gw3965!ja!tnf-αmuuttavat ......3! 2(tumareseptorit(2.1(yleistä((tumareseptorit ovat superperhe!...

GW3965 JA TNF-‐α MUUTTAVAT ANDROGEENIRESEPTORIN

KOHDEGEENIEN ILMENTYMISTÄ ETURAUHASSYÖPÄSOLUISSA

Aleksi Hiltunen Opinnäytetyö

Lääketieteen koulutusohjelma Itä-‐Suomen yliopisto

Terveystieteiden tiedekunta Lääketieteen laitos /

Biolääketiede Syyskuu 2014

ITÄ-‐SUOMEN YLIOPISTO, Terveystieteiden tiedekunta Lääketieteen laitos Lääketieteen koulutusohjelma HILTUNEN ALEKSI: GW3965 ja TNF-‐α muuttavat androgeenireseptorin kohdegeenien ilmentymistä eturauhassyöpäsoluissa Opinnäytetutkielma, 40 sivua Tutkielman ohjaajat: Marjo Malinen FT; Jorma Palvimo prof. Tammikuu 2015 Asiasanat: androgeenireseptori, maksan x –reseptori , eturauhassyöpä, kasvaimen nekroositekijä α, GW3965, androgeeni, tulehdus, kolesteroli Androgeenireseptorin (AR) toiminta on avainasemassa eturauhassyövän synnyssä ja kehittymisessä. Myös elintavat, kuten epäterveellinen ruokavalio, tupakointi ja liikkumattomuus vaikuttavat sairauden syntyyn. Tässä tutkimuksessa selvitettiin tulehduksen ja kolesterolijohdannaisten vaikutusta androgeenireseptorin kohdegeenien ilmentymiseen. Opinnäytetyössä tutkittiin tulehdustekijä TNF-‐α:n (tumor necrosis factor α) ja maksan x –reseptori –ligandin, GW3965:n, vaikutusta AR:n kohdegeenien ilmentymiseen kolmessa eri eturauhassyöpäsolulinjassa yhdessä androgeenin kanssa. Tutkittavina olivat VCaP-‐solut (selkärankametastaasista), LNCaP-‐solut (imusolmukkeesta) ja PC3-‐solut (luumetastaasista). Ensimmäisessä vaiheessa soluja käsiteltiin LXR-‐ligandi GW3965:llä ja R1881 androgeenilla ja toisessa TNF-‐α:lla ja androgeenilla. Vain VCaP ja LNCaP soluja käytettiin LXR-‐kokeessa. Tutkimuksessa soluviljelmiä käsiteltiin mainituilla ligandeilla 16 tuntia jonka jälkeen soluista eristettiin RNA ja tutkittiin lähetti-‐RNA:n määrää RT-‐qPCR (reverse transcription polymerase chain reaction) menetelmällä. Lisäksi tutkittiin LXR:n ilmentymistä VCaP ja LNCaP soluissa western blot –analyysillä. Western blot analyysissä selvisi, että VCaP solut ilmentävät LXR:ä erittäin vähän, kun taas LNCaP soluissa reseptori ilmenee huomattavasti enemmän. LNCaP-‐soluissa GW3965 vähensi AR-‐kohdegeenien ilmentymistä vaikka androgeenia oli läsnä; VCaP soluissa vastaava vaikutusta ei nähty, tai se oli huomattavasti pienempi. TNF-‐α ja androgeeni käsittelyssä VCaP-‐ ja PC3-‐solut reagoivat samankaltaisesti, kun taas LNCaP-‐solut erosivat näistä: VCaP ja PC3-‐soluilla AR:n kohdegeenit joko pysyivät androgeenin indusoimalla tasolla tai nousivat yhteisvaikutuksesta hieman enemmän. LNCaP-‐solulinjassa taas TNF-‐α ja androgeeni -‐yhteiskäsittely vähensi geenien ilmentymistä pelkkään androgeenikäsittelyyn verrattuna.

UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND, Faculty of Health Sciences School of Medicine Medicine ALEKSI HILTUNEN: GW3965 and TNF-‐α change the expression of androgen receptor target genes in prostate cancer cells Thesis, 40 pages Tutors: Marjo Malinen PhD; Jorma Palvimo prof. January 2015 Keywords: androgen receptor, liver X receptor, prostate cancer, tumour necrosis factor α, GW3965, androgen, inflammation, cholesterol Androgen receptor plays a key role in the development and progression of prostate cancer. Life style choices like unhealthy diet, smoking and lack of exercise also contribute to cancer development. In this study the focus was on interplay between inflammation and cholesterols, which also promote prostate cancer. They were studied by examining how tumour necrosis factor α (TNF-‐α) and liver x receptor (LXR) ligand GW3965 affect the gene expression of AR target genes with androgen in three different prostate cancer cell lines. Cell lines used in the study were VCaP cells (from vertebral metastasis), LNCaP cells (from lymph node metastasis) and PC3 cells (from bone metastasis). Two studies were performed: one using LXR ligand GW3965 and androgen, and one with TNF-‐α and androgen as ligands. Only the VCaP and the LNCaP cells were used for the LXR experiment. The cells were treated with the aforementioned ligands for 16h, after which RNA was extracted. The amount of specific messenger RNAs was then measured by using RT-‐qPCR (reverse transcription polymerase chain reaction) analysis. In addition, the expression of LXR in LNCaP and VCaP cells was studied using western blot analysis. The western blot analysis revealed that VCaP cells expressed very little LXR, whereas in LNCaP cells the expression was significantly greater. In LNCaP cells GW3965 reduced AR target gene expression even if androgen was present. In VCaP cells similar effect couldn’t be observed. In the TNF-‐α experiment VCaP and PC3 cells responded similarly whereas LNCaP cells responded differently from these two: In the VCaP and PC3 cells the AR target gene expression either remained on the level induced by androgen treatment or rose slightly when treated with both TNF-‐α and androgen. In the LNCaP cells combined TNF-‐α and androgen treatment reduced AR target gene expression compared to cells treated with only androgen.

1

SISÄLLYSLUETTELO

1 JOHDANTO ................................................................................................................. 2

2 TUMARESEPTORIT ...................................................................................................... 3 2.1 Yleistä ........................................................................................................................................... 3 2.2 Androgeenireseptori, AR .............................................................................................................. 4 2.3 Maksan x -‐reseptori (liver x receptor, LXR) .................................................................................. 6

3 KASVAIMEN NEKROOSITEKIJÄ α (TUMOR NECROSIS FACTOR α , TNF-‐α) ................. 7

4 ETURAUHASSYÖPÄ ..................................................................................................... 9 4.1 Yleistä ........................................................................................................................................... 9 4.2 Esiintyvyys .................................................................................................................................... 9 4.3 Oireet ja etiologia ........................................................................................................................ 9 4.4 AR ja eturauhassyöpä ................................................................................................................. 10 4.5 AR ja LXR eturauhassyövässä ..................................................................................................... 11 4.6 Syöpä ja tulehdus ....................................................................................................................... 12 4.7 TNF-‐α:n yhteys tulehdukseen syövässä ..................................................................................... 13 4.8 Yhteenveto ................................................................................................................................. 14

5 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET ...................................................................................... 15

6 MATERIAALIT JA MENETELMÄT ................................................................................. 16 6.1. Soluviljely ja ligandit .................................................................................................................. 16 6.2 Western blot .............................................................................................................................. 17 6.3 RNA eristys ................................................................................................................................. 18 6.4 RT-‐qPCR (reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction) ................................ 18

7 TULOKSET ................................................................................................................. 21 5.1 Androgeeni ja LXR-‐ligandi käsittely VCaP-‐ ja LNCaP-‐soluille ...................................................... 21

5.1.1 AR:n ja LXR:n ilmentyminen androgeeni-‐ ja GW3965-‐käsittelyllä ...................................... 21 5.1.2 ABC-‐kuljettimien geenin ilmentyminen R1881-‐ ja GW3965-‐käsittelyllä VCaP-‐ ja LNCaP-‐soluissa ......................................................................................................................................... 22 5.1.3 AR-‐kohdegeenien ilmentyminen R1881-‐ ja GW3965-‐käsittelyllä VCaP-‐ ja LNCaP-‐soluissa 23

5.2 Androgeeni ja TNF-‐α käsittely PC3, VCaP ja LNCaP-‐soluille ..................................................... 26 5.2.1 IL-‐6:n ja IL-‐8:n ilmentyminen R1881-‐ ja TNF-‐α-‐käsittelyllä PC3, VCaP ja LNCaP-‐soluissa . 26 5.2.2 AR-‐kohdegeenien ilmentyminen R1881-‐ ja TNF-‐α–käsittelyllä PC3, VCaP ja LNCaP-‐soluissa ..................................................................................................................................................... 27

6 POHDINTA ................................................................................................................ 30 6.1 LXR:n vaikutus AR:in eturauhassyövässä ................................................................................... 30 6.2 TNF-‐α:n vaikutus AR:in eturauhassyövässä .............................................................................. 31 6.3 Yhteenveto ................................................................................................................................. 32

7. LÄHTEET ................................................................................................................... 34

2

1 JOHDANTO

Eturauhasyöpä on teollistuneissa maissa miesten yleisin syöpä, ja diagnosoidut tapaukset

ovat olleet viime vuosina nousussa. Eturauhasen syöpä on varsinkin vanhempien miesten

sairaus. Sairaus on usein piilevä, eivätkä potilaat huomaa syöpää ennen luonnollista

kuolemaansa. Kuitenkin eturauhassyövälle on tyypillistä metastasoitua luihin, jolloin tila

on hyvin vakava ja erittäin kivulias. Elintavat, kuten epäterveellinen ruokavalio, tupakointi

ja liikkumattomuus vaikuttavat sairauden syntyyn. Yksi merkittävimmistä tekijöistä

eturauhassyövän synnyssä ja etenemisessä on mieshormonistimulaatio (Saarelma 2014 ja

Aaltomaa ym. 2014)

Mieshormonit, androgeenit, välittävät vaikutuksiaan androgeenireseptorin (AR) kautta.

