1

BAB IPENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Wanita sebagai makhluk ciptaan Tuhan yang istimewa sangat rentan

dengan berbagai penyakit kewanitaan. Salah satu penyakit umum yang sering

dialami oleh wanita adalah Vaginitis atau dalam istilah awam lebih dikenal

dengan keputihan. Banyak faktor yang dapat menyebabkan vaginitis . Salah satu

penyebab umumnya adalah ketidakseimbangan mikroflora dalam vagina serta

ketidakstabilan tingkat keasaman (pH) vagina (pH 3,5-4,5). Pada pH ini hidup

beragam mikroflora yang terdiri dari bakteri anaerob dan bakteri aerob (Kale,

Trivedi et al. 2005). Salah satu bakteri anaerob yang hidup dan sangat

mempengaruhi keseimbangan vagina adalah bakteri Lactobaccilus sp. . Populasi

Lactobaccilus sp. dalam vagina hampir 95% sehingga aktifitas Lactobaccilus sp.

penting untuk melindungi wanita dari infeksi genital dan untuk menjaga

keseimbangan alami dari flora vagina (Donati, Di Vico et al. 2010). Sekresi asam

laktat dari Lactobaccilus sp. berperan penting untuk mempertahankan pH asam

dalam vagina. Selain asam laktat, Lactobaccilus sp. juga menghasilkan hidrogen

peroksida dan antimikroba (Laktosin dan Basitrasin) yang mencegah pertumbuhan

mikroorganisme patogen dalam vagina (Aroutcheva, Gariti et al. 2001). Koloni

mikroflora dalam vagina dapat menurunkan jumlah Lactobaccilus sp. .

Kondisi ketidakstabilan mikroflora dalam vagina dapat diobati dengan

memperbanyak produksi asam laktat, probiotik dan antibiotik ataupun kombinasi

dengan sediaan obat yang berefek lokal seperti supositoria untuk vagina yang

dikenal dengan istilah ovula (Kale, Trivedi et al. 2005). Terapi dari Lactobaccilus

sp. ini bertujuan untuk memulihkan pH keasaman dari lumen vagina. Kerugian

dari penggunaan ovula ini yaitu dari migrasi dalam vagina yang mengakibatkan

distribusi zat aktif yang tidak tepat. Penggunaan polimer untuk pengembangan

ovula dapat mencegah terjadinya migrasi di dalam vagina dan pelepasan zat aktif

yang terkendali (Fontaine, 1990).

2

Dalam penelitian ini digunakan basis berupa Polietilen glikol (PEG 4000)

kerena memiliki peleburan yang mudah (Leuner and Dressman, 2000). Basis PEG

4000 aman digunakan untuk ovula yang mengandung Lactobaccilus sp. ,

antimikroba dan asam laktat ataupun dalam kombinasi. Pelepasan asam laktat

menjadi molekul yang lebih kecil akan menurunkan pH saluran vagina yang

menghambat perkembangan bakteri (Petrova, 2007), sedangkan antimikroba dapat

menghambat pertumbuhan patogen mikroba untuk jangka panjang. Salah satu

antimikroba yang dapat digunakan adalah metronidazol. Metronidazol memiliki

aktivitas yang baik terhadap bakteri anaerob di dalam vagina. Oleh kerena

aktivitas yang baik tersebut, maka dibuat kombinasi ovula Lactobaccilus sp. -

Metronidazol dengan basis Polietilen glikol (PEG).

1.2 Tujuan Penelitian

1. Membuat supositoria vaginal ( ovula ) yang mengandung Lactobaccilus

sp. dikombinasi dengan Metronidazol dengan 2 (dua) metode .

2. Menentukan stabilitas Ovula Lactobaccilus sp. yang dikombinasi

dengan Metronidazol pada penyimpanan suhu sejuk 5-15 oC dan suhu

kamar 25-30 oC selama 2 bulan.

3. Menentukan pertumbuhan mikroorganisme Lactobaccilus sp. dalam

sediaan ovula.

1.3 Hipotesis

1. Lactobaccilus sp. dapat diformulasikan sebagai bahan probiotik dalam

bentuk kombinasi ovula Lactobaccilus sp. -Metronidazol.

2. Formulasi sediaan Ovula Lactobaccilus sp. yang dikombinasi dengan

Metronidazol stabil pada penyimpanan suhu sejuk 5-15 oC dan suhu

kamar 25-30 oC selama 2 bulan.

3. Mikroorganisme Lactobaccilus sp. dapat hidup dalam sediaan.

3

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Pengertian ovula

Ovula adalah salah satu bentuk  sediaan farmasi yang digunakan untuk

obat luar, dalam hal ini melalui vaginal yang ditujukan untuk mencapai efek

lokal maupun sistemik. Menurut Farmakope Indonesia edisi IV yang dimaksud

dengan sediaan ovula adalah sediaan padat dalam berbagai bobot dan bentuk

yang diberikan melalui vagina. Ovula umumnya meleleh, melunak, atau melarut

pada suhu tubuh. Bahan dasar ovula umumnya lemak coklat, gelatin

trigliserinasi, minyak nabati terhidrogenasi, campuran polietilen glikol  berbagai

bobot molekul dan ester asam lemak Polietilen glikol. Bentuk dan ukuran ovula

harus sedemikian rupa sehingga dapat dengan mudah dimasukkan ke dalam

lubang atau celah yang diinginkan tanpa meninggalkan kejanggalan begitu

masuk, harus dapat bertahan untuk suatu waktu tertentu (Ansel, 2005)

Penggunaan ovula bertujuan untuk tujuan sistemik karena dapat diserap

oleh membran mukosa dalam vagina, untuk memperoleh kerja lebih cepat, dan

untuk menghindari perusakan obat oleh enzim di dalam saluran gastrointestinal

dan perubahan obat secara biokimia di dalam hati (Syamsuni, 2005).

2.2 Lactobaccilus sp.

Lactobaccilus sp. adalah genus bakteri gram-positif, anaerobik fakultatif

atau mikroaerofilik. Genus bakteri ini terbentuk sebagian besar dari kelompok

bakteri asam laktat, dinamakan demikian karena kebanyakan anggotanya dapat

mengubah laktosa dan gula lainnya menjadi asam laktat. Kebanyakan dari bakteri

ini umumnya tidak berbahaya bagi kesehatan.

4

Gambar 1. Bakteri Lactobaccilus sp. Sumber : Anonim, 2010

Di dalam tubuh manusia, bakteri ini dapat ditemukan di dalam vagina

dan sistem pencernaan, dimana mereka bersimbiosis dan merupakan sebagian

kecil dari flora usus. Produksi asam laktatnya membuat lingkungannya bersifat

asam dan mengganggu pertumbuhan beberapa bakteri merugikan.

