Hongos entomopatógenos para el control de la chinche del eucalipto Thaumastocoris peregrinus: resultados preliminares

Sofía Simeto1, Sandra Lupo2, Lina Bettucci2, Belén Corallo2, Carlos Pérez3,

Demian Gómez1, Paula González 1, Diego Torres1, Gonzalo Martínez1,

Nora Altier4 y Federico Rivas4

1. Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria, Programa de Producción Forestal, E.E. del Norte,Tacuarembó.

2. Facultad de Ciencias/Ingeniería, Laboratorio de Micología, Universidad de la República, Montevideo.

3. Facultad de Agronomía, Departamento de Protección Vegetal, EEMAC, Universidad de la República,Paysandú.

4. Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria, Programa de Sustentabilidad Ambiental, SecciónBioinsumos, E.E. Wilson Ferreira Aldunate, Las Brujas, Canelones.

VI Jornadas de Protección Forestal – 14 y 15 de noviembre de 2013

Thaumastocoris peregrinus (Carpintero y Dellapé):

• insecto fitófago de origen australiano.

• se alimenta por succión de especies del género Eucalyptus.

• provoca amarillamiento del follaje, defoliación y en casos muy severos, muerte de árboles.

Considerada una de las plagas emergentes más importantes para las plantaciones

de eucaliptos en el hemisferio sur.

En Uruguay:

• presente en casi todas las spp. de eucaliptos

plantadas comercialmente.

• detección en 2008, desde entonces importante

incremento poblacional.

Posibilidades de control químico - a priori - muy dificultoso o poco viable:

• La dificultad de la llegada de un eventual producto hasta donde se ubica el insecto.

• Alta movilidad y presencia durante todo el año (permitiría un reingreso de la plaga

desde una plantación vecina).

• Certificaciones - restricciones para el uso de determinados productos químicos.

Posibilidades de control biológico

a) con parasitoides:

Cleruchoides noackae, detectada como enemigo natural de T. peregrinus, introducida

http://www.cpf.cl

Cleruchoides noackae, detectada como enemigo natural de T. peregrinus, introducida

en varios países donde es un problema. En Uruguay, desde febrero de 2013.

Eficiencia del parasitismo de huevos en proceso de evaluación - primer acercamiento

a una posible medida de manejo.

b) con hongos entomopatógenos:

• Hongos entomopatógenos: ocurren naturalmente en el

ambiente y son responsables del control de las poblaciones de

muchos insectos.

• Desde parásitos obligados - especie específicos - hasta

generalistas con amplio rango de hospederos como Beauveriageneralistas con amplio rango de hospederos como Beauveria

bassiana y Metarhizium anisopliae.

• Grado de especificidad es muy variable entre géneros, entre

especies dentro de un género e incluso entre cepas.

• Existen numerosos casos en los que ofrecen una alternativa segura (para la salud

humana, el ambiente y los organismos no blanco) para su inclusión en una estrategia de

Manejo Integrado de Plagas (MIP), complementando otras medidas de manejo.

• Existen productos comerciales pero – en la medida de lo posible – la búsqueda de

cepas nativas (a partir de la plaga hospedero blanco) es la mejor opción para buscar

especificidad y mayor virulencia.

• Antecedentes de epizootias en el país:

en otoño de 2011 se observó una importante mortandad de T. peregrinus debida a

hongos entomopatógenos en plantaciones Eucalyptus.

• Fuera de las epizootias también se observan casos de infección de chinche por hongos

entomopatógenos.

Proyecto INIA “Desarrollo de bioinsecticidas (hongos entomopatógenos) para el

control de la chinche del eucalipto Thaumastocoris peregrinus”

Objetivo: desarrollo de bioinsecticidas a partir de la búsqueda, evaluación y bioproducción Objetivo: desarrollo de bioinsecticidas a partir de la búsqueda, evaluación y bioproducción

de hongos entomopatógenos para el control de la chinche del eucalipto.

Metodología:

1. Colecta de T. peregrinus, aislamiento e identificación de hongos entomopatógenos.

2. Ensayos de inoculación de T. peregrinus in vitro sobre floreros bajo condiciones

controladas). Aislamientos provenientes de colectas y cepas de colecciones.