AR on tumareseptori joka vaikuttaa suoraan geeniluentaan ja sen kohdegeenit liittyvät

usein solujen kasvuun ja kehitykseen. AR on siksi tärkeä tekijä eturauhassyövässä.

Androgeenien lisäksi AR:n toimintaan saattavat vaikuttavaa monet muutkin solun

molekyylit, kuten tässä tutkimuksessa tarkastellut maksan X -‐reseptori (liver X receptor,

LXR) ja tulehdustekijä kasvaimen nekroositekijä α (tumor necrosis factor α, TNF-‐α). AR:n

toiminnan ymmärtämiseksi eturauhassyövässä on tärkeä selvittää kuinka sen toimintaan

vaikuttavat eturauhasyövän riskitekijöiksi tunnistetut kolesterolijohdannaiset (LXR:n

välityksellä) ja syöpään yhdistetty tulehdus (TNF-‐α).

Tässä opinnäytetyössä tutkittiin LXR-‐ligandi GW3965:n ja TNF-‐α:n vaikutuksia AR:n

kohdegeenien ilmentymiseen eri eturauhassyöpäsoluissa. Lisäksi tarkasteltiin GW3965:n

vaikutusta AR:n ilmentymiseen kahdessa eri eturauhassyöpäsolulinjassa.

3

2 TUMARESEPTORIT

2.1 Yleistä

Tumareseptorit ovat superperhe transkriptiofaktoreita, jotka toimivat solulimassa ja

tumassa vastaanottajamolekyyleinä muun muassa steroidi-‐ ja kilpirauhashormoneille,

retinoidihapoille ja eräille prostaglandiineille. Androgeeni-‐, glukokortikoidi-‐,

mineralokortikoidi-‐ ja estrogeenireseptorit ovat osa tumareseptorien suurperhettä

(Mangelsdorf ym. 1995).

Kaikilla tumareseptoreilla on samankaltainen rakenne. Aminoterminaalisessa päässä on

vaihteleva alue, joka sisältää ensimmäisen transkriptiota aktivoivan, ligandista

riippumattoman, sekvenssin (Wärnmark ym. 2003). Keskellä proteiinia DNA:han

kiinnittyvässä osassa on tumareseptoriperheelle ominainen sinkkisormirakenne (Berg

1989 ja Klug & Schwabe 1995). Sinkkisormia on kaksi ja molemmissa neljä kysteiiniä sitoo

sinkki-‐ionin, mikä saa aikaan tarvittavan sormimaisen konformaation (Luisi ym. 1991 ja

Schwabe ym. 1993). Karboksiterminaalisessa päässä on konservoitunut ligandiin sitoutuva

alue ja toinen transkriptiota aktivoiva alue, jonka toiminta on ligandista riippuvaista

(Wärnmark ym. 2003). Ligandia sitova alue säätelee myös reseptorien hetero-‐ ja

homodimerisaatiota ja vuorovaikutusta lämpöshokkiproteiinien kanssa (Aranda & Pascual

2001). DNA:ta sitovan osan ja ligandia sitovan osan välissä on sarana-‐alue, ”hinge region”,

mikä mahdollistaa reseptorin konformaatiomuutoksen sen aktivoituessa (Mangelsdorf

ym. 1995).

Tumareseptorien toiminta on useimmiten ligandeilla säädeltyä: Rasvaliukoiset ligandeina

toimivat molekyylit diffundoituvat solukalvon läpi ja sitoutuvat yleensä solulimassa

reseptorin ligandia sitovaan alueeseen, mikä saa aikaan konformaatiomuutoksen ja

reseptorin kulkeutumisen tumaan. Tumassa reseptorit sitoutuvat DNA:han

homodimeereinä, heterodimeereinä retinoidi x reseptorin (RXR) kanssa tai

monomeereinä. Samalla ne värväävät koregulaattorimolekyylejä aktivoiden tai hiljentäen

geeniluentaa (Aranda & Pascual 2001 ja Biddie ym. 2010).

Reseptorit sitoutuvat DNA:ssa vaste-‐elementiksi kutsutuille alueille, joiden on aiemmin

uskottu esiintyvän ylävirtaan luettavasta geenistä ja löytyvän läheltä promoottorialuetta.

4

Uudemman tiedon mukaan vaste-‐elementit sijaitsevat todennäköisimmin vahvistaja-‐

alueilla useiden kiloemäksien päässä geenistä (Carroll ym. 2005). Useimpien

steroidihormonireseptorien tunnistama vaste-‐elementti on AGAACAnnnTCTTGT

palindromi, kun taas monet muut tumareseptoreista tunnistavat AG(G/T)TCA sekvenssin.

Soluissa vaste-‐elementeissä on suurta vaihtelua. Tumareseptorit sitoutuvat DNA:han

useimmiten dimeereinä ja nämä tunnistavat vaste-‐elementit pareina: joko palindromeina,

käänteisinä palindromeina tai suorina toistoina. Elementtien välissä voi olla vaihteleva

määrä nukleotidejä (Aranda & Pascual 2001 ja Mangelsdorf ym. 1995).

Tumareseptorit voidaan jakaa neljään ryhmään perustuen niiden dimerisaation ja vaste-‐

elementteihin. Steroidihormonireseptorit, kuten AR, sitoutuvat DNA:han palindromisiin

vaste-‐elementteihin ligandin indusoimina heterodimeereinä. Toiseen ryhmään kuuluvat

reseptorit dimerisoituvat RXR:n kanssa (kilpirauhashormonireseptori, D-‐

vitamiinireseptori, LXR) ja näistä suurin osa kiinnittyy suoriin toistoihin. Kolmannen

ryhmän reseptorit kiinnittyvät suoriin toistoihin dimeereinä (RXR/RXR) ja viimeisen

ryhmän reseptorit tarttuvat monomeereinä yksittäisiin vaste-‐elementteihin (Giguere

1999, Mangelsdorf 1995 ja Aranda & Pascual 2001)

2.2 Androgeenireseptori, AR

Androgeenireseptori on steroidihormonireseptori, jonka ligandeina toimivat

mieshormonit testosteroni ja dihydrotestosteroni. Tärkeimpiä AR:n välittämiä vaikutuksia

ovat miehen sukupuolinen erilaistuminen ja kypsyminen, spermatogeneesi, toissijaisten

miehisten sukupuoliominaisuuksien kehittyminen ja anaboliset vaikutukset lihaksistossa.

AR on myös avaintekijä eturauhassyövän patogeneesissä.

AR:n kohdegeenit liittyvät usein solujen kasvun säätelyyn. Esimerkiksi (insulin-‐like growth

factor binding protein 3:n (IGFBP3) geeniluenta on androgeenisäädeltyä. Proteiini sitoo

insuliininkaltaista kasvutekijää ja säätelee sen vaikutuksia elimistössä. (Cubbage ym. 1990

ja Huang ym. 2013). AR säätelee monien ETS-‐transkriptiofaktoriperheen geenien, kuten

ELK4:n, luentaa. ETS-‐transkriptiofaktorien on todettu vaikuttavan solujen kasvuun ja

erilaistumiseen, solujen vaeltamiseen ja kasvaimien kehittymiseen, ja ne on yhdistetty

5

useisiin syöpiin (Gutierrez-‐Hartmann ym. 2007). Tunnettu AR:n kohdegeeni on

eturauhasen spesifistä antigeeniä (prostate specific antigene, PSA) koodaava KLK3. PSA:n

kohonnut määrä veressä voi kertoa eturauhassyövästä ja sitä käytetään eturauhassyövän

diagnosoinnissa (Balk ym. 2003). FKBP5 on samannimisen AR:n kohdegeenin koodaama

proteiini, joka voi vaikuttaa kasvaimien kehittymiseen ja lääkeaineresistenssiin (Li ym.

2011). Seriiniproteaasia koodaava AR:n kohdegeeni TRMPSS2, ja etenkin sen

mutatoitunut yhdistelmämuoto ERG-‐TRMPSS2, on yhdistetty eturauhassyövän syntyyn,

kasvaimen pahanlaatuisuuteen ja mahdollisesti huonompaan ennusteeseen (Petrovics

ym. 2005 ja Attard ym. 2008). Sekä androgeeniriippumattomat ja androgeeniriippuvaiset

eturauhasyövät usein ilmentävät yhdistelmämuotoa, mutta vain ensimmäinen ilmentää

ylimäärin geenituotetta (Hermans ym. 2006).

