PROFIL PROTEIN INTERLEUKIN.S (IL-8) PADA SERUM DARAHDAN SUSU SAPI PERAH MASTITIS

PUGUH SURJOWARDOJOI, SUYADII, LUQMAN HAKIMI DANAULANNI'AM2'I) '"Tl*i;:*ltffi;?ffi,T*'ffi llH*Tirwijava

Jl. Veteran Malang 65145

ABSTRAK

Mastitis subklinis merupakan tipe mastitis yang sulit didetelrsi peternak sapiperah, karena gejalanya tidak dapat diketahui secqra visual. Metode CMT

diperlukan sebagai suatu metode deteksi mastitis subklinis yang sampai saat ini

dianggap secl.erhana dan cepat. Nemun, metode tersebut kurang sensitive dalammenentukan tingkat keparahan mastitis subklinis, sehingga perlu dilakukanpenelitian lanjutan secara molekuler. IL-8 merupakan salah satu marka molekulyang esensiil dalam proses eliminasi pathogen mastitis, karena IL-8 mampu

mengakti/kan dan menimbulkan migrasi neutrofl ke area infel<si untuk proses

pemusnahan pathogen. Hal ini berkaitan dengan fungsi IL-8 dalam sel sebagaikemoatraktan dan activator utama neutrofil. Penelitian ini bertujuan untuk melihatprofil protein IL-8 pada sapi perah mastitis subklinis dan keterkaitannya antarakonsentrasi IL-8 dengan mastitis.

Materi yang digunakan adalah sampel darah dqn susu. Pada penelitian ini

sampel diperolch duri 30 ekor sapi perah FH (120 puting) milik KUTT Suka Makmur

Kecamatan Grati Kabupaten Pasuruan. Metode penelitian yang digunakan adalah

studi kasus. Adapun variabel yang diamati yaitu profil protein ll-8nya melalui

SDS-PAGE dan konfirmasi keberadaan IL-8 melalui metode imunohistokimia pada

pulasan darah. Sedangkan untukmenentukan konsentrasi IL-8 dilakukanperhitunganabsorbansi ikatan kompleks IL-8 dan anti IL-8 secnrQ ELISA pada paniang

gelombang 450 nm. Data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif.Hasil penelitian menunjukkan bahwa' dari 30 ekor sapi sampel terdapat 13

ekor (52 puting) yang dapat dinyatokan normal berdasarkan CMT (Skor nol) dan

sisanya mengalami sapi mastitis subklinis dengan skor CMT I-4. Selanjutnya,pengamatan terhadap profil protein IL-8 menuniukkan bahwa IL-8 merupakan

protein dengan berat molekul 8,5 kDa yang muncul di semua skor CMT. Konsentrasi

IL-8 memiliki korelasi positif terhadap skor mastitis dengan koefisien tJelerminasi

sebesar gg,sok. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa semakin tinggi tingkal

mastitis maka konsentrasi IL-8 semakin meningkat (JIIPB 2008 Vol 18 No 1 :

36-s0).

Kata kunci: Mastitis, IL-8, skor CMT dan sapiperah

36

PROFTLE OF TNTERLEUKTN 8 (rL-8) PROTETN ON BLOOD SERUM ANDMILK OF MASTITIS DAIRY COWS

PUGUH SURJOWARDOJOI, SUYADII, LUQMAN HAKIM' ANDAULANNI'AM2

l) Department of Animal Production, Faculty of Animal Husbandry Brawijaya University2) Chemistry Department, Faculty of Sciences and Mathematics, Brawijaya University

Jl. Veteran Malane 65145

ABSTRACT

Subclinical mastitis is a kind of mastitis which is dfficult to oe detected byfarmer, because the symptom cqn't be visually observed. One detection method ofsubclinical mastitis which is known to be simple and quick is CMT method. But, thisntelhod is poorly sensitive in deciding the severity of subclinical mastiris, so it needsa further molecular research. IL-S is a one of essential molecular marker in mastitispathogen elimination process because IL-8 can activate and migrate neutrophil intothe infeclictn area to destroy the pathogen. This is related with the function of IL-8 in.cell as chemoatractan and main activator of neutrophil. This research aimed to showthe profile o.f IL-9 protein expression in subclinical mastitis cow and evaluating therelationship between IL-8 concentrations with mastitis score according to CMT.Blood and milk samples in this research was obtained from 30 Friesien Holsteincows (PFH) (120 nipples) that belonged to KUTT Suka Makmur Kecamatan GratiKabupaten Pasuruan. Those samples then were tested for IL-8 protein profilesthrough SDS-PAGE and the confirmation of IL-8 through imunohistochemistryntethod in blood smear. On other hand to decide IL-8 concentration, a counting ofcomplex bond absorbance of IL-8 and anti IL-8 in ELISA at 450 nm wavelenght werecarried out.

The result of research showed that from 30 dairy cows samples, there were 13(52 nipples) which could be classified as normal according to CMT (zero score) andthe rests were suffering from subclinical mastitis with score CMT I-4. Then, theobservation of IL-8 protein profile showed that IL-8 was q protein with 8,5 kDamolecular weight appeared in all of CMT scores. The IL-8 concentration positivelycorrelated with mastitis score with determination coefficient of 99,5%. So, it can beconcluded that higher mastitis levels of a dairy cow has higher IL-8 concentrotions(JIIPB 2008 Vol l8 No I : 36-50).