Beberapa Lactobaccilus sp. dan bakteri asam laktat lainnya mungkin

memiliki potensi untuk pengobatan dan terapi, termasuk pereda rasa nyeri, anti-

kanker, dan kemampuan lainnya. Studi riset telah mendemonstrasikan efek

perlindungan sebagian jenis bakteri ini memiliki pengaruh anti-tumor dan anti-

kanker. Pengaturan asupan makanan membantu tubuh bertahan dari risiko jenis

kanker tertentu dan menekan kejadian tumor kolonik, volum dan kemampuan

membelah yang dirangsang berbagai zat karsinogen. Pemberian beberapa jenis

bakteri secara oral dapat efektif menurunkan formasi ikatan DNA (Dioksi Nukleo

Acid), memperbaiki kerusakan DNA dan mencegah lesi yang putatif

preneoplastik, seperti abberant crypt foci yang dirangsang zat kimia karsinogen di

sistem pencernaan (Aroutcheva, Gariti et al. 2001).

Lactobaccilus sp. juga digunakan untuk mengembalikan keseimbangan

fisiologis tertentu seperti ekosistem vagina (g inoflora ). Peran Lactobaccilus sp.

ditinjau dari segi fisis melindungi epitelium vagina dengan membangun lapisan

tebal yang memisahkan epitelium dengan patogen. Secara fisiologis menjaga

keseimbangan ekosistem vagina dengan mempertahankan pH pada 4,5 dan 3,5.

5

Serta membentuk hidrogen peroksida yang melawan mikroorganisme patogen

(Aroutcheva, Gariti et al. 2001).

2.3. Anatomi dan Fisiologi Vagina (Bhalla, 2007)

Vagina adalah fibro otot bergaris dengan epitel berlapis,

menghubungkan eksternal dan internal organ-organ reproduksi dan mempunyai

bentuk ke atas dan ke belakang pada sudut sekitar 45° antara kandung kemih di

depan dan rektum dan anus belakang. Pada dewasa, anterior dinding sekitar 7,5

cm (3 inhes) panjang dan dinding posterior adalah sekitar 9,0 cm. Perbedaan ini

disebabkan oleh penonjolan serviks melalui dinding anterior.

Vagina memiliki penutup lapisan luar areolar, lapisan tengah otot polos

dan lapisan dalam berupa jaringan epitel yang dialiri banyak pembuluh darah.

Tidak memiliki sekresi kelenjar, tetapi permukaan tetap lembab oleh sekresi

serviks. Antara pubertas dan Lactobaccilus sp. mikroba menopause biasanya

hadir dan mereka mengeluarkan laktat asam, mempertahankan pH antara 3,5 dan

4,5. Keasaman menghambat pertumbuhan mikroba yang dapat memasuki vagina

dari perineum.

Penyerapan berbagai macam obat dari vagina telah dipelajari. Sebuah

tinjauan yang menjelaskan studi tentang penyerapan vagina steroid, prostaglandin,

antimikroba, antivirus, protein dan nonxynol-9. Sama dengan pemberian obat lain

yang melalui mukosa.

Perjalanan obat melewati membran vagina dapat terjadi melalui

beberapa mekanisme :

a) Difusi melalui sel karena konsentrasi gradien (rute transelular)

b) Vesikular atau mekanisme transport aktif

c) Difusi antara sel-sel melalui membran intraseluler

Dalam beberapa kasus, obat yang diberikan melalui rute intravaginal

memiliki bioavailabilitas lebih tinggi dibandingkan dengan rute oral. Hal ini

karena obat masuk langsung ke dalam sistemik sirkulasi tanpa melewati

6

metabolism hati. Dinding vagina ini sangat cocok untuk absorpsi obat untuk

penggunaan sistemik, karena berisi jaringan yang luas dari pembuluh darah.

2.4. Metronidazol

Metronidazol adalah anggota kelas imidazol sebagai agen antibakteri dan

diklasifikasikan sebagai antiprotozoa dan agen antibakteri. Nama

kimia,metronidazol adalah 2-methyl-5-nitroimidazole-1-etanol yang memiliki

rumus kimia dari C6H9N3O3, berat molekul 171,16, dan memiliki struktur sebagai

berikut (Anonim, 1979)

CH2CH2OH

O2N N CH3

N

Gambar 2 : Struktur MetronidazolSumber : Anonim, 1979

Ditinjau dari segi mikrobiologi, sasaran intraseluler  metronidazol pada

anaerob sangat tidak dikenal. Kelompok 5-nitro dari metronidazol berkurang oleh

metabolik anaerob yang aktif, dan studi telah menunjukkan bahwa bentuk

pengurangan obat berinteraksi dengan DNA bakteri. Namun, tidak jelas apakah

interaksi dengan DNA sendiri merupakan komponen penting dalam aksi

bakterisidal metronidazol pada organisme anaerobik. Uji kepekaan bakteri tidak

secara rutin dilakukan untuk menegakkan diagnosis vaginosis bakteri.

Metodologi standar untuk pengujian kerentanan patogen potensial vaginosis

bakteri, vaginalis Gardnerella, Mobiluncus spp, dan. Mycoplasma hominis, belum

didefinisikan. Meskipun demikian, metronidazol adalah agen antimikroba aktif in

vitro terhadap sebagian besar strain organisme berikut yang sudah dilaporkan

dikaitkan dengan vaginosis bakteri (Beigi, Austin et al. 2004) : Bacteroides spp. ,

Gardnerella vaginalis, Mobiluncus spp. , Peptostreptococcus spp.

Penggunaan metronidazol diindikasikan dalam pengobatan vaginosis

bakteri (dahulu disebut sebagai Haemophilus vaginitis, Gardnerella vaginitis,

spesifik vaginitis, Corynebacterium vaginitis, atau vaginosis anaerob). Untuk

7

diagnosis klinis vaginosis bakteri biasanya ditentukan oleh adanya cairan vagina

homogen yang memiliki pH lebih besar dari 4,5, memancarkan “amis” bau amina

bila dicampur dengan 10%. larutan KOH. Identifikasi klinis lebih lanjut

ditunjukkan oleh cairan vagina yang mengandung sel petunjuk pada pemeriksaan

mikroskopis. Gram stain hasil yang konsisten dengan diagnosis vaginosis bakteri

termasuk morfologi Lactobaccilus sp. nyata berkurang atau tidak ada, dominasi

Gardnerella morphotype, dan tidak ada atau sedikit sel darah putih. Patogen lain

yang umumnya terkait dengan vulvovaginitis, misalnya, vaginalis Trichomonas,

Chlamydia trachomatis, N.gonorrhoeae, Candida albicans, dan virus Herpes

simplex harus disingkirkan (Beigi, Austin et al. 2004).