AR:n aktiivisuuteen solussa vaikutetaan useilla erilaisilla transkription jälkeisillä

muokkauksilla, kuten fosforylaatiolla, asetylaatiolla, ubikitinaatiolla ja SUMOlaatiolla

(small ubiquitin-‐related modifier, pieni ubikitiinin kaltainen säätelijä). SUMOlaatiossa AR:n

kiinnitetään reversiibelisti kovalentilla sidoksella pieni noin 100 aminohapon mittainen

ubikitiinin kaltainen säätelijäproteiinin (van der Steen ym. 2013). Ihmisillä esiintyy neljää

eri SUMO proteiinia: SUMO1-‐SUMO4. Näistä SUMO1, -‐2 ja -‐3 esiintyvät yleisesti koko

kehossa, kun taas SUMO4:ää löytyy lähinnä munuaisista, pernasta ja imusolmukkeista

(Geiss-‐Friedlander & Melchior 2007) Kuitenkin SUMO4:n rooli on toistaiseksi epäselvä,

sillä se ei ilmeisesti pysty esiintymään aktiivisessa (kypsässä) muodossaan (Owerbach ym.

2005). SUMO2 ja -‐3 ovat 97 % identtisiä, eikä niitä pystytä erottamaan nykyisillä vasta-‐

aineilla, joten niihin viitataan yhteisnimellä SUMO2/3 (Saitoh & Hinchey 2000).

Androgeenireseptorissa on kaksi mahdollista SUMOlaatiopaikkaa: lysiinit 386 ja 520.

SUMOlaatio muuttaa reseptorin tumaan kulkeutumisen, transkription, DNA:n

monistumisen ja korjauksen, solusyklin ja apoptoosin säätelyä (van der Steen ym. 2013).

Androgeenikäsittely voi vaikuttaa AR:n SUMOlaation ja sitä kautta reseptorin

aktiivisuutteen ja lokalisaatioon solussa (Rytinki ym. 2012)

6

2.3 Maksan x -‐reseptori (liver x receptor, LXR)

LXR on tumareseptori, jonka ligandeina toimivat kolesterolijohdannaiset oksisterolit

(Janowski ym. 1996) ja se heterodimerisoituu aktivoituessaan RXR:n kanssa. (Willy ym.

1995). LXR esiintyy ihmisessä α-‐ ja β-‐muodoissa, jotka ovat 80% identtiset, vaikka niiden

geenit sijaitsevat eri kromosomeissa (Williams 2003 ja Nuclear Receptor Signaling Atlas

2014). β-‐muotoa esiintyy tasaisesti lähes kaikkialla kehossa, kun taas α-‐muotoa on

lähinnä maksassa, rasvassa, munuaisissa, sukusoluissa, suolistossa ja makrofageissa

(Nuclear Receptor Signaling Atlas 2014).

LXR-‐α:n on osoitettu olevan yhteydessä kolesterolihomeostasiaan: LXR-‐α poistogeenisten

hiirten kolesteroliaineenvaihdunta on häiriintynyt ja ne kärsivät kolesteroliestereiden

kertymisestä maksaan. Reseptori lisää kolesterolia solusta poistavien kuljettimien ABCA1

ja ABCG1 ilmentymistä, säätelee kolesterolin poistumista maksassa edistämällä

sappihapposynteesin ”rate limiting” – entsyymin CYP7A1:n ilmentymistä (Peet ym. 1998),

lisää LDL-‐reseptorien hajottamista edistävää IDOLin (Inducibel degradeg of the LDLR)

ilmentymistä (Zelcer ym. 2009) ja saattaa vähentää kolesterolin de novo –synteesiä

(Alberti ym. 2001). LXR vaikuttaa kolesteroli-‐ ja lipidiaineenvaihdunnan lisäksi

steroidisynteesiin, glukoositasapainoon ja tulehdus-‐ ja immuunireaktioihin (Viennois ym.

2011). Solunsisäisen kolesterolin väheneminen johtaa androgeenituotannon

hidastumiseen (de Boussac ym. 2013). On myös osoitettu että LXR säätelee androgeeneja

deaktivoivan sulfotransferaasin SULT2A1:n toimintaa (Ou ym. 2014). Lisäksi on viitteitä

androgeenireseptorin ja LXR:n välisestä koaktivaattorikilpailusta. (Krycer & Brown 2011)

7

3 KASVAIMEN NEKROOSITEKIJÄ α (TUMOR NECROSIS FACTOR α, TNF-‐α)

TNF-‐α on makrofagien erittämä tulehdussytokiini, joka säätelee useiden signaalireittien

kautta solujen nekroosia ja apoptoosia (Idriss & Naismith 2000). Se kuuluu TNF-‐

superperheen ligandeihin yhdessä lymfotoksiinin (LT), RANKL:n (Receptor activator of

nuclear factor kappa-‐β) ja 17 muun ligandin kanssa (Gruss & Dower 1995). TNF-‐α:n

reseptorit kuuluvat reseptorisuperperheeseen, joka sisältää reseptorit muun muassa

edellä mainituille ligandeille. Yhdessä nämä muodostavat TNF-‐superperheen, johon

kuuluu 19 ligandia ja 29 reseptoria (Locksley 2001 ja Gruss & Dower 1995).

TNF superperheen ligandeilla on kaksi muotoa: transmembraaninen muoto ja katkaistu

vesiliukoinen muoto (Beyaert & Fiers 1994 ja Watts ym. 1997). Ligandit toimivat

symmetrisenä hydrofobisesti muodostuvana trimeerinä, joka sitoo reseptoritrimeerin,

kukin ligandin alayksikkö yhden reseptorin alayksikön aktiiviselle alueelle.

Reseptorimolekyyleillä ei ole keskinäisiä sidoksia, vaan liganditrimeeri sitoo reseptorit

toimivaan muotoonsa (Eck & Sprang 1989 ja Banner 1993). Uudemmat tutkimukset tosin

viittaavat siihen, että ainakin jotkin reseptoreista, kuten FAS, TNFR1 (tumor necrosis

factor receptor 1) ja TNFR2, voivat muodostaa trimeerejä itsenäisesti (Chan ym. 2000).

Perheen ligandit ovat 25-‐30% identtisiä; Niiden konservatiivisuus rajoittuu pääasiassa

peptidien hydrofobisiin aminohapoihin, mikä mahdollistaa trimerisaation ja edesauttaa

reseptoriselektiivisyyttä (Locksley ym. 2001). Iso osa perheen ligandeista voi kuitenkin

kiinnittyä useisiin eri reseptoreihin (Hehlgans & Pfeffer 2005)

TNF-‐superperheen reseptorit ovat tyypin yksi transmembraaniproteeiineja, jotka

sisältävät runsaasti perheelle tyypillisiä kysteiinirikkaita alueita (cystein rich domain, CRD).

Alueet mahdollistavat reseptorien pitkänomaisen tikapuumaisen konformaation.

Runsaskysteiiniset alueet koostuvat 40 aminohapon pseudotoistoista, joissa on kolme

kuudesta kysteiinistä muodostuvaa konservatiivista disulfidisiltaa (Smith ym. 1994). Kuten

ligandi, myös jotkin reseptorit esiintyvät kalvosidonnaisen muodon lisäksi myös

katkaistuna liukoisena muotona. Myös liukoinen muoto sitoo ligandia ja toimii sen

inhibiittorina ja puskurimolekyylinä, joka hidastaa ligandin puoliintumisaikaa ja tasaa

konsentraatiopiikkejä (Hehlgans & Männel 2002)

8

TNF-‐reseptorit välittävät viestejä kahden signaalireitin kautta: reseptorin soluliman

puoleisessa hännässä voi olla joko sitoutumispaikka TNF-‐reseptoriin kytkeytyneille

tekijöille (TNF receptor associated factors, TRAF) tai niin sanottu kuolon alue (Death

domain, DD). TRAFit toimivat adapteri-‐proteiineina, jotka välittävät viestin reseptorilta

fosforylaatiokaskadiin ja edelleen transkriptiotekijöille, tumatekijä NFκB:lle ja

aktivaattorirproteiini-‐1:lle (AP1). DD:t värväävät reseptorien aktivoituessa adaptereita,

kuten Fas-‐kytkettyjä DD (FADD) proteiineja tai TNFR-‐kytkettyjä DD proteiineja (TRADD),

jotka johtavat edelleen kaspaasi-‐8 tai kaspaasi-‐10 aktivaatioon ja apoptoosiin (Fesik 2000

ja Inoue ym. 2000).

TNF-‐α:lla on kaksi reseptoria, TNFR1 ja TNFR2, joista TNFR1 esiintyy tasaisesti ympäri

kehoa ja TNFR2 lähinnä hematopoieettisissa soluissa. TNFR1 sitoo TNF-‐α:n liukoista

muotoa ja TNFR2 kalvosidonnaista muotoa (Balkwill 2006).

TNF-‐α on merkittävä tekijä immuuni-‐ ja tulehdusreaktioissa. Bakteerien patogeenit ja

muut haitalliset aineet stimuloivat TNF-‐α:n vapautumista Toll-‐like reseptorien (TLR)

kautta. TNF-‐α:n tuotanto on tärkeässä osassa kemokiineihin, sytokiineihin ja solujen

välisiin liitoksiin vaikuttavassa kaskaadissa, joka värvää ja aktivoi lymfosyyttejä,

neutrofiilejä ja makrofageja tulehduspaikalle (Locksley ym. 2001).

