panel on Climate Change. 2007. The Suplementary

Report to The IPCC Scientific. Solomon SD, Qin M. Manning Z, Chen

M, Marquis, KB Averyt, M Tignor and HL Miller, editor. Cambridge

(UK): Cambridge University Press

Knief C, A Lipski, dan PF Dunfield. 2003. Diversity and activity of

methanotrophic bacteria in different upland soils. Applied and

Environmental Microbiology. 69:6703-6714.

Lay BW. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta (ID): Grafindo Persada

Li WH dan Graur D. 2000. Fundamentals of Molecular Evolution 2nd Ed. USA:

Sinnauer Associates Pub.

Lipscomb JD. 1994. Biochemistry of the soluble methane monoxygenase. Annual

Review of Microbiology. 48:371–399.

Lucas S, A Copeland, A Lapidus, T Glavina DR, E Dalin. 2009. Complete

sequence chromosome 2 of Ralstonia pickettii 12D. [Internet]. [diakses

2014 Mei 04]. Tersedia pada www.combrex.bu.edu

Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2006. Brock Biology of Microorganisms

11th Ed. New Jersey (US): Prentcie Hall.

Madigan MT, JM.Martinko, PVDunlap & DPClark. 2009. Brock Biology of

Microorganism Twelfth Edition. San Fransisco (US): Pearson Education

Inc.

McDonald IR, Uchiyama H, Kambe S, Yagi O & Murrel JC. 1997. The soluble

methane monooxygenase gene luster of thrichlororethylene degrading

methanotroph Methylocystis sp. Strain M.Appl Environment Microbiol.

40:370-375.

Meis J dan FL Chen. 2003. The Soil MasterTM DNA Extraction Kit Provides PCR

Ready Soil DNA in Less Than A Hour. Epicentre. 10: 9.

Mer JL dan Roger P. 2001. Production, oxidation, and consumption of methane

by soils : A review. Eur. J. Soil Biology. 37:25-50.

Nei M dan S Kumar. 2000. Molecular Evolution and Phylogenetics. London

(UK): Oxford University Press.

Octaviana S. 2010. Analisis Molekuler untuk Verifikasi Diversitas dan Aktifitas

Metanotrofik di Lahan Hutan Bakau. [skripsi]. Yogyakarta (ID):

Universitas Gajah Mada.

22

Rodriques H dan R Fraga. 1999. Phosphate Solubilizing Bacteria and Their Role

in Plant Growth Promotion. Biotehnology Advances. 17 : 319-339.

Swofford DL & J Sullivan. 2009. In The Phylogenetic Handbook: A Practical

Approach to Phylogenetic Analysis and Hypothesis Testing 2nd Ed.

Cambridge (UK): Cambridge University Press.

Ulrich RS et al. 2008. A review of the research literature on evidence-based

healthcare design. Health Environments Research and Design Journal,

1(3): 61–125

Vishwakarma P, M Singh, dan SK Dubey. 2009. Change in methanotrophic

community composition after rice orp harvest in tropical soils. Biology

and Fertility of Soils. 46(5):471-479.

Swofford DL dan J Sullivan. 2009. Phylogeny Inference Using Parsimony and

Other Methods Using PAUP*. In The Phylogenetic Handbook: A

Practical Approach to Phylogenetic Analysis and Hypothesis Testing 2nd

Ed. Cambridge (UK): Cambridge University Pres.

Willey JM, LM Sherwood dan CJ Woolverton. 2011. Prescott's microbiology, 8th

ed. New York (US): MC Graw-hill.

Yuwono T. 2008. Biologi Molekular. Jakarta (ID) : Erlangga.