Selección de cepas según su virulencia.

3. Ensayos de inoculación de T. peregrinus en invernáculo (sobre plantas en maceta3. Ensayos de inoculación de T. peregrinus en invernáculo (sobre plantas en maceta

con hoja adulta), selección de cepas según su virulencia.

4. Actividades de Bioproducción, selección de 2 cepas finales.

5. Ensayos de inoculación de T. peregrinus con cepas formuladas y productoscomerciales.

Metodología

mortalidad

productividad

Selección de Agentes

Microbianos de Control

Biológico

Ravensberg, Willem J.2011. A Roadmap to the Successful Development and Commercialization of Microbial Pest Control Products for Control of Arthropods.

Progress in Biological Control series, Vol. 10; 386 p.

seguridad

1. Colecta de T. peregrinus

• Otoño – principios de invierno 2013 – otoño 2014

(otoño: estación en la que se han registrado las

epizootias).

• En sitios con altos niveles poblacionales de

chinche en regiones Sureste, Litoral y Centro –

Norte.

Facultad de

Agronomía

EEMACINIA

• Sobre las spp. de eucalipto más apetecidas por la plaga (E. viminalis; E. benthamii,

E. dunii, E. tereticornis y E. camaldulensis) pero también en plantaciones con

reporte de ataque.

• Colecta de 10 ramas (en las que se observen

chinches) de 10 árboles por sitio de muestreo, de

aproximadamente 50 cm de largo.Facultad de

Ciencias - Ingeniería

• Región Sureste: colecta en 8 sitios (E. globulus, E. smithii y E. viminalis) Litoral y Centro – Norte:

colecta en 9 sitios (E. dunii, E. benthamii, E. grandis, E. camaldulensis x tereticornis y E.

camaldulensis).

• A partir de los individuos muertos con claros signos de micosis: cámara húmeda y aislamiento

de hongos. Individuos vivos y muertos sin evidencias de micosis: cámaras húmedas.

• Incubación por aprox. 7 días a 25 ºC, inspección con lupa y microscopio para confirmar hongos

entomopatógenos.

• Aislamiento de los hongos entomopatógenos en PDA, SDA y SDAYEM (en caso de verificarse

entomophtorales).

Identificación y caracterización de hongos entomopatógenos

• Identificación primaria: en base a las características macro y micromorfológicas de las colonias

obtenidas.

• Confirmación de la identidad: secuenciación de la región ITS y Blast en GenBank.

• Breve caracterización de cada cepa detallando: textura y coloración del micelio, tipo de espora

y conidiogénesis (si corresponde), morfología, coloración y tamaño de las esporas.

Beauveria sp.

Paecilomyces sp.

Hongos asociados a

T. peregrinus, región SE.

(aislamientos aún en proceso).

1283 insectos procesados, 1692

aislamientos fúngicos identificados.

Acremonium sp. 3,24

Acrodictys sp. 0,20

Acrodontium crateriforme 12,65

Acrodontium spp. 2,45

Alternaria alternata 42,65

Arthrinium sp. 0,10

Basidiomycete 0,10

Beauveria spp. 0,39

Cladosporium spp. 79,71

Curvularia sp. 0,10

Drechslera sp. 0,49

Epicoccum sp. 6,67

Fusarium sp. 0,59

Gilmaniella sp. 0,10

Gliocladium roseum 0,10

Especie % de hongos aislados

aislamientos fúngicos identificados.

3 % de entomopatógenos

(aprox. 19 cepas).

Gliocladium roseum 0,10

Humicola sp. 0,39

Microesferopsis sp. 0,10

Nigrospora sp. 0,49

Ophiostoma sp. 0,29

Paecilomyces spp. 1,08

Penicillium spp. 3,53

Periconia sp. 2,06

Pestalotiopsis guepinii 0,69

Phoma sorghina 0,59

Phialophora verrucosa 0,10

Rinocladiela sp. 0,59

Sporotrix spp. 1,37

Staphylotrichum sp. 1,76

Trichoderma spp. 0,88

Verticillum spp. 0,98

Sin identificar 1,47

Aspergillus sp. 0,60

Alternaria spp. 14,20

Beauveria spp. 10,80

Cladosporium spp. 70,50

Curvularia sp. 1,70

Drechslera sp. 1,10

Epicoccum sp. 1,10

Especie % de hongos aisladosHongos asociados a

T. peregrinus, región Lit. y CN

(aislamientos aún en proceso).