2.5. PEG (Polietilen glikol)

PEG (Polietilen glikol) merupakan salah satu jenis bahan pembawa yang

sering digunakan sebagai bahan tambahan dalam suatu formulasi untuk

meningkatkan pelarutan obat yang sukar larut. Bahan ini merupakan salah satu

jenis polimer yang dapat membentuk komplek polimer pada molekul organik

apabila ditambahkan dalam formulasi untuk meningkatkan kecepatan pelarutan

yang dapat membentuk komplek dengan berbagai obat. Nama lain basis ini adalah

Carbowax, Carbowax Sentry, Lipoxol, Lutrol E dan Phenol E. (Anonim, 1979)

Polietilen glikol (PEG) disebut juga makrogol, merupakan polimer

sintetik dari oksietilen dengan rumus struktur H(OCH2CH2)nOH, dimana n adalah

jumlah rata-rata gugus oksietilen. PEG umumnya memiliki bobot molekul antara

200–300. Penamaan PEG umumnya ditentukan dengan bilangan yang

menunjukkan bobot molekul rata-rata. Konsistensinya sangat dipengaruhi oleh

bobot molekul. PEG dengan bobot molekul 200-600 (PEG 200-600) berbentuk

cair, PEG 1500 semi padat, dan PEG 3000-20000 atau lebih berupa padatan semi

kristalin, dan PEG dengan bobot molekul lebih besar dari 100000 berbentuk

seperti resin pada suhu kamar. Umumnya PEG dengan bobot molekul 1500-20000

yang digunakan untuk pembuatan dispersi padat (Warren, 2005).

Polietilen glikol 400 (PEG 400) adalah polyethylene glykol H(O-CH2-

CH2)nOH Pemerian PEG 400 cairan kental jernih, tidak berwarna atau praktis

tidak berwarna,bau khas lemah, agak higroskopik. Dari segi kelarutannya, polimer

8

ini larut dalam air, dalam etanol (95%) P, dalam aseton P, dalam glikol lain dan

dalam hidrokarbon aromatik, praktis tidak larut dalam eter P dan dalam

hidrokarbon alifatik dengan bobot molekul rata-rata 380-420, Kandungan

kelembabannya sangat higroskopis walaupun higroskopis turun dengan

meningkatnya bobot molekul, Titik beku 4o-8oC (Nalam, 2009).

Polimer ini mudah larut dalam berbagai pelarut, titik leleh dan

toksisitasnya rendah, berada dalam bentuk semi kristalin (Harris, 1992).

Kebanyakan PEG yang digunakan memiliki bobot molekul antara 4000 dan

20000, khususnya PEG 4000 dan 6000. Proses pembuatan dispersi padat dengan

PEG 4000, umumnya menggunakan metode peleburan, karena lebih mudah

(Leuner and Dressman, 2000).

Dalam pemakaiannya poliettilen glikol (PEG) memiliki beberapa

karakteristik diantaranya memiliki titik lebur 40 oC, lambat dalam proses

pelelehan dan peleburan zat aktif. Selain itu dapat dilakukan kombinasi PEG

untuk mendapatkan basis yang sesuai karena PEG memiliki viskositas yang

tinggi. Namun PEG memiliki beberapa kelemahan yakni inkompatibilitas dengan

garam bismuth, tannin, fenol, mengurangi aktivitas antimikroba, dan melarutkan

beberapa plastik. PEG dengan berat molekul (BM) yang tinggi menyebabkan

pelepasan zat aktif rendah (Anonim, 1979).

2.6. Media MRS (de Man, Rogosa Sharpe)

Media MRS adalah suatu media agar yang beguna untuk pertumbuhan

bakteri. Salah satu bakteri yang dapat hidup dalam media ini yaitu Lactobaccilus

sp. . Bakteri Lactobaccilus sp. dapat hidup dan berkembang dengan baik pada

suhu 15o C dan membutuhkan nutrisi seperti riboflavin, asam folat, kalsium

pantotenat, dan faktor pertumbuhan lain (Engelkirk, 1992). Komposisi MRS

terlampir di Lampiran 4.

2.7. Uji Stabilitas

Pentingnya uji stabilitas pada pengembangan bentuk sediaan farmasi

telah diakui dalam industri farmasi. Lachman menyatakan penerapan prinsip

9

fisika kimia tertentu pada pelaksanaan pengkajian stabilitas telah terbukti sangat

menguntungkan perkembangan kestabilan sediaan. Hanya pendekatan itu yang

memungkinkan pemanfaatan data yang diperoleh dari penyimpanan dalam kondisi

yang melebihi keadaan normal, tepat dan memadai. Untuk maksud meramalkan

stabilitas pada penyimpanan normal pada jangka waktu lama, sangat penting bagi

produsen farmasi untuk meramalkan dengan tepat stabilitas produk baru pada

penyimpanan normal dari data penyimpanan data dipercepat, karena keuntungan

ekonomis besar yang diperoleh dari pemasaran produk baru secepat mungkin

setelah formulasinya selesai (Lachman, 2004).

Uji stabilitas dipercepat, dapat memberikan praduga tentang kestabilan

suatu produk, dikembangkan mengingat siklus pengembangan produk obat yang

relatif sangat singkat. Suatu pelaksanaan yang praktis yaitu dengan menerima

suatu dengan yang monitoring secara periodik terhadap produk yang ada di

contoh pertinggal yang disimpan pada suhu kamar. Hasil pengamatan dapat

digunakan guna memperbaiki kualitas produk dan dalam menaikkan ketepatan

metoda yang digunakan untuk pengujian stabilitas (Lachman, 2004)

BAB IIIBAHAN DAN METODE

10

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan selama 3 bulan dari bulan Januari sampai bulan

Maret 2013 di Laboratorium Farmasi Universitas Pakuan di Bogor dan

Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu

Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor di Bogor.

3.2 Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan adalah biakan dari bakteri Lactobaccilus sp.

yang didapat dari Laboratorium Mikrobiologi IPB, PEG 400, PEG 4000,

Metronidazol, asam asetat anhidrat, asam perklorat, asam asetat glasial, larutan

buffer fosfat, dan media agar MRS (de Man, Rogosa, dan Sharpe).

Alat yang digunakan adalah timbangan analitik, gelas piala, spatula,

pengaduk kaca, thermometer, cetakan ovula, lemari pendingin , penangas air, pH

meter, disintegration tester, alat uji waktu hancur, disolusi tester, buret,

erlemeyer, cawan petri dan alat-alat lain yang lazim digunakan di laboratorium

kimia.