Keywords: Mastitis, IL-8, CMT score and Dairy Cattle

37

PENDAHULUAN

Pada umumnya, mastitis

subklinis merupakan tipe mastitis yang

paling sering terjadi pada peternakan

sapi perah di seluruh dunia (kira-kira

15-40 kali lebih banyak) dibandingkandengan mastitis klinis. Selain itu,

analisis pendahuluan terhadap sampelsusu hasil pemerahan harian oleh

Youngerman et al. (2004)

menunjukkan bahwa lebih dari 50%

sapi perah uji, Paling tidak

mengalami mastitis subklinis di satuputing selama hiduPnYa. Kondisiinfeksi tersebut sangat merugikan,karena selain mudah sekali menular

kepada ternak Perah sehat lainnYa,

teiapi juga sulit dideteksi oleh peternak

karena gejalanYa tidak tamPak

sedangkan produksi susunya semakin

merupakan salah satu komponenseluler yang esensial terutama dalamproses migrasi neutrofil ke area

inflamasi untuk proses penyembuhan

infeksi (Yao, 1996). Hal ini

dikaitkan dengan fungsi IL-8 dalam sel

yaitu sebagai kemoatraktan dan

aktivator utama bagi neutrofil(Mukaida, 2003). Gen PenYandi IL-8pada sel leukosit mulai akti [ '

mengekspresikan lL-8 setelah muncul

sinyal induksi oleh endotoksin yang

berupa Lipopolisakarida (LPS) bakteripatogen yang menempel pada sel epitel

kelenjar mammae (Broaddus et al',

1994). Semakin tinggi kandungan

LPS maka kadar IL-8 Yangterekspresipun semakin meningkatdalarn cairan tubuh sebagai bukti

adanya aktivitas seluler untuk

mengeliminasi antigen (Mukaida'

2003). Ketika IL-8 telah berikatan

dengan resePtornYa, maka timbLrl

sinyal komunikasi molekuler Yangmenghasilkan proses induksi migrasi

sel yang dimulai dengan pengikatan

IL-8 terhadap molekul proteoglikanpada sel endotel pembuluh darah dan

protein matriks ekstraselular dalamjaringan. Selanjutnya, IL-8 dibawa

masuk oleh endotel, diPindahkan ke

permukaan lumen Yangdipresentasikan kepada neutrofil' dan

seianjutnya menstimulasi migrasi

neutrofil melintasi sel endotel menuju

ke temPat terjadinYa inflamasi

sekaligus mengaktifkan makrofag

untuk proses eliminasi Patogen(Zecconi et al., 2000). Kondisi

peningkatan konssntrasi dan distribusi

iL-8 tersebut dapat terjadi baik dalam

susu maupun dalam darah sebagai

lnterleukin-8 (rL-8)

menurun secara terusmenerus.Menurut ParYati (2002),

deteksi mastitis sering dilakukan

melalui produk susunya' misalnYa

dengan melakukan Penghitunganjumlah sel somatik (JSS) dalam susu'

Namun, jumlah sel somatik Pada susu

dapat meningkat seiring denganbertambahnya umur saPi, sehinggametode ini dianggap kurang efektif'Salah satu metode deteksi mastitisyang sampai saat ini dianggap paling

sederhana dan cePat adalahpenggunaan Sodium HYdroxide(NaOH) dan Culifornia Mqstitis Test

(CMT) dengan menggunakan alat yang

disebut paddle (SoltYs and Quinn,2002). Metode ini sangat dikenal,

mengingat tsknik pelaksanaannya di

lapangan sangat Praktis dan mudah,

dapat digunakan pada setiap puting

susu dan atau susu Yang telah

dicampur (susu Yang berasal dari

milk-can dan container).

38

respon lokal dan sitemik tubultterhadap bakteri patogen (Mehrzad etal., 2000) serta bukti hasil akumulasiaktivitas neutrofil. Penelitian inibertu.juan untul< mengetahui profil

MATBRI DAN METODE

Tempat dan Waktu Penelit ianPenelitian ini dllaksanakan mulai

bulan Juli 2007 hingga bulanSeptember 2007 di LaboratoriumBiokimia Jurusan Kimia FakultasMatematika dan Ilmu PengetahuanAlam Universitas Brawijaya Malang.Lokasi pengambilan sampel dilakukandi peternakan sapi perah di KUTTSuka Makmur Kecamatan GratiKabupaten Pasuruan. Adapun materi-r ang digunakan adalah 30 ekor padatingkat laktasi 2-3 dan bulan laktasia 1

Adapun variabel yang diamati1'aitu profil protein IL-8nya melaluiSDS-PAGE dan menentukankonsentrasi IL-8 dilakukanperhitungan absorbansi ikatankompleks IL-8 dan anti IL-8 secaraITLISA pada panjang gelombang 450nm.

Koleksi Susu Sapi dan uji mastitisdengan CMT

Sampel susu diambil padarvaktu pemerahan pagi dan sore haridan langsung dimasukkan ke dalarnbotol sampel. Sampel diambilsebanyak 5-lOmL lalu disimpan dalamIce box suhu 2-8oC untuk selanjutnyadibawa ke laboratorium untuk ujikadar IL-8.

Uji CMT, susu dari pemerahanpancaran kedua atau ketiga dari setiappLrting lalu ditampung pada paddle.

protein IL-8 dalam susu sapi perahmastitis dan konsentrasi IL-8 dalamdarah sapi perah mastitis.