23

LAMPIRAN

Lampiran 1Alur Penelitian

Pemurnian isolat

dengan subkultur di

media NMS cair

sebanyak tiga kali

Pewarnaan gram

bakteri dan

pegamatan

mikroskop

Penumbuhan bakteri di

media NMS padat

Pengukuran aktivitas

oksidasi gas metan

menggunakan GC-FID

Isolasi DNA

Amplifikasi gen pmoA

primer 189f - 682r dan

primer 189f - 650r, gen

mxaF, dan 16S rRNA

Sequensing

Analisis blast dan pohon

filogenetik

Proses Penulisan

24

Lampiran 2 Isolat-isolat bakteri metanotrof yang digunakan

Keterangan : 1 = AM1; 2 = AM2; 3 = AM3; 4 = AM4; 5 = AM5; 6 = AM6; 7 =

AM 7.

Lampiran 3 Tabel hasil pengukuran aktivitas oksidasi metana

Sampel Kadar Gas Metan pada hari ke – (%)

0 7 14 21

Kontrol 20 20,000 20,000 20,000

AM1 20 18,820 14,618 2,060

AM2 20 18,095 0,194 0,116

AM3 20 18,199 0,139 0,114

AM4 20 18,551 4,415 0,000

AM5 20 17,901 13,065 0,070

AM6 20 19,927 0,218 0,003

AM7 20 19,200 0,149 0,001

Lampiran 4 Konsentrasi DNA Isolat

No. Isolat Konsentrasi DNA (ng/µL)

1 AM1 17,52

2 AM2 14,06

3 AM3 12,20

4 AM4 15,80

5 AM5 18,05

6 AM6 21,45

7 AM7 19,06

1 2 3 4 5 6 7

25

Lampiran 5 Sekuens primer yang digunakan

No Nama

Primer Sekuen

1 9F 5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

1541R 5’-AAGGAGGTGATCAGCC-3’

A189

5’GGNGACTGGGACTTCTGGCGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCC

GCCG CCC CCG CCC G -3’ 2

A682R 5'GAASGCNGAGAAGAASGC-3'

3 A189

5’GGNGACTGGGACTTCTGGCGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCG

CCG CCC CCG CCC G -3’

A650R 5’ACGTCCTTACCGAAGGT-3’

4 1557R 5’GGGCAGCATGAAGGGCTCCC-3’

1001F

5’GCGGCACCAACTGGGGCTGGTCGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGT

CCCGCCGCCCCCGCCCG-3’

26

Lampiran 6 Hasil sekuensing Isolat

Isolat Konsentrasi DNA

A

M

1

AATGGAGATTTTTTTTTTTTTATTTATTTTTTCCCCCGACGCGCCTCGATACGTGTC

GATTCGCCCAGCGCAGCCTACGTGTCGCGGCTCCTCCGTTGCGAAAGCTTCGGGT

AAACCAATCCCATGGCAGCGGCGGGGGACAAGCCAGGAACGTTTCGCGTAGCGG

CTGATGTGGATTACTAGGATTCCGCTTCAGCACTCGAGTGCAGAGGCAATCCGAA

TCAGACGGCTTTTGAGATCTGTCCAGGTTGCCCTTCGCTTCCCATAGTCCCGCCAC

TGTAGCACGTGTGTAGCCCAACCTGTAAGGGCCATGAGGCATGAGGTCATCCCTA

CTTTCCTCGTGGCTTATCACCGTCAGTCCCAGTAGAGTGACCAAGTTAATGATGAC

AACTAAGGGAGAGGGTTGCGCTTGTTGCGGGAATTAACCCAACATTTCAAGACCC

GAACTGGCGACAACCATGCAGCACCTGTGCACCGGCCCCTTGCGGGAACAAAGC

CATCTCTGACGATCATTCCGGGCATGTCAAAAGTAGGTAAGGTTCTGCGCGTTGC

TTCGAATTAATCCACATGATCCACCGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAG

TTTTACATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGGCGGGAAGCTAAAGCGTTAGCTGCGC

ACTGAAGAGCAGCTCCCCAACGGCTAGCACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGG

GTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCCCTCAGCGTCAGTACCGGGCCAG

GGAGCCGCCTTCGCCATGGTGTTCTGCGAATATCTACGAATTTCACCTCTACACTC

GCAATTCCACTCACCTCTCCCGGACTCTAGACCTCCAGTATCAAAGGCAGTTCCCA

GGTTGAGCCTGGGATTTCACCCTGACTTAAAGATCCGCCTACGTGCGCTTTACGCC

CCAGTGATTCCGAACAACGCTGCCCCCTTCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGAA

GTTAGCCGGGGCTTCTTATCCAGGTACCGTCATTATCGTCCCTGGTGAAAGAGCTT

TACAACCCTAGGGACTTCATCACTCACGCGGCATGGCTGGATCATGCTTGCGCCC

ATTGTGCAATATTCCGCACTGCTGCCTCGCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTC

CCAGAGTGTGTGATCAGCCTCTCAGACCATCTACCGATCGTCGCCTTGATAAGCC

ATTACGACACCAACTATGTAATCGGACGAGGGCCGATCCTTCGGCAATAAATCTT

TCTGCTCTCGATCGTATCAGGTATTAACTCACGTTTCCCTGAGTTATTCAGAACCT

AAGGGAAGATCCCACTTTTACTCACTAGTCTGCACTCTGTATTGTACAGAGTCGAC

TGCATGTGTCAGACTGCCACACGTCGTCTCGGGGCACAAACAAAAAATTTTGGTA

AAGATGCCCCCGCGTCATTACAGGGGAAAACAAAAAAA

A

A

M

2

GGGGGCATCGTGCTCGGGATCCTGGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATCTTTAA

GTCAGGGGTGAAATCCCGAGGCTCAACCTCGGAACTGCCTTTGATACTGGAGGTC

TCGAGTCCGGGAGAGGTGAGTGGAACTGCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGAT

ATTCGCAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCCCGGTACTGACGCTGA

GGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGT

AAACGATGGATGCTAGCCGTTGGGGAGCATGCTCTTCAGTGGCGCAGCTAACGCT

TTAAGCATCCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGAC

GGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAA

CCTTACCAGCTTTTGACATGCCCGGTATGATCGCCAGAGATGGCTTTCTTCCCGCA

AGGGGCCGGTGCACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT

GGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCTTAGTTGCCATCATTCAGTTG

GGCACTCTAGGGGGACTGCCGGTGATAAGCCGCGAGGAAGGTGGGGATGACGTC

AAGTCCTCATGGCCCTTACAGGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGGTGACA

ATGGGAAGCGAAAGGGCGACCTGGAGCAAATCTCAAAAAGCCGTCTCAGTTCGG

ATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGGTGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCA

GCACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATG

GGGAAGTTGGTTTTACCCGAAAGGCGTTTCGCCAACCGCAAGGAGGCAGGCGAC

CACGGTAGGGTCAGCGACTGGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGGAAC

CGTGGGGGGGACGCCCCCCTAATATATATATAAAAGGGGGGGAGTGGAAGGGG

A

A

M

3

TTTTATATATATATTAGGGGGGCGTCCCCCCCACGGTTCCCTACGGCTACCTTGTT

ACGACTTCACCCCCAGTCGCTGACCCTACCGTGGTCGCCTGCCTCCTTGCGGTTGG

CGAAACGCCTTTCGGGTAAAACCAACTTCCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTAC

AAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCGTGCTGATCTGCGATTACTAGCGATTCC

ACCTTCATGCACTCGAGTTGCAGAGTGCAATCCGAACTGAGACGGCTTTTTGAGA

TTTGCTCCAGGTCGCCCTTTCGCTTCCCATTGTCACCGCCATTGTAGCACGTGTGT

AGCCCAGCCTGTAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCGCGGC

TTATCACCGGCAGTCCCCCTAGAGTGCCCAACTGAATGATGGCAACTAAGGGCGA

GGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACA

27

Lanjutan (lampiran 6)