3.3 Metode Penelitian

Lingkup penelitian meliputi pengumpulan dan penyediaan bahan,

determinasi bakteri, pembuatan ovula, formulasi sediaan ovula, pembuatan ovula

kombinasi Lactobaccilus sp. -Metronidazol dengan basis PEG (Polietilen glikol)

400 dan 4000, evaluasi sediaan ovula. Skema Penelitian terdapat di Lampiran 1.

3.3.1. Isolasi, Identifikasi, dan Pemurnian Bakteri

Bakteri Lactobaccilus sp. diisolasi dari Yakult dengan metode

pengenceran menggunakan media MRS. Bakteri diisolasi dan diinkubasi pada

suhu 37oC selama 2x24 jam dan dipertahankan kehidupannya pada suhu 2oC pada

media MRS (Nighswonger, Brashears et al. 1996).

Pada tahap pemurnian bakteri, satu koloni yang terlihat terdiri dari satu

sel dipilih, kemudian jarum ose dibakar dan setelah dingin ose disentuhkan ke

11

permukaan koloni bakteri yang digoreskan (streak) pada plat MRS. Goresan ini

merupakan goresan primer pada plat MRS. Jarum ose dibakar, angkat lalu

didinginkan dan digoreskan melewati goresan primer dan dilanjutkan dengan

goresan sekunder tanpa kembali ke goresan primer. Kemudian diulangi untuk

goresan tersier tanpa kembali ke goresan sekunder dan primer.

Proses identifikasi dilakukan dengan teknik pewarnaan gram. Pewarnaan

Gram menurut Hadioetomo, 1985, preparat ulas dibuat pada gelas benda,

kemudian difiksasi di atas api Bunsen. Preparat ditetesi dengan larutan Kristal

ungu, didiamkan selama 60 detik dan dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan.

Preparat ditetesi dengan larutan iodin dan didiamkan selama 2 menit, dicuci

dengan air mengalir dan dikeringkan. Preparat ditetesi dengan alkohol 96%

sampai warna ungu hilang. Preparat ditetesi dengan safranin dan didiamkan

selama 30 detik, dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Preparat ditetesi

dengan minyak imersi, dan kemudian preparat diamati dengan mikroskop, jika sel

bewarna ungu berarti positif terhadap sel Lactobaccilus sp. .

3.3.2. Pembuatan Konsentrasi Lactobaccilus sp. (Kaewnopparat, Sanae and

Nattha, 2009)

Konsentrasi Lactobaccilus sp. yang diperlukan dalam penelitian ini

adalah 108 CFU (Coloni Factory Unit). Konsentrasi tersebut didapat dengan cara

pengenceran sampai 108 dari isolat bakteri murni. Pengenceran yang dibuat

dibandingkan dengan metode kekeruhan Mc Farland. Standar Mc Farland 0,5 ml

setara dengan suspensi bakteri yang mengandung 1x108 dan 2x108 CFU/ml.

Standar 0,5 Mc Farland dibuat dengan 0,5 ml BaCl2 dengan konsentrasi 0,048

mol/liter (1,175% b/v BaCl2 . 2H2O) dan 99,5% H2SO4 0,18mol/liter (1% v/v)

dengan pengadukan yang konstan untuk mempertahankan suspensi. Kepadatan

suspensi diukur absorbansi pada spektrofotometer dengan absorbansi 625 nm.

Kekeruhan suspensi Mc Farland 0,5 harus menunjukkan nilai absorban 0,08-0,13.

Kemudian suspensi Mc Farland ditransferkan 4-6 ml ke tabung dengan ukuran

yang sama yang digunakan dalam standarisasi inokulum bakteri. Kemudian

12

tabung ditutup dan disimpan dalam wadah tertutup sinar matahari (gelap) pada

suhu kamar. Tabel Standar Mc Farland terdapat di Lampiran 4.

3.3.3. Formula dan Prosedur Pembuatan Ovula Lactobaccilus sp. -

Metronidazol

Setiap Formula yang dibuat sebanyak 12 ovula dengan masing-masing

ovula mempunyai bobot 3000 mg. Basis ovula yang digunakan adalah PEG 400

dan PEG 4000 dengan perbandingan 1:1 (Kaewnopparat, 2009). Formulasi ovula

yang dibuat Lactobaccilus sp. -Metronidazol tampak di Tabel 1.

Sediaan ovula kombinasi Lactobaccilus sp. -Metronidazol dibuat

sebanyak 12 ovula masing-masing seberat 3 gram. Sediaan ovula ini dibuat dalam

4 formula dengan perbedaan konsentrasi Lactobaccilus sp. dan dosis

Metronidazol yang digunakan. Pada Formula I, tidak menggunakan Lactobaccilus

sp. dan Metronidazol atau yang disebut dengan plasebo. Formula II,

menggunakan dosis Metronidazol 500 mg tanpa menggunakan Lactobaccilus sp. .

Formula III, menggunakan konsentrasi Lactobaccilus sp. 108 CFU tanpa

menggunakan Metronidazol. Formula IV, menggunakan konsentrasi

Lactobaccilus sp. 108 CFU dan dosis Metronidazol 500 mg. Formula I – Formula

IV dibuat dengan menggunakan metode pembuatan ovula konvensional,

sedangkan Formula V dibuat dengan menggunakan metode pembuatan ovula

berongga.

Bahan Formula I Formula II Formula III Formula IV &

Formula VLactobaccilus sp.

0 mg 0 mg 108 CFU 108 CFU

Metronidazol 0 mg 500 mg 0 mg 500 mgPEG 400 1 bagian 1 bagian 1 bagian 1 bagianPEG 4000 1 bagian 1 bagian 1 bagian 1 bagianTotal 3000 mg 3000 mg 3000 mg 3000 mg

Formulasi Ovula Lactobaccilus sp. –Metronidazol

Pembuatan Ovula Konvensional

13

Basis ovula dilebur pada suhu 70o C dan kemudian Lactobaccilus sp. -

Metronidazol dicampur bersama dengan basis pada suhu 40o – 45oC. Setelah

bercampur homogen, campuran dituangkan ke dalam cetakan dan dimasukkan ke

dalam lemari pendingin bersuhu 2o-8o C sampai membeku. Setelah membeku,

ovula dikeluarkan dari cetakan dan dikemas dengan menggunakan aluminium foil.