Siirtogeeniset hiiret, joiden TNF-‐α tuotantoa on lisätty sairastuvat villityypin hiiriä

todennäköisemmin kakeksiaan, niveltulehduksiin, tulehduksellisiin suolistosairauksiin.

(Kontoyiannis ym. 1999). Kontrolloimaton TNF-‐α tuotanto aiheuttaa auto-‐

immuunisairauksia ja kroonisia tulehduksia: monissa sairauksissa, kuten artriitissa ja

Crohnin taudissa, on todettavissa paikallinen TNF-‐α -‐säätelyn häiriö ja hoitona useimmille

potilaille toimii TNF-‐α -‐agonisti (Buchan ym. 1988 ja Reich ym. 2005).

9

4 ETURAUHASSYÖPÄ

4.1 Yleistä

Eturauhassyöpä on miesten yleisin syöpä. Eturauhassyöpä on lähes aina eturauhasen

epiteelisolujen pahanlaatuisesta liikakasvusta johtuva adenokarsinooma. Sitä ei tule

sekoittaa eturauhasen hyvänlaatuiseen liikakasvuun, joka voi aiheuttaa lääketieteellisiä

ongelmia, muttei ole yhtä vakava tila kuin syöpä, eikä kehity sellaiseksi. Diagnosoitujen

tapausten määrä on noussut 2010-‐luvulle asti, mikä ei luultavasti johdu syövän määrän

kasvusta vaan parantuneesta diagnostiikasta (Cancer Research UK, 2014). Suomessa

tapauksia todetaan noin 4700 vuodessa. Syöpä on erityisesti vanhempien miesten sairaus

ja suurempi osa sairastuneista kuolee syövän kanssa kuin itse syöpään (Saarelma 2014).

Eturauhassyöpä voi metastasoida luihin, jolloin tila on vakava ja kivulias (American Cancer

Society, 2014). Pelkästään Yhdysvalloissa eturauhassyövästä johtuvien kulujen arvioitiin

olevan yli 9,8 miljardia vuonna 2006 ja niiden odotetaan tulevaisuudessa nousevan, ellei

uusia tehokkaampia hoitomuotoja ja -‐strategioita kehitetä (Roehrborn & Black 2011).

4.2 Esiintyvyys

Eturauhassyöpää esiintyy yleisimmin teollistuneissa maissa ja se on pääasiassa

ikääntyneiden miesten sairaus: sairastuneiden keski-‐ikä on 70 vuotta. (Center ym. 2012 ja

Suomen Syöpärekisteri 2014). Yli 50-‐vuotiaista 30 prosenttia ja yli 80-‐vuotiaista 80

prosenttia sairastaa eturauhassyöpää piilevänä ja ainoastaan histologisesti todettavana.

Kymmenys näistä syövistä kehittyy kliiniseksi (Jemal ym. 2005 ja Breslow ym. 1977).

Vuonna 2012 miehillä Suomessa todetuista syövistä noin 30% oli

eturauhassyöpätapauksia ja eturauhassyöpään kuoli 855 miestä (Suomen Syöpärekisteri

2014).

4.3 Oireet ja etiologia

Eturauhassyöpä on yleensä hitaasti kehittyvä sairaus ja sen oireet muistuttavat varsinkin

taudin alussa eturauhasen hyvänlaatuista liikakasvua; virtsaamisoireet ja vähävirtsaisuus

10

ovat usein ensimmäisiä merkkejä eturauhassyövästä. Syövän yhteydessä voi esiintyä

myös verivirtsaisuutta, mikä ei liity eturauhasen hyvänlaatuiseen liikakasvuun. Joskus

pitkää piilevänä kehittyneen eturauhasyövän ensimmäiset oireet ovat luumetastaaseista

johtuvat luukivut tai luun poikkeava murtuminen (Saarelma 2014 ja Aaltomaa ym. 2014)

Eturauhassyövän on osoitettu olevan osittain perinnöllistä: Pakkasen ym. vuonna 2007

julkaistussa tutkimuksessa havaittiin eturauhassyövän resessiivistä periytymistä

suomalaissuvuissa. Kuitenkin ulkoisilla syillä on suurempi vaikutus syövän syntyyn kuin

perintötekijöillä (Lichtenstein ym 2000). Rasvaisen ruuan ja lihan syönnillä voi olla

eturauhassyövän syntyä edistäviä vaikutuksia (Hori ym. 2011), sillä rasvankäytöstä

johtuva androgeenitasojen nousu saattaa edistää eturauhassyövän syntyä. Myös

lihavuuden on todettu edistävän syövän patogeneesiä (Saarelma 2014). Tupakointi lisää

mahdollisesti eturauhassyövän aggressiivisuutta ja etenemistä (Zu ym. 2011.) Myös

eturauhasen tulehdustilojen on havaittu edistävän syövän syntyä (Dennis ym. 2002).

4.4 AR ja eturauhassyöpä

Enemmistö eturauhassyövistä on ainakin taudin alkuvaiheessa androgeeniriippuvaisia: ne

tarvitsevat mieshormonistimulaatiota kasvaakseen. Eturauhassyövän hoitoon käytetään

sädehoidon ja kemoterapian lisäksi androgeeniablaatiota, jossa androgeenivaikutuksia

estetään hormoneilla tai kastraatiolla. Androgeeniablaatio on kuitenkin usein vain

väliaikainen ratkaisu, sillä eturauhassyöpä kehittyy ennen pitkää

androgeeniriippumattomaksi ( McCarty ym. 2014). AR-‐geeni voi monistua tai reseptori voi

mutatoitua moniin ligandeihin sitoutuviksi tai ligandeista riippumattomiksi jatkuvasti

aktiivisiksi muodoiksi, jolloin AR-‐antagonistihoidot menettävät tehonsa (Taplin ym. 2003,

Edwards ym. 2003, Richards 2012 ja Hay & McEwan 2012). Myös useiden kasvutekijöiden,

sytokiinien ja tyrosiinikinaasien on osoitettu stimuloivan AR:a ilman androgeenivaikutusta

tai herkistävän reseptorin huomattavasti fysiologisesti merkittäviä androgeenipitoisuuksia

pienemmille mieshormonimäärille (Sharifi 2013). Samanlaisia vaikutuksia voi olla myös

transkription koaktivaattoreiden, kuten SRC-‐1:n ja SRC-‐2:n, määrän kasvulla (Gregory ym.

2001). Kinaasit voivat fosforyloida koaktivaattoreita ja korepressoreita vaikuttaen AR:n

aktivoimaan geeniluentaan. Kasvutekijät voivat saada aikaan AR:n fosforylaatiota, mikä

11

mahdollistaa sen toiminnan vähäisissä androgeenipitoisuuksissa (Guo ym. 2006). Näistä

syistä eturauhassyöpä voi muuttua hyvin aggressiiviseksi ja hoitoon vastaamattomaksi.

4.5 AR ja LXR eturauhassyövässä

Kuten aikaisemmin mainittiin LXR voi vaikuttaa androgeenien toimintaan solussa useilla

tavoilla: Reseptori vähentää aktivoituessaan solunsisäistä kolesterolia, mikä johtaa

androgeenituotannon vähenemiseen, se säätelee SULT2A1:n toimintaa ja kilpailee

samoista koaktivaattoreista AR:n kanssa. LXR:n kolesterolivaikutukset vaikuttavat myös

lipidilauttojen määrän kautta: kolesterolirikkaat lautat ovat olennainen osa Akt-‐

fosforylaatioketjun aktivoinnissa, mikä taas edistää kasvainten selviytymistä (Zhuang L.

ym. 2002). Kolesterolihomeostasia voi olla juurikin tästä syystä tärkeä osa

eturauhassyövän patogeneesia ja LXR-‐ligandit voisivat olla yksi tapa vaikuttaa

eturauhasyövän kehitykseen.

LXR myös rajoittaa syöpäsoluille tyypillistä tulehdusta soluissa ja niiden ympärillä

(Vendramini-‐Costa DB ym. 2012) inhiboimalla interleukiini 6:ta (IL-‐6), typpioksidisyntaasia

(iNOS, inducible nitric oxide synthase) ja syklo-‐oksigenaasi 2:ta (COX-‐2) (de Boussac H ym.

2013), ja johtaa solusyklin pysähtymiseen lisäämällä p27:n, solusyklin pysäyttäjän,

ilmentymistä (Fukuchi J ym. 2004)

12

4.6 Syöpä ja tulehdus

Syövän ja tulehduksen välillä on selvä yhteys: Kasvainalueilla ja niitä ympäröivässä

stroomassa on runsaasti leukosyyttejä ja muita tulehdukseen liittyviä soluja, jotka voivat

edistää kasvaimen kehittymistä (Negus ym. 1997 ja Mantovani ym. 2004). Monet

krooniset tulehdus-‐ ja autoimmuunisairaudet lisäävät syövän riskiä ja monista syövistä

löytyy runsaasti tulehdustekijöitä (Ekbom ym. 1990, Burke ym. 1996 ja Luboshits ym.

1999). Lisäksi tiedetään tulehduskipulääkkeiden pitkäaikaisen käytön vähentävän

suolistosyöpään kuolleisuutta (Koehne ym. 2004). TNF-‐α:n on havaittu edistävän

kasvaimien pahanlaatuisuutta ja leviämistä (Balkwill & Mantovani 2001).