16,5 % de entomopatógenos

(aprox. 29 cepas).Epicoccum sp. 1,10

Fusarium sp. 4,60

Nigrospora sp. 1,70

Paecilomyces spp. 1,10

Penicillium spp. 4,60

Pestalotiopsis guepinii 1,10

Diferencias en el % de

entomopatógenos con SE

debidas a colectas en ≠

época del año, en algunos

casos.

2a. Ensayos de inoculación de T. peregrinus in vitro

Código Especie

FI 2122 Purpureocillium lilacinum

FI 2067 Beauveria sp.

FI 2044 Lecanicillium sp.

FI 2243 Beauveria sp.

FI 2240 Lecanicillium psalliotae

FI 2121 Beauveria bassiana

FI 1728 Beauveria bassiana

FI 922 Paecilomyces farinosus

Cepas de colección del Lab. de

Micología y de INIA Las BrujasFI 1878 Metarhizium anisopliae

FI 2242 Metarhizium anisopliae

ILB 151 Paecilomyces farinosus

ILB 161 Lecanicillium longuisporum

ILB 174 Metarhizium anisopliae

ILB 198 Lecanicillium sp.

ILB 200 Paecilomyces sp.

ILB 205 Beauveria bassiana

ILB 256 Beauveria bassiana

ILB 257 Lecanicillium attenuatum

ILB 264 Paecilomyces fumosoroseus

Micología y de INIA Las Brujas

• En jaula de voile, ramos de hojas frescas de E.

tereticornis.

• 50 individuos adultos (igual proporción de machos y

hembras) por jaula.

2a. Ensayos de inoculación de T. peregrinus in vitro

• Temperatura 23 °C, humedad relativa 80 %

Concentración de 107 esporas/ml de inóculo.

• Producción de inóculo:

-Colonias de 15 a 20 días en PDA o SDA.

-Suspensiones de esporas en agua + Tween 20 al 0,02%.

-Determinación del porcentaje de germinación a las 24 hs.

En cada ensayo de inoculación:

Cepas a testear + testigo (H2O +

Tween) + cepa de referencia).

Cada tratamiento (una cepa) se repetirá

al menos 2 veces.

A partir del momento de infección (en ambos casos):

• inspecciones diarias (c/registro del nº de insectos infectados).

• cadáveres removidos + esterilización sup. (etanol 70° durante 5 seg. y dos ejuagues en agua destilada estéril.)

• aislamiento del hongo para comprobar la recuperación del inóculo.

Duración del ensayo: 10 días

2b. Selección de cepas según virulencia

Selección según Ihara et al., 2001:

Clasificación en 4 grupos según n° de días en los que alcancen el 90 % de mortalidad:

Clase I (4 días o menos)

Clase II (5 a 7 días)

Clase III (8 a 10 días)Clase III (8 a 10 días)

Clase IV (más de 10 días y no patogénicas).

En base a los resultados obtenidos: primera selección de los aislamientos más virulentos,

pertenecientes a las Clase I y II.

Cepa N° de días en alcanzar el 90 % de la mortalidad Categoría

FI 1728 8 días III

FI 1878 5 días II

FI 2044 más de 10 días IV

FI 2067 6 días II

FI 2121 7 días II

FI 2122 8 días III

FI 2243 8 días III

Categorización preliminar de las cepas de colección según su virulencia

FI 922 más de 10 días IV

ILB 151 más de 10 días IV

ILB 161 más de 10 días IV

ILB 174 más de 10 días IV

ILB 198 más de 10 días IV

ILB 200 más de 10 días IV

ILB 205 6 días II

ILB 256 más de 10 días IV

ILB 257 7 días II

ILB 264 6 días II

Ensayo febrero 2013:

Recuperación de un 100 % del inóculo de los insectos vivos al 10 ° día, para las cepas ILB 198, ILB 200 e ILB 264.