Pembuatan Ovula Berongga

Ovula tipe berongga dibuat dengan cara meleburkan basis pada suhu 70o

C kemudian dicetak dalam cetakan berongga, setelah basis dalam keadaan

setengah padat yakni pada suhu 40o – 60o C lalu Lactobaccilus sp. -Metronidazol

dimasukkan ke dalam cetakan berongga. Kemudian dimasukkan ke dalam lemari

pendingin bersuhu 2o-8o C sampai membeku. Setelah membeku, ovula dikeluarkan

dari cetakan dan dikemas dengan menggunakan aluminium foil. Alur pembuatan

ovula terdapat di Lampiran 2.

Basis + Lactobaccilus sp.-Metronidazol Basis ovula

Lactobaccilus sp.- Metronidazol

(A) (B)

Gambar 3. Skema ilustrasi dari ovula konvensional (A) danovula tipe berongga (B).

Sumber : Kaewnopparat, 2009

3.3.4. Evaluasi Mutu Sediaan Ovula Lactobaccilus sp. -Metronidazol

Evaluasi mutu sediaan ovula meliputi uji organoleptik, uji kesetaraan

bobot, uji waktu hancur, uji kestabilan sediaan, uji kadar metronidazol, dan uji

kelangsungan hidup mikroorganisme Lactobaccilus sp. dalam sediaan, dan uji

stabilitas sediaan.

a) Uji Organoleptik

14

Pada uji organoleptik sediaan yang diamati meliputi bau, warna, dan

bentuk dari ovula Lactobaccilus sp. -Metronidazol.

b) Uji Keseragaman Bobot

Uji kesetaraan bobot ovula dilakukan dengan cara menimbang masing-

masing ovula untuk setiap formula, dilakukan secara duplo. Berat dari ovula tidak

boleh kurang dan tidak lebih dari 3000 mg ± 7,5 %, jadi tidak kurang dari 2775

mg dan tidak lebih dari 3225 mg (Anonim, 1995)

c) Uji Waktu Hancur

Uji waktu hancur ovula dilakukan dengan prosedur meletakkan enam

ovula pada alat disintegration tester dalam wadah berisi 500 ml air yang bersuhu

36-37 oC, kemudian mesin dihidupkan dan alat akan naik turun sampai seluruh

ovula melebur sempurna. Ovula dinyatakan hancur sempurna bila terlarut

sempurna atau terdispersi menjadi komponen, bagian basis akan terlarut dalam

medium air, karena PEG yang larut dalam air, bagian serbuk yang tidak larut

berada di dasar atau terlarut atau menjadi lunak. Waktu yang diperlukan untuk

menghancurkan ovula tidak lebih dari 60 menit untuk ovula dengan dasar yang

larut dalam air (Anonim, 1979).

d) Penetapan Kadar Metronidazol (Anonim, 1979)

Penetapan kadar dilakukan dengan cara menimbang saksama sejumlah

suppositoria metronidazol yang setara dengan 200 mg metronidazol, kemudian

disari sebanyak 6 (enam) kali, tiap kali dengan 10 ml aseton P panas,

dikumpulkan sari, dan didinginkan. Ditambahkan pada kumpulan sari 50 ml asetat

anhidrat P, kemudian dititrasi dengan asam perklorat 0,1 N menggunakan

indikator 2 (dua) tetes larutan hijau berlian P 1 % b/v dalam asam asetat glasial P

hingga warna kekuningan. Dilakukan penetapan blangko.

1 ml asam perklorat 0,1 N setara dengan 17,12 mg C6H9N3O3

e) Uji Kelangsungan Hidup Lactobaccilus sp.

Uji kelangsungan hidup mikroorganisme Lactobaccilus sp. dilakukan

dengan cara melarutkan ovula Lactobaccilus sp. -Metronidazol ke dalam medium

disolusi dengan menggunakan kecepatan 100±1 rpm dan temperature 37±0,5 oC.

Medium disolusi yang digunakan adalah asam sitrat atau larutan buffer fosfat

15

dengan pH larutan 4,4. Larutan hasil disolusi diambil sebanyak 4 ml dicampurkan

dengan media agar MRS pada cawan petri dan diinkubasi pada kondisi anaerob

suhu 37 oC selama 48 jam. Setelah 48 jam dilihat apakah masih ada

mikroorganisme Lactobaccilus sp. yang hidup ( Kaewnopparat et al, 2009).

f) Uji Stabilitas

Uji stabilitas ovula Lactobaccilus sp. -Metronidazol dilakukan pada

penyimpanan pada suhu sejuk 5-15 oC dan suhu kamar 25-30 oC selama 2 (dua)

bulan. Evaluasi yang dilakukan meliputi penampilan, bobot ovula, waktu hancur,

dan kehidupan Lactobaccilus sp. . Evaluasi penampilan, bobot ovula dan waktu

hancur dilakukan setiap 2 (dua) minggu sekali selama 2 (dua) bulan. Evaluasi

kadar metronidazol dilakukan pada evaluasi pada awal pembuatan. Evaluasi

kelangsungan hidup Lactobaccilus sp. dilakukan setiap 1 (satu) bulan sekali

selama 2 (dua) bulan (Kaewnopparat et al., 2009). Uji stabilitas terdapat pada

Lampiran 3.

BAB IV

16

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Isolasi, Identifikasi dan Pemurnian Bakteri

Berdasarkan hasil analisis dari Laboratorium Mikrobiologi, Depertemen

Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB Bogor,

menerangkan bahwa bakteri yang diisolasi, diidentifikasi dan dilakukan

pemurnian bakteri Lactobaccilus sp. sp. (terlampir di Lampiran 5). Hasil

menunjukkan bahwa bakteri yang diisolasi dan diidentifikasi memiliki lapisan

peptoglikan yang tebal, karena ketika diberi pewarna pembanding yaitu safranin

tidak berubah warna, Lactobaccilus sp. tetap bewarna ungu (warna utama).

Safranin dan alkohol pada proses identifikasi berfungsi sebagai peluntur lemak

pada dinding sel, karena Lactobaccilus sp. memiliki komposisi peptoglikan yang

tebal pada dinding sel pada menyusut oleh perlakuan alkohol karena terjadinya

dehidrasi, menyebabkan pori-pori dinding sel menutup sehingga mencegah

larutnya kompleks ungu Kristal-iodium pada langkah pemucatan. Bakteri

Lactobaccilus sp. termasuk dalam kelompok bakteri asam laktat gram positif

yang menguntungkan.