KUVA 1. LXR voi vaikuttaa androgeenitoimintaan soluissa. a. AR:n ja LXR:n välinen koaktivaattorikilpailu voi vähentää AR:n kohdegeenien ilmentymistä. b. LXR säätelee androgeeneja deaktivoivan SULT2A1:n toimintaa. c. LXR on tärkeä solunsisäisen kolesterolin säätelijä ja solunsisäisen kolesterolin aleneminen voi hidastaa androgeenisynteesiä.

B

C

A

13

4.7 TNF-‐α:n yhteys tulehdukseen syövässä

TNF-‐α vaikuttaa eri tavoin syövän syntyyn ja kehitykseen. Hiirillä

lipopolysakkaridistimulaatiolla aikaansaatu TNF-‐α:n tuotannon lisääntyminen suolen

adenokarsinooman keuhkoetäpesäkkeessä edisti syövän kasvua ja selviytymistä (Luo ym.

2004). Toisaalta TNFR1 poistogeeniset hiiret ovat vastustuskykyisiä paksusuolensyövän

leviämiselle maksaan (Kitakata ym. 2002).

Kohonnut TNF-‐α-‐pitoisuus veressä on yhdistetty useisiin syöpiin, kuten munasarja-‐, rinta-‐,

virtsarakko-‐, suolisto-‐ ja eturauhassyöpään (Balkwill 2002). Pfitzenmaierin ym. vuonna

2003 tekemässä tutkimuksessa eturauhassyöpäpotilailla, joilla sairaus on edennyt pitkälle

ja ennuste on huono, veren TNF-‐α-‐tason on havaittu olevan koholla. Tutkimuksessa

huomattiin myös TNF-‐α-‐tason korreloivan veren IL-‐8 (interleukiini 8) pitoisuuden kanssa.

On myös nähty yhteys kohonneen veren TNF-‐α-‐ ja IL-‐6-‐pitoisuuden ja eturauhassyövän

edenneisyyden välillä (Michalaki ym. 2004). Monet syöpäsolulinjat erittävätkin pieniä

määriä TNF-‐α:a ja muita sytokiinejä ja kemokiineja, mikä ylläpitää epänormaalia NFκB-‐

toimintaa ja edistää solun kasvua ja selvitymistä (Lu & Stark 2004).

Munasarjasyöpätutkimuksessa on huomattu, että vain malignit solut pystyvät erittämään

TNF-‐α:a ja että TNF-‐α:n geeni ilmentymisessä on eroja tavallisten solujen ja syöpäsolujen

välillä (Szlosarek ym. 2006). TNF-‐α:n voi edistää varsinkin androgeeniriippumattoman

eturauhassyövän kasvua. IL-‐6:n ja IL-‐8:n AR:a stimuloivan vaikutuksen mekanismiksi on

ehdotettu tyrosiinikinaasisingnalointia ja siihen on pyritty vaikuttamaan eri lääkeaineilla,

mikä on toistaiseksi osoittautunut toimimattomaksi (Sharif 2013).

Krooninen TNF-‐α tuotanto kasvaimessa tai sitä ympäröivässä stroomassa voi suoraan

vahingoittaa DNA:ta, edistää solunjakautumista ja haitata apoptoosia, välittää kasvaimen

ja strooman välisiä vuorovaikutuksia auttaen kasvaimen leviämistä, ja edistää sytokiinien,

kemokiinien ja matriksin metalloproteaasien tuotantoa. TNF-‐α voi myös edistää

kasvutekijöiden, kuten TGF-‐β:n (transforming growth factor beta) ja VEGF:n (vascular

endothelial growth factor), toimintaa ja johtaa sitä kautta kasvainten kehittymiseen

(Balkwill 2006).

14

4.8 Yhteenveto

TNF-‐α ja GW3965 vaikuttavat syöpäsolujen ja androgeenireseptorin toimintaan monien

reittien kautta. TNF-‐α voi edistää syövän kasvua indusoimalla tulehdusta ja LXR

mahdollisesti hankaloittaa syöpäsolujen selviytymistä ehkäisemällä

androgeenivaikutuksia. Onkin aiheellista selvittää miten nämä molekyylit muokkaavat

eturauhassyöpäsolun kasvua ja AR:n kohdegeeni-‐ilmentymistä. Lisäksi tutkimus voi antaa

arvokasta lisätietoa kolesterolin ja tulehduksen vaikutuksista eturauhassyöpään.

KUVA 2. Sytokiinit, kasvutekijät, koaktivaattorit ja androgeenit vaikuttavat AR:n aktivaatioon (Dutt ja Gao 2009)

15

5 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET

Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää miten GW3965 ja TNF-‐α vaikuttavat

androgeenireseptorin kohdegeenien ilmentymiseen eturauhassyöpäsoluissa. Lisäksi

selvitimme Western blot -‐menetelmällä LXR:n määrää VCaP-‐ ja LNCaP-‐soluissa ja onko

GW3965:llä vaikutusta AR:n ilmenemiseen näissä soluissa.

16

6 MATERIAALIT JA MENETELMÄT

6.1. Soluviljely ja ligandit

VCaP-‐solut ovat ihmisen eturauhassyöpäsoluja (VCaP ATCC CRL-‐2876), jotka ovat peräisin

selkärangan etäpesäkkeestä. Linja ilmentää erittäin runsaasti AR:ia. Kasvatusliuoksena

käytettiin DMEM:iä (Dulbecco’s modified eagle medium), jossa on 10% lehmän sikiön

seerumia (fetal bovine serum, FBS) ja antibiootteja.

LNCaP-‐solut (ATCC CRL-‐1740) ovat imusolmukkeen etäpesäkkeestä vuonna 1977 kerättyjä

eturauhassyöpäsoluja. Solut ovat fibroblastien kaltaisia, androgeenisensitiivisiä ja

ilmentävät LXR:ää (Horoszewicz ym. 1983). Kasvatusliuoksena soluille käytettiin DMEM:iä,

jossa oli antibiootteja ja 10 % FBS:ää.

PC3-‐solut (ATCC CRL-‐1435) ovat ihmisen luumetastaasista kerättyjä eturauhasyöpäsoluja.

Solut eivät normaalisti ilmennä AR:ia (Kaighn ym. 1979). Tässä tutkimuksessa käytettiin

kahta aikaisemmin luotua linjaa: villityypin AR:lla ja sen SUMOlaatioalueilta

mutatoituneella androgeenireseptorilla transfektoituja soluja. (Kaikkonen ym. 2013).

Soluja kasvatettiin Nutrient Mixture F-‐12 (Dulbeco) kasvatusliuoksessa, johon oli lisätty

10% FBS:ää ja antibiootteja.

Kokeisiin solujen annettiin kiinnittyä vuorokausi 6-‐kuoppalevylle, minkä jälkeen niille

vaihdettiin koemedium, jossa ei ollut antibiootteja ja jossa FBS oli korvattu

aktiivihiilisuodatetulla FBS:llä hormonivaikutusten poissulkemiseksi. LNCaP-‐solut

maljattiin suoraan koemediumiinsa. Ligandit laitettiin soluille kaksi vuorokautta mediumin

vaihdon jälkeen. LXR:n ligandina käytettiin GW3965 hydrokloridia (Sigma-‐Aldrich)

pitoisuudella 10µM. AR:n ligandina käytetään synteettistä agonistia, R1881:a

(metyylitrienoloni, Strealoids), josta käytettiin 10 nM ja 0,1 nM loppupitoisuutta. Ihmisen

TNF-‐α oli lahja professori Claude Libertiltä (Ghent University). Siitä käytettiin

loppupitoisuutta 1000 U/ml. Kaikki ligandikäsittelyt olivat 16 tunnin pituisia. Eri

ligandikäsittelyt ilmenevät taulukosta 1.

17

Taulukko 1. Solujaot ja käsittely qPCR:ä varten

Solulinja Soluja/kuoppa Käsittely

VCaP 500 000 DMSO, R1881 (R) 10 nM, GW 1 µM, GW 10 µM, R+GW 1 µM, R+GW 10 µM

VCaP 500 000 DMSO, R 10 nM, TNFα 1000 U/ml, R + TNFα

LNCaP 400 000 DMSO, R 10 nM, GW 10 µM, R+GW 10 µM

LNCaP 400 000 DMSO, R 10 nM, TNFα 1000 U/ml, R + TNFα

PC-‐3 400 000 DMSO, R 10 nM, TNFα 1000 U/ml, R + TNFα

VCaP 500 000 DMSO, R 0,1 nM, TNFα 1000 U/ml, R + TNFα

6.2 Western blot

Western blot –kokeessa kustakin käsittelystä oli kaksi rinnakkaisnäytettä. Solut kerättiin

1xPBS liuokseen, jossa oli 20 mM NEM ja 1xPIC (protease inhibitor coctail). Solut

sentrifugoittiin ja suspensoitiin 1xSDS näytepuskuriin, jossa oli 20mM NEM ja 1xPIC.