GCCATGCAGCACCTGTGCACCGGCCCCTTGCGGGAAGAAAGCCATCTCTGGCGAT

CATACCGGGCATGTCAAAAGCTGGTAAGGTTCTGCGCGTTGCTTCGAATTAAACC

ACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAATCTTGCG

ACCGTACTCCCCAGGGCGGGATGCTTAAAGCGTTAGCTGCGCCACTGAAGAGCAT

GCTCCCCAACGGCTAGCATCCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAAT

CCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGCGTCAGTACCGGGCCAGTGAGCCGC

CTTCGCCACTGGTGTTCTTGCGAATATCTACGAATTTCACCTCTACACTCGCAGTT

CCACTCACCTCTCCCGGACTCGAGACCTCCAGTATCAAAGGCAGTTCCGAGGTTG

AGCCTCGGGATTTCACCCCTGACTTAAAGATCCGCCTACGTGCGCTTTACGCCCCA

GTGATTCCGAACAACGCTAGCCCCCTTCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGAAGT

TAGCCGGGGCTTCTTATCCAGGTACCGTCATTATCGTCCCTGGCGAAAGAGCTTTA

CAACCCTAGGGCCTTCATCACTCACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTGCGCCCAT

TGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCC

AGTGTGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTACCGATCGTCGCCTTGGTGCGCCATT

ACCACACCAACTAGCTAATCGGACGCGGGCCGATCTTTCGGCAATAAATCTTTCC

CCCAAAGGGCGTATCCGGTATTAGCTCAAGTTTCCCTGAGTTATTCCGAACCGAA

AGGCACGTTCCCACGCGTTACTCACCCGTCTGCCACTCCCTATTGCTAGGGCGTTC

GACTTGCATGTGTTAGGCCTGCCGCCAGCGTTCGTCTACGGAAAAAAAAAAACAC

ATACAA

A

A

M

4

TTTTTATATATATATATATAGGGGGGGACCCCACCCACAGTCCCTACGGCTACCTT

GTTACGACTTCACCCCCAGTCGCTGACCCTACCGTGGTCGCCTGCCCCCTTGCGGT

TGGCGAAACGCCTTTCGGGTAAAACCAACTTCCCCATGGTGGACGGGCGGTGTGT

ACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCATGCTGATCTGCGATTACTAGCGATT

CCACCTTTCATGCACTCGAGTTGCAGAGTGCAATCCGAACTGAGACGGCTTTTTG

AGATTTGCTAAGGGTCGCCCCTTCGCTTCCCATTGTCACCGCCATTGTAGCACGTG

TGTAGCCCAGCCTGTAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCCACCTTCCTCG

CGGCTTATCACCGGCAGTCCCCCTAGAGTGCCCAACTGAATGATGGCAACTAAGG

GCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGAC

GACAGCCATGCAGCACCTGTGTTCCGGCCCCTTGCGGGAAGGAAGTCATCTCTGA

CGACCATACCGGACATGTCAAAAGCTGGTAAGGTTCTGCGCGTTGCTTCGAATTA

AACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAATCA

TTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGGATGCTTAAAGCGTTAGCTGCGCCACTGAAGA

GCAAGCTCCCCAACGGCTAGCATCCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATC

TAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGCGTCAGTATCGGGCCAGTGAG

CCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTGCGAATATCTACGAATTTCACCTCTACACTCGC

AGTTCCACTCACCTCTCCCGAACTCGAGACCTCCAGTATCAAAGGCAGTTCCGAG

GTTGAGCCTCGGGATTTCACCCCTGACTTAAAGATCCGCCTACGTGCGCTTTACGC

CCCAGGATTCCGAACAACGCTAGCCCCCTTCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGA

AGTTAGCCGGGGCTTCTTATCCAGGTACCGTCATTATCGTCCCTGGCGAAAGAGC

TTTACAACCCTAGGGCCTTCATCACTCACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTGCGC

CCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAG

TCCCAGTGTGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTACCGATCGTCGCCTTGGTGCGC