Bakteri asam laktat didefenisikan sebagai kelompok bakteri yang

membentuk asam laktat, baik sebagai satu-satunya produk maupun sebagai

produk utama pada metabolisme karbohidrat. Beberapa ciri yang dimiliki oleh

bakteri asam laktat adalah termasuk dalam bakteri Gram positif (Stamer, 1979),

tidak membentuk spora, berbentuk bulat atau batang dan pada umumnya tidak

memiliki katalase (Hasan, 2006). Ciri ini juga tampak dari hasil identifikasi

Lactobaccilus sp. . Bakteri ini tidak memiliki enzim katalase, karena enzim

katalase mengubah hidrogen peroksida yang diproduksi oleh bakteri menjadi air

dan oksigen. Bakteri Lactobaccilus sp. merupakan bakteri anaerob, artinya

bakteri tumbuh tanpa oksigen. Hidrogen peroksida dapat membunuh kuman-

kuman yang merugikan bagi tubuh.

17

4.2. Hasil Pengujian Organoleptik Sediaan Ovula Setelah Pembuatan dan Selama dilakukan Uji Stabilitas

Sediaan ovula dibuat dengan menggunakan cetakan suppositoria, maka

sediaan yang dihasilkan memiliki bentuk seperti suppositoria. Akan tetapi, disebut

ovula karena penggunaan sediaan ini untuk vagina. Sediaan ovula yang dihasilkan

memiliki bentuk dan warna yang seragam. Pada Formula I sampai Formula IV

yang dibuat dengan metode ovula konvensional memiliki bentuk torpedo, warna

putih dan tidak berbau. Formula I tidak berbeda bentuk, warna dan bau dengan

Formula II, Formula III dan Formula IV, hal ini dikarenakan zat aktif dalam

formula menyatu rata ke dalam basis, sehingga yang terlihat hanya warna putih

dari basis, dan juga tidak memiliki bau, karena zat aktif yang berbau seperti

Lactobaccilus sp. tertutup oleh basis yang tidak berbau. Pada Formula V yang

dibuat dengan metode ovula berongga, meskipun komposisi Formula V sama

dengan Formula IV, namun Formula V memiliki organoleptik yang sedikit

berbeda dengan Formula IV. Formula V memiliki bentuk torpedo, warna sedikit

kecoklatan, dan berbau khas. Bau yang tercium seperti bau dari suspensi

Lactobaccilus sp. yang berbau sedikit asam. Adanya perbedaan yang terjadi

dikarenakan oleh Lactobaccilus sp. yang ada di dalam rongga ovula berongga

sedikit terlihat sehingga bau khas dari Lactobaccilus sp. yang sedikit asam juga

ikut tercium. Kesulitan dalam pembuataan ovula ini adalah pada saat

mencampurkan suspensi Lactobaccilus sp. ke dalam basis, karena Lactobaccilus

sp. merupakan bakteri anaerob yang harus dengan segera diproses agar tidak

mati dalam udara yang beroksigen. Kesulitan lain dalam pembuatan adalah pada

pembuatan ovula berongga dimana harus dibuat rongga untuk memasukkan zat

aktif ke dalam basis. Gambar bentuk ovula dapat dilihat pada Lampiran 7.

Sediaan ovula dikemas dalam aluminium foil. Pengujian organoleptik

sediaan dilakukan setiap 2 minggu selama 8 minggu pada suhu sejuk (5 -15 °C)

dan suhu kamar (25-30 °C) meliputi bentuk, warna dan bau sediaan. Hasil

pengujian stabilitas pada suhu sejuk (5-15 °C) dan suhu kamar (25-30 °C)

menunjukkan semua formula tidak mengalami perubahan bentuk, warna dan bau.

Hasil ini terlihat pada Ovula Konvensial maupun Ovula Tipe Berongga. Hal ini

18

dikarenakan ovula dikemas dalam aluminium foil sehingga terlindung dari cahaya

dan udara luar sehingga ovula tidak teroksidasi.

4.3. Hasil Pengujian Keseragaman Bobot Sediaan Ovula Setelah Pembuatan dan Selama dilakukan Uji Stabilitas

Uji keseragaman bobot dilakukan setiap 2 minggu sekali sampai waktu 8

minggu. Bobot ovula yang diinginkan seberat 3 gram per ovula. Bobot ini

diharapkan tetap stabil selama penyimpanan 8 minggu. Pada Formula I bobot rata-

rata yang didapat selama penyimpanan 8 minggu adalah 3,038 mg dengan kisaran

bobot pada Formula I berkisar 3,01-3,12 gram. Pada Formula II memiliki kisaran

bobot berkisar antara 2,99-3,10 gram dengan bobot rata-rata yang didapat 3,014

gram. Pada Formula III memiliki kisaran bobot antara 2,98-3,13 gram. Bobot rata-

rata yang didapat untuk Formula III selama pengujian stabilita adalah 3,058 gram.

Formula IV memiliki kisaran bobot 2,99-3,14 gram, dengan bobot rata-rata

sebesar 3,032 gram.

Menurut hasil pengujian keseragaman bobot yang dihasilkan dari Formula

I sampai Formula IV memiliki bobot yang relatif stabil dan dan tidak

menyimpang jauh dengan bobot yang diinginkan. Penyimpangan bobot dari bobot

yang diinginkan tidak melebihi 5% (Anonim, 1995), persentase penyimpangan

bobot yang didapat dari Formula I sampai Formula IV tidak lebih dari 5% baik

pada penyimpanan suhu sejuk maupun penyimpanan suhu kamar. Bobot yang

dihasilkan dari Formula V yang memiliki komposisi sama seperti Formula IV,

tapi berbeda dalam metode pembuatan ini memiliki kisaran bobot antara 2,97-3,06

gram dengan bobot rata-rata 3,032 gram. Persentase penurunan bobot dari bobot

yang diharapkan juga tidak lebih dari 5 %. Jika dibandingkan dengan Formula IV,

Formula V tidak memiliki bobot yang tidak jauh berbeda, dan relatif stabil pada

penyimpanan suhu sejuk maupun suhu kamar. Grafik keseragaman bobot selama

penyimpanan 8 minggu dapat dilihat pada grafik di bawah ini.

19

Gambar 4. Grafik Hasil Uji Keseragaman BobotKet. A : Penyimpanan Suhu Sejuk

B : Penyimpanan Suhu Kamar

Berdasarkan grafik di atas dapat dilihat, bobot awal minggu ke-0 sampai

ke bobot akhir minggu ke-8 mempunyai bobot yang stabil pada penyimpanan

suhu sejuk (5-15 °C) dan suhu kamar (25-30 °C). Ovula yang baik seharusnya

memiliki bobot yang stabil selama dilakukan pengujian stabilitas. Bobot ovula

yang dihasilkan harus memenuhi persyaratan sesuai dengan Farmakope Indonesia.