Näytteisiin lisättiin 5µl β-‐merkaptoetanolia. Kokeessa käytettiin Mini-‐PROTEAN II Dual

Slab Cell (BIO-‐RAD) – laitteistoa. Ylägeeli oli 4% ja ajogeeli 7.5%,

Näytteet siirrostettiin ajon jälkeen geeliltä nitroselluloosamembraanille. Vasta-‐aineena

käytettiin 1:1000 anti-‐LXR, 1:10000 anti-‐AR ja 1:5000 anti-‐tubuliini (SC-‐5286, Santa Crus)

vasta-‐aineita. Anti-‐LXR vasta-‐aine oli lahja Eckardt Treuterilta Karoliinisesta instituutista

(Jakobsson ym. 2009), ja anti-‐AR vasta-‐aineena käytettiin aiemmin valmistettua

polyklonaalista jäniksen seerumin AR-‐vasta-‐ainetta (Karvonen 1997). Sekundäärivasta-‐

aineina käytettiin Anti-‐mouse DyLight 680 conjugate (Thermo Scientific) ja Anti-‐rabbit

HRP conjugate (Life technologies). AR-‐ ja LXR-‐vasta-‐aineet kuvannettiin X-‐OMAT 1000

kehityskoneella (Kodak) ja tubuliini kuvannettiin Odyssey IR-‐kuvantamislaitteella (LI-‐COR

Biosciences).

18

6.3 RNA eristys

RNA-‐eristys tehtiin TriPure Isolation -‐reagenssillä (Roche, Saksa) valmistajan ohjeen

mukaan. Solut lyysattiin suoraan 6-‐kuoppalevyille PBS-‐pesun jälkeen. Eristyksen jälkeen

RNA mitattiin NanoDrop ND-‐1000 –laitteella (NanoDrop, USA). Mittauksen perusteella

cDNA synteesiin otettiin templaatiksi 1n µg RNA:ta.

6.4 RT-‐qPCR (reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction)

Kaksivaiheisessa RT-‐qPCR-‐menetelmässä RNA:sta monistetaan ensin erikseen cDNA:ta

käänteiskopioijaentsyymin avulla. cDNA-‐synteesin käytettiin cDNA-‐synteesi kittiä (Roche,

Saksa) valmistajan ohjeen mukaan. qPCR menetelmä perustuu lämpimässä toimivaan

DNA-‐polymeraasi entsyymin käyttöön kuten kaikki muutkin PCR menetelmät. PCR-‐laite

monistaa DNA:ta syklisesti vuorottelemalla denaturaatiota, jossa DNA:n kaksoiskierre

aukeaa, anniilausta, jossa spesifisesti valitut alukkeet kiinnittyvät DNA:han ja

elongaatiota, jossa DNA-‐polymeraasi monistaa DNA:ta valittujen alukkeiden kohdalta.

QPCR:ssä reaktioseoksessa käytettään fluoresoivaa väriä, joka aktivoituu kiinnittyessään

DNA:han. QPCR laite mittaa fluoresenssin määrä, mistä saadaan selville DNA:n

suhteellinen määrä. Tutkimuksessa käytettiin epäspesifisiä värejä, jotka kiinnittyvät

kaikkiin DNA-‐pätkiin. qPCR laite mittaa fluoresenssi jokaisen syklin jälkeen ja näin saadaan

tietää monistuvan DNA:n määrä (Heid CA ym. 1996).

Tutkimuksessa käytettiin LightCycler 480 Instrument II:ta (Roche, Saksa). Reaktioseos oli

tilavuudeltaan 10 µl, josta 4 µl oli cDNA:ta, 5 µl LightCycler 480 SYBR Green I Master

(Roche, Saksa) ja 1 µM tutkittavan geenin alukesekoitusta. Käytetty PCR-‐ohjelma ilmenee

taulukosta 2 ja käytetyt alukkeet nähdään taulukosta 3.

19

Taulukko 2. qPCR-‐ohjelma

qPCR

Denaturaatio 10 min 95°C

Monistus 40x 20 s 95°C

20 s 58°C

20 s 72°C

Pidennysvaihe 10 min 72°C

Sulamiskäyräanalyysi 1x 1 min 95°C

jäähdytys 40°C

lämmitys 95°C

VCaP-‐solujen LXR-‐ ja TNF-‐α-‐koe ja LNCaP-‐solujen TNF-‐α -‐koe ajettiin 40x monistusvaiheella. Muihin kokeisiin lisättiin 5 kierrosta joidenkin geenien matalan ilmentymisen takia.

20

Taulukko 3. qPCR:ssä käytetyt alukkeet

Geeni yläjuoste 5’-‐3’ alajuoste 5’-‐3’

ABCA1 TGTCCAGTCCAGTAATGGTTCTGT CGAGATATGGTCCGGATTGC

ABCG1 TGTTCGCGGCCCTCAT CCTTCAGGCTGTACCAGTAGTTC

β-‐Akt CTGGAACGGTGAAGGTGACA AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA

C116orf80 TGATGCCTGCCTTGATGGAG GTGGTAGTGGGGTGCGTTC

C1orf116 CCATCTCTGCCCTTTGAAAC GAAGTGAACAATGTCCCAAGC

CLDN8 CGTGAGGCAGGCTAACATCA AGCAGCACACATCAGTCCTC

DUSP1 GTCTTCTTCCTCAAAGGAGG GGTACAGAAAGGGCAGGATT

EFEMP1 CTAACACCAGAGAACCGATG CAGGACTTGTTTGTCGTAGG

ERG CGCAGAGTTATCGTGCCAGCAGAT CCATATTCTTTCACCGCCCACTCC

FKBP5 AAAAGGCCAAGGAGCACAAC TTGAGGAGGGGCCGAGTTC

FOSL2 ACCATCAACGCCATCACGAC ACGCTTCTCCTCCTCTTCAG

GAPDH TGGGGAAGGTGAAGGTCGG TCTCAGCCTTGACGGTGCC

IGFBP3 AAGTTGACTACGAGTCTCAG AATCAGTTCACCACAAACAGA

IGFBP5 GAAGGACCGCAGAAAGAAGC GTCCACGCACCAGCAGATG

IL-‐6 CCACACAGACAGCCACTCACCTC CTGGCTTGTTCCTCACTACTCTC

IL-‐8 GACAAGAGCCAGGAAGAAAC TCCACTCTCAATCACTCTCA

IκBα CACTTAGCCTCTATCCATGG ACACCAGGTCAGGATTTTGC

KLK2 AGAAGAATAGCCAGGTCTGG GCTTTGATGCTTCAGAAGGC

LRIG1 GAAGGCCTACCTTTCCTTAG CTTACAGGAAGCTGGGTGAT

MYC GACACCGCCCACCACCAG CGCCTCTTGACATTCTCCTC

PSA GGCAGGTGCTTGTGGCCTCTC CACCCGAGCAGGTGCTTTTGC

RASD1 CACAGGAGACGTTTTCATCC TGTTCTTCTTGGCCGAGAT

RPL13A GTCAAATAGGCCAGGGAAGTCA AGGGCAACAATGGAGGAAGG

S100P ATGACGGAACTAGAGACAGCC AGGAAGCCTGGTAGCTCCTT

SREBP GGAGCCATGGATTGCACTTT GTCAAATAGGCCAGGGAAGTCA

SPOCK2 GCGGCAAGATCAAGCACT TGATTGTCCTCCCAGCTCTT

TMPRSS2 CCTCTGGTCACTTCGAAGAAC GTAAAACGACGTCAAGGACG

TNSF10 CCTCAGAGAGTAGCAGCTCACA CAGAGCCTTTTCATTCTTGGA

21

7 TULOKSET

5.1 Androgeeni ja LXR-‐ligandi käsittely VCaP-‐ ja LNCaP-‐soluille

5.1.1 AR:n ja LXR:n ilmentyminen androgeeni-‐ ja GW3965-‐käsittelyllä

KUVA 3. a. AR:n ja b. LXR:n ilmeneminen androgeeni-‐ ja GW3965-‐käsittelyllä. Kummatkin solulinjat, VCaP ja LNCaP, käsiteltiin samoin: DMSO-‐käsittelyä käytettiin kontrollina, 10nM R1881-‐käsittely, 10 µM GW3965-‐käsittely ja yhteiskäsittely edellä mainituilla pitoisuuksilla.

LXR:n ilmentymisen tutkimiseksi LNCaP-‐ ja VCaP-‐soluissa tehtiin GW3965-‐ ja R1881-‐

käsitellyille soluille western blot –analyysi. Samalla selvitettiin LXR-‐ligandin vaikutusta

AR:n ilmenemiseen.

LNCaP-‐soluissa molemmat AR ja LXR ilmentyivät paremmin kuin VCaP-‐soluissa. LNCaP-‐

soluissa AR ilmentyi huomattavasti enemmän R1881(R)-‐käsitellyssä näytteessä kuin

DMSO-‐käsitellyssä näytteessä. GW3965-‐käsittelyllä AR ilmentyi vähemmän kuin DMSO-‐

käsittelyllä kun taas yhteiskäsittelyllä AR ilmentyi vähemmän kuin pelkällä R-‐käsittelyllä.

VCaP-‐soluissa AR ilmentyi lähes yhtä paljon kaikilla käsittelyillä ja soluissa näkyvät

vyöhykkeet 130:n ja 170:n kDa välillä R-‐käsittelyllä olivat luultavimmin AR:n

SUMOttuneita muotoja. Yhteiskäsittelyllä VCaP-‐soluissa sumottunutta AR:a oli vähemmän

kuin R-‐käsittelyllä. Samansuuntainen vaikutus on nähtävissä myös LNCaP-‐soluissa

VCaP-‐soluilla LXR:ä ei saatu näkyviin lainkaa. LNCaP-‐soluissa LXR:n antoi kaksi vyöhykettä,

55 kDa:n ja 40 kDa:n. DMSO-‐ ja R-‐käsittelyllä LXR ilmentyi lähes saman verran. GW3965-‐

käsitteltyllä LXR ilmentyi selvästi edellisiä enemmän ja yhteiskäsittelyllä ilmentyminen oli

hyvin samanlainen.