Setelah itu ditambahkan reagen CMT(l: l). Setelah ditambahkan reagen,paddle diputar perlahan-lahan secarasirkuler selama l0-15 detik dan dilihatperubahan pada larutan yaitu berupapembentukan gel berwarna putihabu-abu dalam larutan berwarna ungupada dasar paddle. Skor mastitisditetapkan berdasarkan panduantingkat mastitis oleh Tzrylor (1992).

Isolasi Protein SusuIsolasi protein dilakukan

dengan mengambil susu stok sebanyak1-2 mL, dimasukkan ke dalarn tabungpropilen, ditambah ETOFI 100% dingin( l : l ) , l a l udiinkubasi semalam dalam freezer.Keesokannya, larutan disentrifugasidengan kecepatan 6000 ipm selama 15menit. Pelet dikeringanginkan laluditambah dengan Tris HCL 20mM dandisimpan dalam suhu 4"C hinggaperlakuan berikutnya.

Koleksi DarahDarah diambil dari sapi perah

sebanyak 3-5 mL dari vena jugularisdengan jarum khusus. Setelah itu darahyang keluar ditampung dalamvacutainer yang sudah mengandungEDTA. Sampel darah kemudiandisimpan pada ice box dengan suhu2-5"C dan dibawa ke laboratorium.

39

Pengambilan SerumDarah kolcksi diletakkan dalam

posisi miring hingga terl ihat memisahmenjadi 2 fase cairan (l-2 jam).Kemudian sentrifugasi (3000 rpmselama 15 menit). Supernatandimasukkan ke eppendorf dansentrifugasi 3000 rpm kembali. Setelahitu, supematarr (serum) dipindahkan keeppendorf baru, disimpan dalam suhu(-4)"C sambil mempersiapkanAmonium Sufat jenuh 50%.

Purifikasi Protein SerumSebanyak 200 pL sampel serum

diambil dari stok dan ditambah denganAmonium sulfat jenuh 50% (l: l) ,diinkubasi 30 nrenit suhu 4oC(Refrigerator) dan sentrifugasi 10.000rpm selama l0 menit. Pelet dicucidengan menarnbahkan Amonium sulfatjenuh 50% (10 x Vol pelet) sambildiketuk-ketuk. Kemudiandisentrifugasi (10.000 rpm selama l0menit). Pelet dilarutkan denganBuffer Phosphate 0,2M (1/4 Vol), laludipindah ke selofan sepanjang 7 cmyang telah diikat salah satu ujungnya.Dialisis dilakukan dalam rendamanBuffer Phosphate 0,lM dengan stirerkecepatan sedang selama semalam.

Hasil dialisis dikeluarkan dariselofan dan dipindah ke eppendorfbaru lalu ditambah EIOH absolut (l:l)dan diinkubasi dalam suhu 4"C(refrigerator) selama semalam.Kemudian, disentrifugasi dengankecepatan 6000 rpm selama l5 menit,lalu diinkubasi selama 10 menit suhu(-4) 'C atau dalam Freezer. Setelahitu, supernatan di buang dan peletdikeringanginkan hingga tidak ada bauEIOH, lalu di larutkan dalam Tris HCLI M dan disimpan dalam suhu (-4) 'C

(Fre ezer) h i ngga perlakuan beri kutnya.

ELISA (Enzyme LinkeclImmunosorbent Assays)

1. Pembuatan denah Plate ELISAdan Coating buffer. Denah dibuatberdasarkan kode sampel danlokasi penempatan sampelseperti yang diinginkan. CoatingBuffer dibuat Fresh.

2. Coating Antigen (serum yangmengandung IL-8). Kadarantigen IL-8 yang digunakanadalah (1:20) diencerkan dengancoating buffer, diinkubasi padasuhu 4C s6malam. Keesokanharinya plate dicuci dalamPBS-Tween3x3men i t

3. Blocking Antigen. Blockingbuffer (BSA lYo dalam PBS) 100pl I well ditambahkan dandiirrkubasi selama 2 . ian stthtrruang. Setelah itu, plate dicucidengan PBS-Tween 3 x 3 menit.

4. Coating Ab prirner (100 Pl /well). Digunakan Ab primer: antibovineCD I 8 1 /CXCR I (Biolegend),di larutkan I :1000 dalanrPBS-BSA, diinkubasi selama 2

' jam, suhu ruang, lalu dicucidalam PBS-Tween 3 x 3 menit.

5. Coating Ab sekunder (1:2500)dalam TBS. Digunakan Absekunder: anti Mouse IgG-biotinlabelled yang dilarutkan (l:250)dalam TBS, di inkubasi selama Ijam pada suhu ruang, lalu dicr"rcidengan PBS-Tween 3 x 3 menit.Setelah itu ditambahkan SA-HRP( l :500) dan d i inkubasi se lama 45menit, dicuci dengan PBS-Tween3x3men i t ,D i t ambahkansubstrat TMB 50 pll well, lalu

40

langsung ditambahkan Stopreaksi (HCL I N).

6. Pembacaan Ikatan kompleks AbSekunder dengan SAHRP-TMB.Dilakrikan dengan ELISA readerpada )":450 nm.

Dot BlotAntigen (IL-8) sebanyak 20 pl

diencerkan dalam sodium azida

Q'JaN:) l% (l :a). Kemudian,campuran diteteskan pada membrannitroselulosa yang telah dibasahi PBSdan terangkai pada Dot Blotter.Didegas selama 30 menit.