A

B D

A y B: cámaras húmedas con T. peregrinus presentando

HEP; C: detalle de la esporulación de B. bassiana; D: T.

peregrinus con esporulación de ILB 205; y E: T.

peregrinus con esporulación de ILB 264.C

E

Inoculación bajo condiciones semicontroladas con las cepas seleccionadas en la etapa anterior:

• Sobre chinches adultas sobre clones de Eucalyptus con hoja adulta, (en maceta, plantas de aprox.

80 cm de altura).

• C/planta dentro de una estructura de voile.

• Localizarán en un invernáculo (solamente para evitar la lluvia).

3. Ensayos de inoculación de T. peregrinus en invernáculo y selección de cepas

• Cada tratamiento (una cepa) se repetirá al menos 2 veces.

• Selección:

- 10 aislamientos más virulentos, pertenecientes a las Clase I y en caso de no ser

suficientes, también a la Clase II.

- Las 10 cepas seleccionadas pasarán a etapa de Bioproducción.

Determinación de LC50 y LT50 de las 10 cepas seleccionadas

• En forma paralela al comienzo de la etapa de Bioprodución.

• Se comparará la virulencia de las 10 cepas seleccionadas determinando para cada una de

ellas la LD50 (concentración letal 50) y LT50 (tiempo letal 50).

Evaluación de patogenicidad y virulencia de las 10 cepas seleccionadas sobre distintos

estadios de desarrollo de T. peregrinus

• Inoculación in vitro con las 10 cepas seleccionadas sobre adultos (igual proporción de machos

y hembras), sobre ninfas en estadio de desarrollo 3 y sobre huevos en caja de Petri.

4. Actividades de Bioproducción

• Fermentación sobre sustrato sólido y líquido (10 cepas seleccionadas) evaluando la producción de

unidades infectivas. Determinación del sistema de producción y selección de un máximo de 2

cepas que pasarán a las siguientes etapas.

• Caracterización fisiológica de las cepas para la optimización de la producción masiva.

• Ajuste de las condiciones para mejorar el rendimiento del sistema de producción.

• Agregado de componentes para la formulación y estudio del incremento de volúmenes de

producción (escalado).

• Formulación y Escalado.

5. Ensayos de inoculación con cepas formuladas y productos comerciales

- Ensayos de inoculación con las cepas formuladas + 2 productos comerciales.

- Sobre plantas en invernáculo.

Finalmente:

Consideraciones para un futuro escalado a campo: lineamientos para el análisis de riesgo y posibles

métodos de aplicación.

A tener en cuenta:

Proyecto INNOVAGRO – FQuim. – INIA:

a partir de una feromona de atracción: ¿potencial uso en forma conjunta con

hongos entomopatógenos bajo el formato de trampa autodiseminante?

Algunas consideraciones sobre los avances presentados

Sobre las colectas:

• Si bien la época de colecta de chinches no fue la ideal, se han aislado varias cepas de entomopatógenos

(Beauveria, Paecilomyces, Verticillium, Lecanicillium, Fusarium ¿?). Verano - Otoño 2014, se realizarán

nuevas colectas.

Sobre los ensayos de inoculación

• El protocolo de inoculación, las condiciones de temp. y HR y la categorización de cepas (en base a su• El protocolo de inoculación, las condiciones de temp. y HR y la categorización de cepas (en base a su

virulencia) utilizada, permite discriminar entre las cepas testeadas.

• La mayoría de las cepas ensayadas fueron patogénicas para T. peregrinus con diferentes grados de

virulencia.

• En general, se obtienen altos % de recuperación de inóculo.

• La mortalidad promedio de los Testigos: al 10mo día ,en base a la totalidad de ensayos es de 14 %

(bibliografía especifica que debe ser menor a 20%).

Agradecimientos

a las empresa Montes del Plata, Weyerhaueser, UPM - Forestal Oriental, a Alejandro Venturino,

Rafael Sosa y Marcelo Fredes y a Juan Andrés San Román (Viplantex – Nemesur) por el apoyo

logístico y por permitirnos la entrada a sus predios.

Muchas gracias

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