Persyaratan bobot ovula dalam Farmakope Indonesia 2775-3225 mg, hasil bobot

ovula yang didapat masuk ke dalam persyaratan FI IV. Tabel hasil pengujian

keseragaman bobot terlampir di Lampiran 8.

4.4. Hasil Pengujian Waktu Hancur Sediaan Ovula Setelah Pembuatan dan Selama dilakukan Uji Stabilitas

Uji waktu hancur dilakukan setiap 2 minggu sekali selama 8 minggu.

Pengujian waktu hancur dilakukan dengan tujuan untuk memperkirakan waktu

hancur sediaan di tempat pemberiannya. Pengujian waktu hancur sediaan dengan

menggunakan alat disintegration tester pada suhu 36-37 oC, digunakan suhu

tersebut karena pada suhu yang demikian sesuai dengan suhu tempat ovula akan

hancur.

20

Menurut hasil pengujian waktu hancur yang didapat, Formula I memiliki

kisaran waktu hancur antara 16-23 menit, baik pada penyimpanan suhu sejuk

maupun suhu kamar. Rata-rata waktu hancur untuk Formula I 18 menit. Formula

II pada penyimpanan suhu sejuk memiliki kisaran waktu hancur 18-23 menit

sedangkan untuk waktu hancur pada penyimpanan suhu kamar memiliki kisaran

waktu 16-18 menit. Waktu hancur untuk penyimpanan suhu kamar lebih cepat

daripada suhu sejuk, dikarenakan sediaan pada suhu sejuk memiliki tekstur seperti

es, sehingga memerlukan waktu lebih lama untuk menstabilkan suhu dengan suhu

lingkungan pada media. Formula III pada penyimpanan suhu sejuk memiliki

kisaran waktu hancur 18-23 menit dan kisaran waktu hancur pada penyimpanan

suhu kamar berkisar 15-17 menit. Untuk formula IV memiliki kisaran waktu

hancur 19-24 menit untuk penyimpanan suhu sejuk dan 16-19 menit untuk

sediaan pada penyimpanan suhu kamar. Pada Formula V dengan komposisi sama

seperti Formula IV berbeda dalam metode pembuatan memiliki kisaran waktu

hancur 17-19 menit untuk sediaan pada penyimpanan suhu sejuk maupun suhu

kamar. Sediaan Formula V lebih cepat hancur disbanding dengan Formula IV,

dikarenakan sediaan pada Formula V bertekstur lebih lembut karena rongga yang

diisi oleh Lactobaccilus sp. . Hasil uji waktu hancur terlampir di Lampiran 9.

Sediaan ovula yang berbasis PEG merupakan polimerisasi etilen glikol

dengan berat molekul 300-6000. PEG dengan berat molekul dibawah 1000

berbentuk cair sedangkan diatas 1000 bertekstur padat lunak seperti malam. Ovula

berbahan dasar PEG mudah larut dalam cairan dalam rectum, dan tidak ada

modifikasi titik lebur yang berarti mudah meleleh pada penyimpanan suhu kamar

(Syamsuni, 2006). Waktu maksimal yang diperlukan untuk menghancurkan

suppositoria tidak lebih dari 60 menit untuk suppositoria yang larut dalam air.

(Depkes, 1995). PEG larut dalam air, sehingga waktu hancur yang diperoleh dari

sediaan ovula berbasis PEG memenuhi persyaratan. Grafik waktu hancur ovula

dapat dilihat pada grafik dibawah ini.

21

Gambar 5. Grafik Hasil Uji Waktu HancurKet. : A : Suhu Sejuk 5-15 °C

B : Suhu Kamar 25-30 °C

4.5. Hasil Analisis Kadar Metronidazol

Penentuan kadar metronidazol dilakukan pada waktu awal evaluasi. Dari

hasil evaluasi dengan asam perklorat yang digunakan sebagai penitrasi hasil titik

akhir bewarna kuning. Pada penentuan kadar untuk Formula II yang mengandung

zat aktif Metronidazol 500 mg dan basis ovula didapatkan kadar Metronidazol

dalam Formula II adalah 94,16%. Pada Formula IV dengan kandungan zat aktif

Metronidazol 500 mg yang dikombinasikan dengan Lactobaccilus sp. 108 CFU,

kandungan kadar Metronidazol dalam Formula IV adalah 85,06%. Kandungan

Metronidazol pada Formula V yang berbeda metode pembuatan ini menghasilkan

% kadar Metronidazol adalah 85,06%. Formula II yang hanya mengandung

Metronidazol dan basis ovula memiliki kadar lebih tinggi dibandingkan dengan

ovula dengan komposisi Metronidazol yang dikombinasi dengan Lactobaccilus

sp. . Kadar yang dianalisis dari sediaan setara dengan 200 mg Metronidazol, hasil

analisis yang didapat memiliki kisaran persentase kadar 85,06% - 94,16%.

Metronidazol merupakan antibiotik bakterisidal diaktifkan oleh anaerob dan

22

berefek menghambat sintesis DNA. Jadi dengan adanya Lactobaccilus sp.

sebagai bakteri anaerob, Metronidazol dapat menghambat sintesis DNA bakteri

patogen.

4.6. Hasil Evaluasi Uji Kelangsungan Hidup Lactobaccilus sp.

Evaluasi uji kehidupan Lactobaccilus sp. dilakukan pada minggu ke-0,

minggu ke-4, dan minggu ke-8. Pengujian hanya dilakukan pada Formula yang

mengandung Lactobaccilus sp. saja yaitu Formula III, Formula IV, dan Formula

V. Formula III pada penyimpanan suhu sejuk, kelangsungan hidup Lactobaccilus

sp. lebih tinggi dibandingkan dengan penyimpanan suhu kamar, dikarenakan

Lactobaccilus sp. pada suhu penyimpanan 5-15 °C lebih terjaga stabil. Formula

IV memiliki tingkat kelangsungan hidup Lactobaccilus sp. lebih rendah

dibandingkan dengan Formula V yang dibuat dengan metode ovula berongga.

Hasil kelangsungan hidup Lactobaccilus sp. terdapat di Lampiran 9. Grafik hasil

uji kelangsungan hidup Lactobaccilus sp. dapat dilihat di bawah ini.

Gambar 6. Grafik Kelangsungan Hidup Lactobaccilus sp. Ket. : A : Suhu Sejuk 5-15 °C

B : Suhu Kamar 25-30 °C

23

Dari grafik di atas dapat dilihat bahwa kelangsungan Lactobaccilus sp.

menurun pada lama penyimpanan minggu ke-4, terlihat dari Formula III, Formula

IV, maupun Formula V baik pada penyimpanan suhu sejuk maupun suhu kamar.