Membran diblock denganPBS-Skim 5% selama I jam (suhuruang), dicuci dengan PBS-Tween0.05% selama 3x3 menit. Inkubasidengan antibodi primer (anti bovineCDlSl /CXCRI(Bio legend)) yangtelah diencerkan dalam PBS-Skim 5%r l:200) selama 2 jam sambil digoyangpada .shaker. Setelah itu, dicuci 3x3menit dengan PBS-Tween. Diinkubasidengan anti Mouse lgG-biotin labelleddalam TBS (l:250) selama I jamsambil digoyang. Dicuci denganPBS-Tween 0,05oh selama 3x3 menit.Diinkubasi dalam substrat L/'esternBlue (dalam ruang gelap) selama 30menit. Reaksi dihentikan denganpenambahan aquades. Membrandikeringkan dan diamati ada tidaknyanoda berwarna biru gelaP.

ImmunohistokimiaDarah koleksi diteteskan (lPL)

diatas slide kemudian digores denganslide lain pada sudut 45" satu arahhingga darah terseret menipis padastide. Kemudian sl ide Yang berisiapusan darah direndam dalammethanol absolut selama 5 menit laludikeringanginkan. Setelah itu, dicuci

dengan PBS 3 x 5 menit, ditambahHzOz30o/o, diinkubasi l0 menit, dicucidengan PBS 3 x 5 menit, lalu ditambahBSA l%, dan diinkubasi selama l jamdalam suhu ruang. Setelah itu,ditambahkan antibodi primer (l:100)(anti bovineCDl Sl/CXCRI (Biolegend)) dandiinkubasi semalam dalam suhu 4"C.Keesokan hari, slide dikeluarkan darifreezer, dikondisikan suhu ruang laludicuci dengan PBS 3 x 5 menit.Setelah itu, ditambahkan Ab Sekunder(anti Mouse IgG-biotin labelled)(l :200), di inkubasi selama I jam, suhuruang. Kemudian dicuci dengan PBS 3x I menit, ditambah SAHRP (1:500),diinkubasi 45 menit, ditambahkansubstrat TMB, dicuci PBS 2 x I menit,dicuci aquades steril, ditetesi MayerHE hingga muncul warna biru (3-5menit), lalu dicuci dengan air mengalirhingga warna biru tidak terlalu pekat(10-15 menit). Sl ide diamati denganmikroskop pada perbesaran l00xhingga 400x.

Elektroforesis SDS PAGEPersiapan gel. Plat gel dibuat denganmerangkai dua plat kaca dengan jarakantara plat I mm. Gel dibuat dua lapisyaitu gel sebagai tempat pengumpulansampel (stacking gel) dan gel sebagaimedia untuk pemisahan Protein(separating gel). Campuran separatinggel dimasukkan hati-lrati ke dalamplate (tempat laPisan gel)menggunakan mikropipet. Dibiarkanl0-30 menit hingga terbentuk gel.Berikutnya, stacking gel dituang diatas separating gel sambil dipasangsisir hingga terbentuk gel berikutsumurannya. Didiamkan selama 30menit. Setelah terbrntuk gel, sisirdiangkat dengan hati-hati. Selanjutnya

41

plate dipasang pada alat elektroforesis,lalu running buffer dituangkan padabej ana elektroforesi s.Injeksi sampel. Sebanyak l0 pLsampel isolat protein ditambah l0 pLTris-Cl + 2.0 pL P*SB (ReducingSample Buffer), dan dimasukkan kedalam mikrotube, kemudiandipanaskan dalam penangas air padasuhu 100 oC selama 3 menit. Setelahdidinginkan, sampel dimasukkandalam sumur-sumur gel denganvolume 20 pL untuk tiap sumur.Setelah itu anoda dihubungkan padareservoir bawah dan katodadihubungkan pada reservoir atas.Power supply dihidupkan dengan aruslistrik sebesar 30 mA. Prosespemisahan (running) dihentikansetelah warna biru dari penandamencapai ketinggian 0,5 cm dari batas

Analisis DataData yang diperoleh dianalisis

secara deskriptif dan untuk mengetahuihubungan antara mastitis dengan kadar

HASIL DAN PEMBAHASAN

MastitisHasil uji mastitis pada 30 ekor

sampel menunjukkan bahwa terdapat13 ekor (52 puting) sapi yang sehatatau tidak terinfeksi sama sekali(43,33%) dan 17 ekor (68 puting) sapi

jarak pergerakan protein dari tempat awalR f :

jarak pergerakan warna dari tempat awal

bawah plat gel. ?Pewarnaan dan pencucian gel.Pewarnaan dilakukan denganmerendam gel dalam larutan staining(CBB) selama 30-60 menit.Penghilangan warna dilakukan denganmerendam gel dalam larutandestaining sambil digoyangkan denganshaker otomatis sampai gel menjadijernih. Kemudian hasil elektroforesisdiscan dengan Scanner.

Penentuan berat molekul. Beratmolekul ditentukan denganmembandingkan hasil elel<troforesissampel dengan marker protein.Penentuan berat molekul dilakukandengan menghitung ni lai Rf(Relardation foctor) darimasing-masing pita dengan Rumus:

IL-8 yaitu dengan metode korelasi danregresi sederhana (Steel and Torrie,l 99 l ) .

yang terinfeksi mastitis (56,67%)dengan berbagai skor mastitis 1-4sesuai dengan tingkat keparahannya(severity). Prosentase jumlah putingyang terserang mastitis dapat dilihatpada Tabel 1.

A a

Tabel 1. Prosentase tingkat mastitis pada puting sapi perah yang terinfeksi.