CATTACCACACCAACTAGCTAATCGGACGCGGGCCGATCTTTCGGCAATAAATCT

TTCCCCCTAAGGGCGTATCCGGTATTAGCTCAAGTTTCCCTGAGTTATTCCGAACC

GAAAGGCACGTTCCCACGCGTTACTCACCCGTCTGCCACTCTGTATTGCTACAGCG

TTCGACTTGCATGTGTTAGGCCTGCCGCCAGCGTCGTCTAGGAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAAATTTTTTTAAAA

A

A

M

5

TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGGGGGGTTTTAACACGCGCCGTCGCCGCTACCT

TGTTACGATTTCACCCCCAGTCGCTGACCCTACGAGTGGTGGCGTGCCTCCTTGCG

GGTTAGCACAGCGCCTTTCGGGTAAAACCCAACTCCCCATGGTGTGACGGGCGGT

GTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGC

GATTCCAACTTCATGCACTCGAGTTGCAGAGTGCAATCCGAACTGAGATGGCTTT

TGGAGATTAGCTCGACCTCGCGGTCTCGCTGCCCACTGTCACCACCATTGTAGCAC

GTGTGTAGCCCAGCCCGTAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCT

CTCGGCTTATCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCCCAACTGAATGATGGCAACTAA

GGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTG

28

Lanjutan (lampiran 6)

ACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCCGGTCCAGCCGAACTGAAGGAATCCATCTC

TGGAAACCGCGACCGGGATGTCAAGGGCTGGTAAGGTTCTGCGCGTTGCTTCGAA

TTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAA

TCTTGCGACCGTACTCCCCAGGGCGGGAAGCTTAATGCGTTAGCTGCGCCACCGA

CGAGGTAAACTTGCCAACGGCTAGCTTCCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGG

TATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCCCTCAGCGTCAGTACCGGACCAGT

GAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCGAATATCTACGAATTTCACCTCTACACT

CGGAATTCCACTCACCTCTTCCGGACTCGAGACTACCAGTATCAAAGGCAGTTCC

GGGGTTGAGCCCCGGGATTTCACCCCTGACTTAATATCCGCCTACGGCGCTTTACG

CCCCAGTAAATCCCGAACAACGCTAGCCCCCTTCGTATTACCGCGGCTGCTGGCA

CGAAGTTAGCCGGGGCTTCTTCTACGGGTACCGTCATTATCTTCACGGATGAAAG

AGCTTTACAACCCTAGGGCCTTCATCACTCACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTG

CGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCT

CAGTCCCAGTGTGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTATGGATCGTCGCCTTGGTA

GGCCATTACCCCACCAACTAGCTAATCCAACGCGGGCTCATCCATCACCGATAAA

TCTTTCTCCAATAGGACGTATACGGTATTAGCTCCAGTTTCCCTGAGTTGTTCCGA

AGTGATGGGTAGATTCCCACGCGTTACTCACCCGTCTGCCGCTCACCTTGCGGGG

CGCTCGACTTGCATGTGTTAAGCCTGCCGCCAGCGTTGTTCTACGAAGGGGGAGG

AAAAAAAAAAAAAAAAA

A

A

M

6

TTTTTTTTTTTTTTTAAAAAGGGGCATCCACCCACACCGTCCCTACGGCTACCTTGT

TACGACTTCACCCCCAGTCGCTGACCCTACCCGTGGTCGCCTGCCTCCTTGCGGTT

GGCGAAACGCCTTTCGGGTAAAACCAAATTCCCCATGGTGGACGGGCGGTGTGTA

CAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCGTGCTGATCTGCGATTACTAGCGATTC