Hal ini dikarenakan suhu kisaran suhu pertumbuhan optimum pada suhu termofil,

yaitu suhu 25–55 oC. Lactobaccilus sp. termasuk bakteri termofil, sehingga

bakteri masih dapat terdeteksi pada penyimpanan suhu kamar. Temperatur di

bawah suhu optimum pertumbuhan, dapat menekan laju metabolisme, dan apabila

suhu terlalu rendah, maka metabolisme serta pertumbuhan akan terhenti. Suhu

rendah sangat bermanfaat untuk mengawetkan biakan karena mikroorganisme

mempunyai kemampuan yang unik untuk dapat bertahan hidup pada keadaan

yang sangat dingin. Lactobaccilus sp. dapat tetap hidup selama berbulan-bulan

pada temperatur 2-8 oC, karena pada suhu beku ini bakteri dianggap dorman

karena tidak memperlihatkan adanya aktivitas metabolik yang terdeteksi, atau

dengan kata lain bakteri menjadi inaktiv. Maka untuk pengawetan bakteri dapat

digunakan penyimpanan pada suhu beku (Pelczar, 1986). Akan tetapi pada lama

penyimpanan 4 minggu, Lactobaccilus sp. dalam sediaan populasinya menurun,

hal ini dikarenakan bakteri mati lebih cepat daripada terbentuknya bakteri baru.

Faktor penyebabnya antara lain berkurangnya nutrisi untuk melangsungkan

metabolisme, akumulasi produk metabolisme yang mungkin bersifat asam atau

basa yang toksik.

24

BAB VPENUTUP

5.1 Kesimpulan

1. Lactobaccilus sp. dengan konsentrasi 108CFU dapat diformulasikan

sebagai bahan probiotik dalam bentuk kombinasi ovula Lactobaccilus

sp. -Metronidazol.

2. Sediaan ovula Lactobaccilus sp. -Metronidazol stabil pada suhu sejuk

(5-15 °C) dan suhu kamar (25-30 oC) selama penyimpanan 2 bulan (8

minggu).

3. Lactobaccilus sp. sp. Masih dapat terdeteksi dalam sediaan ovula

Lactobaccilus sp. -Metronidazol selama pengujian 2 bulan (8 minggu).

5.2 Saran

Dalam penggunaannya ovula perlu disimpan pada suhu 2-8 oC, mengingat

pada suhu tersebut dapat digunakan untuk pengawetan bakteri, sehingga bakteri

dapat hidup lebih lama.

25

DAFTAR PUSTAKA

Anief. 2006. Ilmu Meracik Obat. Universitas Gajah Mada Press Yogyakarta.

Anonim. 1978. Formularium Nasional edisi II. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Jakarta.

______. 1979. Farmakope Indonesia edisi III. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Jakarta.

______. 1995. Farmakope Indonesia edisi IV. Departemen Kesehatan Republik Indonesia Jakarta.

______.2009.http://pustaka.unpad.ac.id/wpcontent/uploads/2009/12/anatomi_dan_fisiologi_alat_reproduksi_wanita.pdf. Diakses 28 Februari 2013

______.2010.online.http://iheartfoods.wordpress.com/2010/06/23/lactobacillus/D akses 28 Februari 2013

______. 2012. Panduan Skripsi Program Studi Farmasi FMIPA-UNPAK. Bogor.

Ansel. 2005. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi.  Universitas Indonesia Press Jakarta.

Aroutcheva, A., D. Gariti, et al. 2001. Defense factors of vaginal lactobacilli. American Journal of Obstetrics and Gynecology 1852: 375-379.

Beigi, R., M. Austin, et al. 2004. Antimicrobial resistance associated with the treatment of bacterial vaginosis. American journal of obstetrics and gynecology 1914: 1124-1129.

Bhalla, P. C., R. Garg,S. 2007. Prevalence of bacterial vaginosis among women in Delhi, India. Indian J Med Res 125February: 167-172.

Donati, L., A. Di Vico, et al. 2010. Vaginal microbial flora and outcome of pregnancy. Archives of Gynecology and Obstetrics 2814: 589-600.

Engelkirk, P. G., Duben-Engelkirk, J. and Dowell, V. R.  1992.  Principles and Practices of Clinical Anaerobic Bacteriology. Star Publishing Co., Belmont, CA 94002.

Hasan, Z.H. 2006. Isolasi Lactobacillus, Bakteri Asam Laktat dari Feses dan Organ Saluran Pencernaan Ayam. Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2006. 

26

Fontaine, E. A. and D. Taylor-Robinson 1990. Comparison of quantitative and qualitative methods of detecting hydrogen peroxide produced by human vaginal strains of lactobacilli. Journal of Applied Bacteriology 693: 326-331.

Kaewnopparat, Sanae and Nattha. 2009. Formulation and Evaluation of Vaginal Suppositories Containing Lactobacillus. World Academy of Science, Engineering and Technologi

Kale, V. V., R. V. Trivedi, et al. 2005. Development and Evaluation of a Suppository Formulation Containing Lactobacillus and Its Application in Vaginal Diseases, Annals. New York Academy of Sciences. 1056: 359-365.

Launer and Dressman. 2000. Teori Dan Praktek Farmasi Industri. Universitas Indonesia Press. Jakarta.

Lachman, L., Lieberman, H. A dan Kanigh, J.L. 2004. Teori dan Praktek Farmasi Industri. Vol II. Edisi III. Terjemahan Siti Suyatmi. Universitas Indonesia. Jakarta.

Nalam, Prathima C.; Clasohm, Jarred N.; Mashaghi, Alireza; Spencer, Nicholas D. 2009. Macrotribological Studies of PolyL-lysine-graft-Polyethylene glycol in Aqueous Glycerol Mixtures. Tribology Letters 37 3: 541. doi:10.1007/s11249-009-9549-9

Nighswonger, B. D., M. M. Brashears, et al. 1996. Viability of Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei in Fermented Milk Products During Refrigerated Storage. J. Dairy Sci. 792: 212-219.

Pelczar, M.J., Chan, E.C.S. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi jilid 1. Universitas Indonesia, Jakarta.

Petrova, P., K. Petrov, et al. 2007. Probiotic properties of Bulgarian vaginal lactobacillus isolates. Comptes Rendus de L'Academie Bulgare des Sciences 608: 871-878.

Stamer,J.R. 1979. The Lactic Acid Bacteria. Microbes of Diversity. J. Food Technol.

Syamsuni, A. 2006. Ilmu Resep. Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.Warren, R., A. Bauer, et al. 2005. Journal of Transepidermal water loss dynamics

of human vulvar and thigh skin. Skin Pharmacology and Physiology 183: 139-143

27