Skor mastitis Jumlah puting Prosentase (o/o)

0I)

34

782255l0

6518,334 ,174 ,178,33

Keterangan:0: negatif; l: Trace (sedikit); 2: Positif Lemah; 3: Positif Nyata; 4- Positif Kuat

C\4T merupakan reaksi antara reagen) ang mengandung arylsulfonatedengan DNA sel leukosit yangmembentuk masa gel, sehinggakualitas aglutinasi atau konsistensi gel

) ang terjadi merupakan gambaranjumlah sel leukosit yang hadir didalam susu akibat respon tubuhterhadap adanya infeksi bakteri.Semakin kental gel yang terbentukmaka sel leukosit yang ada dalamsusupun semakin banyak (Akers,1002). Hal ini sesuai dengan penelitian\4ehrzad et al. (2000) tentang efekendotoksin mastitis (LPS bakteri)terhadap aktivitas sel leukositpolymorphonuclear (PtvtN) secaralokal di dalam susu dan secarasistemik dalam darah. Penelitiantersebut menyimpulkan bahwa padasaat kelenjar susu belum tercemardengan LPS bakteri, aktivitas PMNdalam susu lebih rendah daripadaaktivitas PMN dalam darah. Seiringdengan meningkatnya kondisi infeksimaka aktivitas PMN dalam susu akanmeningkat secara drastis daripadaaktivitasnya dalam darah.

Hasil uji mastitis pada Tabel 1.menunjukkan bahwa puting yang sehat(skor nol) masih cukup banyak yaitusebesar 65% (78, puting dari 120

puting). Namun, apabila diambilrata-rata untuk 4 puting per satu ekorsapi maka diketahui bahwa sapi yangbenar-benar sehat hanya l3 ekor sajaatau 43,33Yo. Kondisi tersebutmenunjukkan bahwa 13 ekor sapitersebut memiliki tingkat resistensimastit is yang lebih t inggi dari sapiyang lain. Hal ini kemudianmenimbulkan suatu pemikiran bahwapada sapi tersebut terdapat suatu genaktif pengatur sifat resistensi mastitisyang tidak dimiliki oleh sapi lain.Youngerman (2005) menyebutkanbahwa sapi perah yang memiliki genresistensi terhadap penyakit tertentuakan cenderung memiliki tingkatrespon imun yang lebih tinggi,sehingga apabila dalam suatu populasitemak yang menderita mastitisterdapat I ekor ternal'. yang sehat,maka kemungkinan besar individutersebut memiliki gen resistensimastitis yang terekspresikan dengarrbaik sehingga memiliki mekanismepertahanan tubuh yang lebih baik pula.

Tabel l. menunjukkan bahwalebih dari setengah anggota sampel(56,67%) dinyatakan menderitamastitis subklinis pada kisaran skorCMT l-4. Menurut Swartz (2006),mastitis subklinis merupakan infeksi

^ a+J

pada kelenjar susu tanpa menunjukkanadanya perubahan kondisi fisik ambing

atau dengan kata lain abnormalitasambing seperti bengkak, warnanyamemerah, muncul lendir serta lesi pada

area sekitar Puting tidak muncul

sehingga seringkali tidak diketahuioleh peternak. Selain itu, abnormalitassusu yang terjadi akibat adanya infeksipada kelenjar mammae tidak daPat

dilihat secara nvata atau spontan tanpa

melalui suatu metode pengujian susu

tertentu.

Profil Ekspresi Interleukin 8Hasil isolasi protein irt terleul<it l

8 pada samPel darah dan susu Yangmemiliki skor CMT 0-4 (Gambar I ')

menunjukkan bahwa Profil Proteinyang terekspresi hampir sama untul<

r".uu samPel. Hal ini diketahui

melalui munculnya pita protein pada

lokasi yang sama di hamPir semlla

sampel yaitu Protein dengan berat

molekul 97,3kDa, 49 kDa, 39,5 kDa,

32 kDa, 17,5 kDa, 1l kDa, 8,9 kDa,

dan 8,5 kDa.

Keterangan:Sumuran ke-l,4:Protein serum sapi dengan nilai cMT 0; Sumuran ke-5,6: Protein

,uru rupi dengan nilai CMT 0; Sumuranle-2: Protein serum sapi dengan nilai CMT

1; Sumuran ke-7: Protein susu sapi dengan nilai CyT 1; Sumuran ke-3: Protein

serum sapi dengan nilai CMT 2; Sumuin ke 10: Protein susu sapi dengan nilai

CMT 2; Sumuran ke 9: Protein susu sapi dengan nilai 9MT 3; Sumuran ke 8:

protein susu sapi dengan nilai CMT 4; M: Marker Protein BM rendah

Gambar L. Profil pita protein interleukin 8 pada gel elektroforesis sDS PAGB

Bi:':x:lt,l;:il'li:ir:r,l ll

;'r"'

44

1 '1 .310 .5

o .3

8.t)5

Keterangan:{: skor CMT 4; 3: skor CMT 3; 2: skor CMT 2; 1: skorCMT 0) M: Marker Protein BM rendah

Gambar 2.Pita protein IL-8 pada membran(Metode Western Blot)

CMT 1; 0: normal (skor

nitroselulase

Salah satu protein yangmenjadi fokus perhatian adalahterekspresinya protein dengan beratmolekul 8,5 kDa di semua sampel baikpada sampel darah maupun susu.Protein tersebut ' diduga sebagaimolekul protein Interleukin 8. Leortger al. (1997) menuliskan bahwa IL-8juga disebut sebagai sitokinkernotaktik dengan berat molekul yangrelatif kecil yaitu sekitar 8 - 8,5 kDa.