A B

22

5.1.2 ABC-‐kuljettimien geenin ilmentyminen R1881-‐ ja GW3965-‐käsittelyllä VCaP-‐ ja

LNCaP-‐soluissa

GW3965 käsittelyn varmistamiseksi selvitettiin ABCA1:n ja ABCG1:n geenien ilmentyminen. ABCA1:n geeni-‐ilmentymä nousi molemmissa solulinjoissa GW3965-‐käsittelyllä perustasoon verrattuna: VCaP-‐soluissa noin 80-‐kertaiseksi ja LNCaP -‐soluissa noin 10-‐kertaiseksi. R1881-‐käsittelylä ei ollut merkittävää vaikutusta ilmentymiseen, mutta yhteiskäsittely geenin ilmentyminen kasvoi molemmissa solulinjoissa perustasoon nähden (VCaP-‐soluissa n. 5-‐kertainen ja LNCaP-‐soluissa n.4-‐kertainen) jääden silti huomattavasti pelkkää GW-‐käsittelyä alemmaksi.

VCaP-‐soluissa ABCG1:n ilmentymä nousi noin kolminkertaiseksi androgeenikäsittelyllä, kun taas LNCaP-‐soluissa androgeenikäsittelyllä ei ollut vaikutusta. LXR-‐ligandi sai geenin ilmentymisen nousemaan VCaP-‐soluissa 15-‐kertaiseksi ja LNCaP-‐soluissa 16-‐kertaiseksi perustasoon nähden. Yhteiskäsittelyn indusoima ilmentymä ei eronnut pelkän GW:n indusoimasta ilmentymisestä VCaP-‐soluilla, mutta LNCaP-‐soluilla ilmentyminen laski puoleen yhteiskäsittelyyn verrattuna (n. 8-‐kertainen).

A

B

KUVA 4. ABC-‐kuljettimien geenien ilmentyminen R1881-‐ ja GW3965-‐käsittelyllä a. VCaP ja b. LNCaP soluissa. Solut käsiteltiin 10nM R1881:llä ja 10 µM GW3965:llä. Yhteiskäsittelyssä soluille laitettiin kumpaakin ligandia ja kontrollina käytettiin puhdasta DMSO:a. ***P<0.001, **P<0.01. *P<0.05. em.=ei merkittävä

23

5.1.3 AR-‐kohdegeenien ilmentyminen R1881-‐ ja GW3965-‐käsittelyllä VCaP-‐ ja LNCaP-‐

soluissa

LXR:n vaikutusta AR:n toimintaan tutkittiin selvittämällä muuttaako GW3965:n AR:n kohdegeenien ilmentymistä.

FKBP5 indusoitui molemmissa solulinjoissa erittäin vahvasti androgeenikäsittelyllä. VCaP-‐

soluissa geenin ilmentyminen nousi 80-‐kertaiseksi ja LNCaP-‐soluissa 100-‐kertaiseksi.

Pelkkä GW3965-‐käsittely ei saanut kummassakaan solulinjassa aikaan merkittävää

induktiota, mutta yhteiskäsittely laski LNCaP-‐soluissa induktion kolmasosaan R1881:n

indusoimasta tasosta (n. 30-‐kertainen). VCaP-‐soluissa samanlaista vastetta ei nähty.

PSA:n ilmentymisessä nähtiin samanlainen vaste kuin edellä: R1881-‐käsittely sai aikaan

induktion molemmissa solulinjoissa; VCaP-‐soluissa ilmentymä nousi 10-‐kertaiseksi ja

LNCaP-‐soluissa 9-‐kertaiseksi perustasoon nähden. LXR-‐ligandikäsittelyllä ei nähty vastetta

VCaP-‐soluissa, mutta LNCaP-‐soluissa geenin ilmentyminen laski kymmenesosaan

perustasosta. Yhteiskäsittelyllä molemmissa solulinjoissa havaittiin laskua ilmentymisessä.

VCaP-‐soluissa induktio laski 7-‐kertaiseksi ja LNCaP-‐soluissa alle kolminkertaiseksi DMSO-‐

käsittelyyn verrattuna.

SPOCK2:n geenin ilmentyminen indusoitui VCaP-‐soluissa androgeenikäsittelyllä lähes 8-‐

kertaiseksi ja laski tästä hieman (n. 6-‐kertaiseksi) yhteiskäsittelyllä. Pelkällä GW3965:llä ei

ollut vaikutusta geenin ilmentymiseen VCaP-‐soluissa. LNCaP-‐soluissa nähtiin vahvempi

vaste R-‐käsittelyllä: geenin ilmentyminen nousi yli 25-‐kertaiseksi ligandittomaan

näytteeseen nähden. Yhteiskäsittely ”tiputti” ilmentymän viidesosaan tästä.

Mielenkiintoisesti LNCaP-‐soluissa GW-‐käsittelyllä nähtiin pientä nousua geenin

ilmentymässä (n. 3-‐kertainen).

S100P:n geenin luenta lisääntyi androgeenikäsittelyllä VCaP-‐soluissa 25-‐kertaiseksi ja

LNCaP-‐soluissa 2-‐kertaiseksi perustasoon nähden. GW3965-‐käsittelyllä ei ollut vaikutusta

geenin ilmentymiseen VCaP-‐soluissa, mutta LNCaP-‐soluissa ilmentyminen nousi yli

kymmenkertaiseksi DMSO-‐käsittelyyn verrattuna. VCaP-‐soluissa yhteiskäsittely laski

geenin ilmentymisen puoleen R-‐käsittelyn tasosta (n. 12-‐kertainen perustasoon

verrattuna) ja LNCaP-‐soluissa yhteiskäsittelyn indusoima ilmentymä ei eronnut GW-‐

käsittelystä.

24

KUVA 5. AR-‐kohdegeenien ilmentyminen R1881-‐ ja GW3965-‐käsittelyllä a, c. VCaP-‐ ja b, d. LNCaP-‐soluissa. Molemmille solulinjoille tehtiin samanlainen käsittely kuin kuvassa 2. ***P<0.001, **P<0.01. *P<0.05. em.=ei merkittävä

A

B

C

D

25

MYC-‐geenin ilmentyminen oli hyvin erilainen kahdella solulinjalla. VCaP-‐soluissa R-‐

käsittely laski ilmentymän puoleen perustasosta, kun taas LNCaP-‐soluissa androgeenillä ei

olut vaikutusta geenin ilmentymiseen. LXR-‐ligandi sai aikaan VCaP-‐soluissa pientä nousua

ilmentymässä ja LNCaP-‐soluissa GW3965-‐käsittely laski ilmentymää hieman perustasoon

nähden. Yhteiskäsittely tiputti geenin ilmentymisen VCaP-‐soluissa viidesosaan DMSO-‐

käsittelyyn verrattuna ja LNCaP-‐soluissa vaste laski noin kolmannekseen.

C6orf81 käyttäytyi kokeessa hieman poikkeavasti. R1881:llä saatiin aikaan 15-‐kertainen

geenin ilmentyminen VCaP-‐soluissa ja 6-‐kertainen ilmentyminen LNCaP-‐soluissa. LXR-‐

ligandikäsittely indusoi molemmissa solulinjoissa noin kaksinkertaisen vasteen DMSO-‐

käsittelyyn verrattuna. Edellisistä geeneistä poiketen yhteiskäsittely indusoi R-‐käsittelyyn

verrattuna pienen, joskin tilastollisesti merkityksettömän, nousun geeni-‐ilmentymässä

kummassakin solulinjassa. VCaP-‐soluilla ilmentymä nousi yhteiskäsittelyllä hieman alle 20-‐

kertaiseksi ja LNCaP-‐soluilla noin 7-‐kertaiseksi perustasoon nähden.

IGFBP3:a koodaavassa geenissä solulinjojen vasteet olivat huomattavan erilaiset. VCaP-‐

soluissa androgeenikäsittely laski geenin ilmentymistä kymmenykseen perustasosta, kun

taas LNCaP-‐soluissa ilmentymä nousi miltei 20-‐kertaiseksi. GW3965-‐käsittely indusoi

molemmissa solulinjoissa ilmentymän nousua: VCaP-‐soluissa se nousi noin

kolminkertaiseksi ja LNCaP-‐soluissa noin kymmenenkertaiseksi DMSO-‐käsittelyyn nähden.

Yhteiskäsittelyllä geenin ilmentyminen pysyi VCaP-‐soluissa samalla tasolla kuin R-‐

käsittelyllä, ja LNCaP-‐soluissa ilmentymä nousi merkittävästi lähes 35-‐kertaiseksi.