CACCTTCATGCACTCGAGTTGCAGAGTGCAATCCGAAATTGAGACGGCTTTTTGA

GATTTGCTCCAGGTCGCCCTTTCGCTTCCCATTGTCACCGCCATTGTAGCACGTGT

GTAGCCCAGCCTGTAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCGCG

GCTTATCACCGGCAGTCCCCCTAGAGTGCCCAACTGAATGATGGCAACTAAGGGC

GAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGA

CAGCCATGCAGCACCTGTGCACCGGCCCCTTGCGGGAAGAAAGCCATCTCTGGCG

ATCATACCGGGCATGTCAAAAGCTGGTAAGGTTCTGCGCGTTGCTTCGAATTAAA

CCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAATCTTG

CGACCGTACTCCCCAGGCGGGATGCTTAAAGCGTTAGCTGCGCCACTGAAGAGCA

AGCTCCCCAACGGCTAGCATCCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAA

TCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGCGTCAGTACCGGGCCAGTGAGCCG

CCTTCGCCACTGGTGTTCTTGCGAATATCTACGAATTTCACCTCTACACTCGCAGT

TCCACTCACCTCTCCCGGACTCGAGACCTCCAGTATCAAAGGCAGTTCCGAGGTT

GAGCCTCGGGATTTCACCCCTGACTTAAAGATCCGCCTACGTGCGCTTACGCCCA

GGATCCGAACAACGCTACCCCCTTCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGAAGTTAG

CCGGGGCTTCTTATCCAGGTACCGTCATTATCGTCCCTGGCGAAAGAGCTTTACAA

CCCTAGGGCCTTCATCACTCACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTGCGCCCATTGTC

CAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTG

TGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTACCGATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCT

CACCAACTAGCTAATCGGACGCGGGCCGATCCTTCGGCGATAAATCTTTCTGCTCT

CGCACGTATCCGGTATTAGCTCAAGTTTCCCTGAGTTATTCCGAACCGAAGGGCA

CGTTCCCACGCGTTACTCACCCGTCTGCCACTCTGTATTGCTACAGCGTTCGACTT

GCATGTGTTAGGCCTGCCGCCAGCGTTCGTCTACGGGGGGGAAAAAAAAAAAAA

AA

A

A

M

7

TTATATATATATTATATATTGAGGGGGGGCCCCCCACACGTTCCTACGGCTACCTT

GTTACGACTTCACCCCCAGTCGCTGACCCTACCGTGGTCGCCTGCCTCCTTGCGGT

TGGCGAAACGCCTTCCGGGTAAAACCAACTCCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGT

ACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCGTGCTGATCTGCGATTACTAGCGATT

CCACCTTCATGCACTCGAGTTGCAGAGTGCAATCCGAACTGAGACGGCTTTTTGA

GATTTGCTCCAGGTCGCCCTTTCGCTTCCCATTGTCACCGCCATTGTAGCACGTGT

GTAGCCCAGCCTGTAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCGCG

GCTTATCACCGGCAGTCCCCCTAGAGTGCCCAACTGAATGATGGCAACTAAGGGC

GAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGA

29

CAGCCATGCAGCACCTGTGCACCGGCCCCTTGCGGGAAGAAAGCCATCTCTGGCG

ATCATACCGGGCATGTCAAAAGCTGGTAAGGTTCTGCGCGTTGCTTCGAATTAAA

CCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAATCTTG

CGACCGTACTCCCCAGGGCGGGATGCTTAAAGCGTTAGCTGCGCCACTGAAGAGC

ATGCTCCCCAACGGCTAGCATCCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTA

ATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGCGTCAGTACCGGGCCAGTGAGCC

GCCTTCGCCACTGGTGTTCTTGCGAATATCTACGAATTTCACCTCTACACTCGCAG

TTCCACTCACCTCTCCCGGACTCGAGACCTCCAGTATCAAAGGCAGTTCCGAGGTT

GAGCCTCGGGATTTCACCCCTGACTTAAAGATCCGCCTACGTGCGCTTACGCCCA

GGATTCCGAACAACGCTAGCCCCCTTCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGAAGTT

AGCCGGGGCTTCTTATCCAGGTACCGTCATTATCGTCCCTGGCGAAAGAGCTTTAC

AACCCTAGGGCCTTCATCACTCACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTGCGCCCATT

GTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCA

GTGTGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTACCGATCGTCGCCTTGGTGCGCCATTA

CCACACCAACTAGCTAATCGGACGCGGGCCGATCTTTCGGCAATAAATCTTTCCC

CCAAAGGGCGTATCCGGTATTAGCTCAAGTTTCCCTGAGTTATTCCGAACCGAAA

GGCACGTTCCCACGCGTTACTCACCCGTCTGCCACTCCCTATTGCTAGGGCGTTCG

ACTTGCATGTGTTAGGCCTGCCGCCAGCGTTCGTCTCGAAAAAAAAAAACACACA

TATAAA

Lampiran 7 Tabel singkat hasil penelitian

I

Isolat

Asal

Sampel Spesies Terdekat

Gen

pmoA

G

Gen

mxaF

Penampakan

sel

Pertumbuhan

di media agar

NMS

AM1 T

Tanah

padi

Methylocystis sp. +

+

+

+

Gram (-),

batang

+

A

M2

T

Tanah

padi

Methylocystis sp. +

+

+

+

Gram (-),

batang

+

A

M3

T

Tanah

gambut

Methylocystis sp. +

+

+

+

Gram (-),

batang

+

A

M4

T

Tanah

gambut

Methylocystis sp. +

+

+

+

Gram (-),

kokus

+

A

M5

T

Tanah

gambut

Mesorhizobium

sp.

+

+

+

+

Gram (-) ,

kokus

+

A

M6

T

Tanah

padi

Methylocystis sp. +

+

+

+

Gram (-),

batang

+

A

M7

T

Tanah

gambut

Methylocystis sp. +

+

+

+

Gram (-),

batang

+

30

RIWAYAT HIDUP

Penulis adalah anak kedua dari Bapak Agus Salim dan Ibu Saptini

Darmaningrum. Penulis lahir di Surabaya, 26 Oktober 1992. Mengawali

pendidikan kegiatan belajar dari TK Raden Fatah Sidoarjo, lalu SD Negeri Pucang

IV Sidoarjo, SMP Negeri 3 Sidoarjo, SMA Negeri 1 Sidoarjo dan sekarang di

Departemen Biokimia Institut Pertanian Bogor.

Prestasi yang pernah diraih selama kuliah, yaitu Juara 1 lomba debat

bahasa Inggris kompetisi Internal IPB Debating Community (IDC) 2010, delegasi

IPB untuk lomba United Asian Debating Championship (UADC) 2012, Quarter

finalist ALSA Debating Championship 2012, Akreditasi juri debat ALSA UI,

2013, PKM didanai oleh DIKTI dengan judul : Inhalasi Aromaterapi utnuk

hiperkolestrol, Juara `1 Penulisan esai “exploscince’ 2013, finalis Tanoto Student

researh awards 2013, dan Mahasiswa berprestasi biokimia 2014. Selain di bidang

akademik, penulis juga memilik prestasi di bidang kesenian yaitu, juara 2 lomba

akustik di BCL 2012. Penulis pernah melakukan magang dan praktik lapang di

BB- Biogen.

Selama kuliah penulis pernah mengikuti organisasi kemahasiswaan

sebagai sekertaris di unit kegiatan mahasiswa IPB Debating Community (IDC),

anggota divisi pengembangan bakat seni dan olahraga di CREBs, staff

kementerian pendidikan dan keilmuan BEM KM IPB kabinet Kreasi Untuk

Negeri 2013, dan sekarang masih aktif di organisasi Inovasi untuk Indonesia

sebagai koordinator program. Selain itu, penulis juga aktif sebagai asisten

praktikum biologi dasar selama 2012-2014. Beberapa kepanitaan yang pernah

diikuti oleh penulis antara lain, bendahara umum International Shcolarship and

Education Expo (ISEE) 2013, anggota divisi workshop IELTS ISEE 2012,

anggota divisi acara IPB’s dedication of education (IDEA), dan ketua divisi seni

BCL 2013.