Pada Gambar 2. dapat dilihatdensan jelas bahwa konsentrasi IL-8pada skore mastitis 0 tampak kurang-ielas. dibandingkan skore I sampai 4.Protein IL-8 diisolasi dan dipurifikasiJari sampel susu dan serum darahsebagai perbandingan profil ekspresi:rotein. Profil protein hasil isolasiJikonfi rmasi dengan elektroforesis gel:oi iaki lamid SDS PAGE lalu diwarna

dengan CBB (Commasie BriliantBlue). Menurut Widyarti (2006),elektroforesis merupakan prosesbergeraknya molekul bermuatan padasuatu medan listrik. Kecepatanmolekul yang bergerak pada medanlistrik tergantung pada nruatan, bentukdan ukuran. Dengan demikianelektroforesis dapat digunakan untukseparasi makromolekul (seperti proteindan asam nukleat). Elektroforesisuntuk makromolekul memerlukansuatu matriks penyangga yangmemungkinkan terjadrnya difusi akibatdari timbulnya panas dan arus listrikyang digunakan. Gei poliakrilamid danagarosa merupakan matriks penyanggayang banyak dipakai untuk separasiprotein dan asam nukleat.Elektroforesis yang dibahas padapenelitian ini menggunakan matriks

45

berupa gel poliakrilamida (PAGE :

Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis)untuk separasi sampel protein.

Prinsip elektroforesis untukmemisahkan molekul-molekulberdasarkan muatannya adalah sifatmolekul biologi yang bermuatanpositif akan bermigrasi ke elektrodanegatif dan sebaliknya bila beradadalam suatu rrredan listrik. Metodeseparasi dengan SDS-PAGEmerupakan suatu metode untukmendeteksi pola pita protein dengancara memisahkan poliPePtidaberdasarkan perbedaan ukurannya.Selain itu, SDS sebagai detergenmampu membantu proses lisis dengancara menghilangkan molekul liPidsehingga menyebabkan kerusakanmembran sel. Komponen-komPonenyang tercerna seperti dinding sel,sebagian dapat diendapkan dengansentrifugasi sehingga meninggalkanekstrak sel berupa supernatan yangjernih (Sumitro, et al., 1996).Campuran protein (crude protein) atauasam nukleat yang dianalisis denganPAGE hamprr selalu terdiri darimolekul-molekul yang berbeda ukurandan muatanr^ya. Apabila diseparasiakan didapatkan beberapa zona ataupita pada lokasi yang berbeda. Posisipita protein pada gel meruPakangambaran berat molekul protein hasilisolasi yang terseparasi oleh aruslistrik. Semakin ke bawah maka beratmolekulnya semakin kecil. MenurutChang et al. (2000), ukuran Pori gelpoliakrilamid dapat diatur untukmenghasilkan separasi yang lebih baik.

Matriks Poliakrilamidberfungsi untuk memisahkan proteinberdasarkan ukuran (Berat molekul500-250.000 Da) dan menstabilkan pHbuffer agar muatan Protein tidak

berubah. Selain itu, Sifat sampel yangakan dipisdhkan dapat digurnakanuntuk memil ih danmempeftimbangkan gel Yang akandipakai sehingga dapat menghasilkarrseparasi molekul yang baik. Gelberpori besar sebaiknya digunakan bilaingin memisahkan molekul yang lebihkecil. Oleh sebab itu, untukmendapatkan pita protein IL-8 yangmemiliki berat molekul relatif kecil(8,5 kDa) maka digunakan separatinggel dengan ukuran Pori 12% laludibandingkan dengan marka proteinberat molekul rendah (Gambar 1').

Interleukin 8 (IL-8) meruPakansuatu kelompok protein yang berperansebagai kemoatraktan dan aktivatorleukosit (limfosit, monosit, danneutrofil) dalam respon terhadaPkondisi inflamasi oleh sistem imun.Selain itu, IL-8 disebut juga kemokinkarena IL-8 merupakan sitokin yangberperan untuk mengaktivasipergerakan sel-sel leukosit secarakimiawi (kemotaksis) ke temPatinfeksi atau lokasi kerusakan jaringan

sehingga mempermudah interaksi antarsel dalam rangka mengeliminasipatogen (Baratawidjaja, 2004).Berdasarkan teori tersebut maka dapatdiketahui bahwa IL-8 terekspresi dandiproduksi tubuh untuk melakukaneliminasi terhadap anti gen.

Pada kasus mastitis, IL-8diketahui berperan Penting dalammekanisme migrasi neutrofil dan selleukosit keluar dari aliran darahmenuju area infeksi. Menurut Paape, elat., (1996), dengan mengabaikan jenis

bakteri yang menyebabkan inisiasiinfeksi, kuantitas dan kualitas selleukosit (PMN) dalam ambingmerupakan komponen Penting dalamsistem pertahan ambing. Bakteri dan

46

leukosit pada puting yang terinfeksimelepaskan suatu produk (sitokin),dengan didominasi oleh jeniskemoatraktan (kemokin) sepertiinterleukin 8 untuk neutrofil yangdikir im melalui sirkulasi dalampernbuh,rh darah. Neutrofil bergeraksecara cepat dari aliran darah ke dalamputing yang terinfeksi. Jika bakteridihancurkan, transfer neutrofil kedalam kelenjar segera dihentikan.Murdoch (2000) juga menuliskanbahwa kondisi inflamasi akibat adanyainduksi oleh sitokin proinflamator,serangan bakteri dan produk toksinnya,sefta virus, dapat menyebabkandiproduksinya sitokin yang bersifatkernotaktik secara besar-besaran untukmenarik sel leukosit ke area infeksi.Dengan demikian, pada saat tubuhaktif melakukan mekanismepertahanan diri dengan memproduksikernokin IL-8 dan mengalirkannya kearea inflamasi melalui aliran darah,rnaka akan terjadi peningkatankonsentrasi IL-8 dalam cairan tubuh.Oleh sebab itu, ekpresi protein IL-8dapat dideteksi di semua samPelierLrtama sampel dengan skor CMT l-4sebagai pertanda adanya respon imunsecara lokal pada kelenjar sususekaligus secara sistemik terhadapserangan bakteri.

Hal yang menarik Padapensamatarr profil IL-8 ini adalahterekspresinya molekul protein IL-8pada sampel protein dengan skor CMT0. Kondisi ini dapat terjadi karenabeberapa kemungkinan. Salah satupeluang terekspresinya IL-8 adalahnunculnya patogen lain selainpenl'ebab mastitis yang mampumenimbulkan inflamasi di dalam tubuhsapi sehingga pada saat diuji denganC\IT skor yang muncul nol tetaPi

secara molekuler menunj ukkan ekpresiIL-8. Lebih lanjut, kondisi tersebutdidukung pula dengan terekspresinyaprotein lain yang ada bersama-samadengan IL-8 yaitu protein dengan beratmolekul 17,5 kDa pada sumur 1,4,dan6 (sampel protein untuk skor CMT 0).Menurut Clements (1991), proteindengan berat molekul 17,5 kDamerupakan protein IL-l cl, yangberperan sebagai mediator pada responinflamasi terhadap infeksi danrangsang inflamasi lain. IL-1 ctbersama dengan TNF cr berperan padaimunitas nonspesifik. Sumber utamaIL-l 0, sama dengan TNF c, yaitufagosit mononuklear yang diaktifkanantigen, sel Natural Killer QllK), dansel mast.lL-1 s dan TNf o merupakanciri khas adanya reaksi inflamasi akutsehingga berdasarkan hal tersebutmaka dapat diketahui bahwa kelompoksapi tersebut tidak terserang mastitisnamun menderita inflamasi karenasebab lain.

Kemungkinan lain yang bisamenjelaskan munculnya lL-8 pada sapidengan skor CMT 0 adalah adanyaproses resiklus IL-8 setelahmekanisme eliminasi pathogenberakhir. Menurut Mukaida (2003),segera setelah proses migrasi neutrofilterjadi, IL-8 diinternalisasi dandikembalikan ke siklus semula denganmuncul kembali pada permukaan selsecara cepat dalam 60 menit. Apabilaterjadi penghambatan resiklus makadapat mengurangi aktivitas mekanismekemotaksis oleh CXCL8. Dengandemikian IL-8 telah siap melaksanakanproses pertahanan tubuh berikutnya.

Selain itu, terdapat pula Proteindengan berat molekul 15,5 kDa Yanghanya terekspresi pada sumur 7 yaitukelompok sampel dengan skor CMT I

47

atau dalarn skala ringan (trace).Protein tersebut merupakan proteinIL-Z yang diketahui berperan sebagaigrowth factor bagi sel T Yangdiaktifkan antigen dan berperan padaekspansi klon sel T setelah pengenalanantigen (Clements, i991). Hal inimengindikasikan bahwa pada saat ituterjadi pengendalian proliferasilimfosit T dan sel imun lain seperti selNK dan sel B untuk kemudianmenginduksi pembentukan antibodi.Selanjutnya, kondisi aktif sel T olehlL-z mengakibatkan terekspresinyaIL-4 (19 kDa) yang juga terlihat padakelompok sampel ini disamPingkelompok sampel skor CMT 2 dan 4.Menurut Baratawidjaya (2004), lL-4merupakan stimulus utama produksiIgE dan perkembangan Th2 dari selCD4* naif. Apabila pada kelompok inimuncul ekspresi IL-8 maka secaraselektif, akan terjadi penghambataninduksi prodr"'ksi Immunoglobulin E(IgE) oleh IL-4, sehingga tidak munculrespon alergi.

Selanjutnya, pada samPeldengan skor CMT 3 dan 4 (sumur 8dan 9, Gambarl.) terekspresi proteindengan berat molekul 5l kDa Yangdiketahui meprpakan protein TNF o(Clements, i99l). TNF o meruPakansitokin utama pada respon inflamasi

KESIMPULAN

KesimpulanPenelitian profil eksPresi

interleukin 8 pada saPi mastitissubklinis menr,nlukkan bahwa proteinIL-8 dengan berat molekul 8,5 kDaterekspresi pada semua skor CMTdisertai beberapa protein lain yangberkaitan dengan kondisi mastitisberdasarkan skor CMT. Protein

akut terhadap bakteri dan rnikroba latinyang mampu menimbulkan komplikasisistemik pada infeksi berat'Berdasarkan teori tersebut maka skorCMT 3 dan 4 sudah termasuk dalammastitis klinis sebab kemunculan TNFo dalam susu dan darah menunjukkanadanya suatu reaksi inflamasi akutyang memiliki ciri-ciri kemerahan,panas, edema/bengkak, dan sakit raba(pain). Menurut Swartz (2006),gejala-gejala yang namPak Padamastitis klinis antara lain munculperubahan bentuk cairan susu (munculgumpalan-gumpalan dan berwarnakebiruan serta berlendir),pembengkakan ambing dan terabapanas, warna arnbing memerah sertamengalami rasa sakit raba terutamapada area puting. Oleh sebab itu, skorCMT 3 dan 4 jarang muncul kecualisengaja diambil untuk mengetahuritingkat kekentalan gel yang terbentul<dalam rangka menegakkan kondisiklinis. Pada umumnya yang terjadi dilapang, skor CMT 4 sudah jelas

memperlihatkan adanYa Perubahanukuran puting yaitu menjadi lebih kecildan bertekstur keriput, lcondisi inibiasa disebut dengan istilahyudimenter.

tersebut adalah protein dengan beratmolekul 97,3; 51; 49; 39,5; 32; 17,5;15,5; 1 l ; dan 8,9 kDa.

Konsentrasi rata-rata IL-8 Padaskor mastitis berdasarkan CMTberturut-turut adalah 1,522 mM; 8,250mM; 14,665 mM; 20,419 mM;27,534mM untuk skor 0 - 4.

48

Saranl. Perlu dilakukan pemurnian

IL-8 lebih lanjut agar dapatdilakukan uji spesifitas dan ujiakti.'itas IL-8 terhadap mikrobapatogen mastitis tertentu.

2. Perlu dilakukan pengamatanterhadap sel epitel kelenjarsusu dengan metode pewarnaantertentu untuk mendukungpenetapan status mastitissubklinis.

DAFTAR PUSTAKAAkers, R.M. 2002. Lactation and the

Mammary Gland. Iowa StateUniversity Press. Ames.

Baratawidja.ja, K.G. 2004. ImunologiDasar. FK UniversitasIndonesia. Jakarta.

Broaddus, VC, Boylan AM, HoeffelJM, Kim KJ, Sadick M,Chuntharapai A, dan HebertCA. Neutrdlization of IL-8inhibits neutrophil influx in arabbit model ofendotoxin-induced pleurisy. ../Immunol 152:2960-2967

Clements, MJ. 1991. Cytokine. BIOSScientific Publisher Limited,Oxford, UK.

Leong. S.R, Lowman, H. B. , L iu , J . ,Shire, S., Deforge, L. 8.,Gillece-Castro, B.L.,Mcdowell, R. dan Hebert, C.A. 1997. IL-8 sinele-chainhornodimers andheterodimers: Interactionsrvith the chemokine receptorsCXCRI, CXCR2, and DARC.

3. Perlu di lakukan peneli t ian lebihlanjut tentang gen penyandiprotein IL-8 pada sapi mastitissubklinis di Indonesia sebagaireagen seleksi sapi untukmeningkatkan respon imunterhadap mastitis sehinggadapat meningkatkan mutugenetik danpeternakan.

produksi

Cambridge UniversityPress.Protein Sci. 6: 609-617.

Mehrzad, J., Dosogno, H., Meyer, E.,dan Burvenich, C. 2000. Localand systemic effects ofendotoxin mastitis on thechemiluminescence of milk andblood neutrophils in dairycows. Vet.Res. 32: 131-144.

Mukaida, N. 2003. Pathophysiologicalroles of interleukin-8/CXCl8in pulmonary diseases. JPhysiol Lung Cell Mol Physiol284 L566-L577

Murdoch. C. 2000. CXCR4:receptorchemokine

extraordinaire.177 :175 -184

lmmunol. Rev

Paryati, SPY. 2002. PatogenesisMastitis Subklinis yangDisebabkan olehStaphylococcus aureus padaMencit Berdasarkan GambaranHistopatologi sebagai HewanModel untuk Sapi Perah. Tesis,

49

Program Magister. ProgramPascasarjana IPB. Bogor.

Soltys J. dan T. Quinn. 2002. SelectiveRecruitment of T-Cell Subsetsto the Udder DuringStaphylococcal andStreptococcal Mastitis:Analysis of LymphocyteSubsets and AdhesionMolecule Expression. Infect.and Immun., 67 : 6293-6302.

Steel, H.G.D. dan Torrie, J.H. 1991.Prinsip Dasar dan ProsedurStatistik. Gramedia PustakaUtama. jakarta

Sumitro, S. 8., Rahayu, S., Fatchiyah,Widyarti, S., dan Arumingtyas,E. L. (1996). KursusTeknik-Teknik Dasar AnalisisProtein dan DNA. JurusanBiologi, FMIPA, UniversitasBrawijaya. Malang

Swartz, H. A. 2006. Mastitis inThe Ewe.http ://www. case-a gworld. com/cAw. LUmast.html. Diaksestanggal 20 Oktober 2007

Taylor, R.E., 1992. Scientific FarmAnimal Production. MacmillanPublishing ComPanY. NewYork.

Yao, J., Aggrey, 5.8., et al. 1996.Sequence variations in thebovine growth hormone genecharacterized by single-strdanconformational polYmorPhism(SSCP) analysis and theirassociation with milkproduction ,traits in Holsteins.Genetics. 144: 1809-1 8 I 6.

Youngerman SM. Oliver SP, SaxtonAM. Edwards JL, Schrick FN.Davies CI, Pighett i CM. 2004.A Novel cdanidate geneticmarker br mastitis resis inJersey cottle. The UniversitY ofTennessee, Knoxville. TN

Zecconi, A., C. Burvenich, J.Deteilleux, J. Hamann, i.Leigh, P. Leroy, C. Luzzago,R. Piccinini, P. Renard, danK.L. Smith. 2000. MammarYGland Immunity. IDF revieu'paper, IDF SymPosion, Stresa,It.

50