26

5.2 Androgeeni ja TNF-‐α käsittely PC3, VCaP ja LNCaP-‐soluille

5.2.1 IL-‐6:n ja IL-‐8:n ilmentyminen R1881-‐ ja TNF-‐α-‐käsittelyllä PC3, VCaP ja LNCaP-‐

soluissa

IL-‐6:n suhteellinen geeni-‐ilmentymä nousi kaikissa solulinjoissa TNF-‐α-‐käsittelyllä

huomattavasti; VCaP-‐ ja PC3-‐soluissa nousu oli maltillisempaa kuin LNCaP-‐soluissa. PC3-‐

soluissa ilmentyminen oli noin 4-‐kertainen ja VCaP-‐soluissa noin 3.5-‐kertainen DMSO-‐

käsittelyyn verrattuna. LNCaP-‐soluissa ilmentymä nousi TNF-‐α-‐käsittelyllä lähes 150-‐

kertaiseksi. R1881-‐käsittelyllä kaikissa solulinjoissa tapahtui pientä, mutta

merkityksetöntä nousua. Yhteiskäsittelyllä solulinjoissa oli eroa: PC3-‐soluilla

yhteiskäsittelyn indusoima geenin ilmentyminen oli noin kolminkertainen, mutta ero

KUVA 6. TNFα käsittely indusoi IL-‐6 ja IL-‐8 geenien ilmentymistä PC3-‐, VCaP-‐ ja LNCaP-‐solulinjassa. a. PC3-‐ b. VCaP-‐ ja c. LNCaP-‐solut käsiteltiin 16 h 1 µl/ml DMSOlla tai yksin tai yhdessä 10 nM R1881:lla ja 1000 U/ml TNF-‐alfalla. ***P<0.001, **P<0.01. *P<0.05. em.=ei merkittävä

A

B

C

27

R1881-‐käsittelyyn ei ollut tilastollisesti merkittävä. VCaP-‐soluilla yhteiskäsittely indusoi

noin 6-‐kertaisen ilmentymisen, mutta edelleenkään ero TNF-‐α-‐käsittelyyn ei ollut

merkittävä. LNCaP-‐soluissa taas geenin ilmentyminen nousi merkittävästi

kaksinkertaiseksi (n. 300-‐kertainen) verrattuna pelkkään TNF-‐α-‐käsittelyyn.

IL-‐8:n geenin ilmentyminen nousi merkittävästi R-‐käsittelyllä ainoastaan VCaP-‐soluissa (2-‐

kertainen), muissa linjoissa R-‐käsittelyllä ei ollut vaikutusta. TNF-‐α-‐käsittely indusoi

ilmentymää kaikissa solulinjoissa: PC3-‐soluissa geenin ilmentyminen nousi 8-‐kertaiseksi,

VCaP-‐soluissa n. 3-‐kertaiseksi ja LNCaP-‐soluissa 250-‐kertaiseksi perustasoon verrattuna.

R+TNF-‐α-‐käsittelyllä suhteellinen ilmentymä laski PC3-‐soluissa noin puoleen pelkästä TNF-‐

α-‐käsittelystä, kun taas VCaP ja LNCaP-‐soluissa yhteiskäsittely nosti IL-‐8:n geenin

ilmentymistä; VCaP-‐soluissa ilmentyminen oli noin 8-‐kertainen ja LNCaP-‐soluissa noin

450-‐kertainen DMSO-‐käsittelyyn nähden.

5.2.2 AR-‐kohdegeenien ilmentyminen R1881-‐ ja TNF-‐α–käsittelyllä PC3, VCaP ja LNCaP-‐

soluissa

TNF-‐α:n vaikutusta androgeeni vasteeseen tutkittiin käsittelemällä solut TNF-‐αlla ja

androgeenilla ja selvittämällä muutokset AR:n kohdegeeneissä.

TMPRSS2 indusoitui R1881 käsittelyllä kaikissa kolmessa solulinjassa (PC3-‐soluissa 2.5-‐

kertainen, VCaP-‐soluissa yli 20-‐kertainen ja LNCaP-‐soluissa n. 25-‐kertainen) ja TNF-‐αlla

nähtiin pientä nousua PC3-‐ ja VCaP-‐soluissa. LNCaP-‐soluilla TNF-‐α:n vaikutus ei ollut

merkittävä. R1881 ja TNF-‐α yhteiskäsittely indusoi erilaisia vaikutuksia

luumetastaasisoluissa ja LNCaP-‐soluissa: VCaP ja PC3-‐solulinjoissa yhteiskäsittely ei

eronnut R käsittelyn aikaansaamasta induktiosta merkittävästi, kun taas LNCaP-‐soluissa

nähtiin merkittävä geeni-‐ilmentymän lasku (R+TNF-‐α-‐käsittelyllä 5-‐kertainen induktio

verrattuna DMSO:n).

FKBP-‐5:n ja C60rf81:n geenin ilmentymisen muutokset olivat pääpiirteittäin samanlaisia

kuin edellä. Ainoastaan PC3-‐solut poikkesivat trendistä: yhteiskäsittelyllä FKBP5 indusoitui

enemmän kuin pelkällä R-‐käsittelyllä ja myös C6orf81:ssä nähtiin samanlainen vaste.

28

KUVA 7. AR-‐kohdegeenien ilmentyminen R1881-‐ ja TNF-‐α–käsittelyllä PC3-‐, VCaP-‐ ja LNCaP-‐soluissa. Solut käsiteltiin kuten kuvassa 5 on mainittu. ***P<0.001, **P<0.01. *P<0.05. em.=ei merkittävä

PC3-‐soluissa CLDN8 geenin ilmentyminen nousi 8-‐kertaiseksi R1881:llä ja yhteiskäsittelyllä

miltei 14-‐kertaiseksi. VCaP-‐soluilla R indusoi nelinkertaisen ja R + TNF-‐α viisinkertaisen

ilmentymisen. LNCaP-‐soluilla androgeeni nosti geeni-‐ilmentymää hieman yli

nelinkertaiseksi ja yhteiskäsittely laski sen noin puoleen tästä. Pelkkä TNF-‐α-‐käsittely ei

saanut aikaan vaikutusta PC3-‐soluissa, mutta VCaP-‐soluissa oli nähtävissä pientä nousua

(n. 1.8-‐kertainen) ja LNCaP-‐soluissa lievää laskua (n. 0.7-‐kertainen) geenin

ilmentymisessä.

SPOCK2:n geenin ilmentymisen muutokset poikkeavat trendistä PC3-‐solujen osalta. R-‐ ja

TNF-‐α-‐käsittely eivät kumpikaan saaneet aikaan merkittävää muutosta geenin

ilmentymisessä (n. 1.5-‐kertainen, ei merkittävä) verrattuna pohjatasoon. Kuitenkin

yhteiskäsittelyllä oli edelleen ilmentymistä lisäävä vaikutus (n. 2.5-‐kertainen). VCaP-‐

soluissa TNF-‐α-‐käsittely sai aikaan geenin ilmentymisen nousun noin kaksinkertaiseksi ja

androgeenikäsittely nosti ilmentymistä 12-‐kertaiseksi. Yhteiskäsittely ei eronnut

A

B

C

29

merkittävästi androgeenikäsittelystä. Myös LNCaP-‐soluissa TNF-‐α indusoi kaksinkertaisen

ilmentymisen ja R-‐käsittely nosti ilmentymisen 9-‐kertaiseksi. Yhteiskäsittely laski geenin

ilmentymistä kolmasosaan tästä (n. nelinkertaiseksi).

VCaP-‐soluille tehtiin sama koe myös 0,1 nM R1881-‐pitoisuudella, mutta siitä saadut

tulokset eivät eronneet edellä esitetyistä.

30

6 POHDINTA

6.1 LXR:n vaikutus AR:in eturauhassyövässä

Western blot –analyysin persuteella R-‐indusoitujen näytteiden proteiinien runsas

ilmentyminen johtuu luultavasti androgeenin solukasvua stimuloivasta vaikutuksesta.

VCaP-‐soluissa LXR:n ilmentyminen on tulosten perusteella hyvin vähäistä, mikä voi

selittää osaltaan osan AR-‐kohdegeenien pienen reagoinnin GW-‐käsittelyyn.

LXR-‐käsittely on mahdollisesti vähentänyt AR:n ilmentymistä LNCaP-‐soluissa. VCaP-‐

soluissa vastaavaa vaikutusta ei pystytä näkemään, mitä voi selittää mahdollinen LXR:n

vähyys. 130:n ja 170:n kDa:n välillä nähdyt SUMOttuneet AR-‐isomuodot olivat erityisen

kiinnostavia. Näiden pienempi ilmentyminen yhteiskäsittelyllä kuin R-‐käsittelyllä VCaP-‐

soluissa voi kertoa LXR:n mahdollisista vaikutuksia AR:n SUMOttumiseen ja sitä kautta

kolesterolit voisivat säädellä AR:n toimintaa. LNCaP-‐soluissa samankaltainen tulos voi olla

nähtävissä.

Androgeeni-‐ ja LXR-‐ligandikäsittelyllä on nähtävissä trendi varsinkin LNCaP-‐soluilla:

GW3965 vähentää AR-‐kohdegeenien ilmentymistä vaikka androgeenia olisi läsnä. Myös

VCaP-‐soluissa on nähtävissä samanlaisia vaikutuksia, joskin ne eivät ole yhtä huomattavia.

VCaP ja LNCaP-‐solujen erot selittyvät luultavasti edellä mainitulla erolla LXR:n

ilmentymisessä.

Kuitenkin geenien ilmentymisessä nähtiin muutoksia myös VCaP-‐soluissa, joten joko

pienikin määrä LXR:ää riittää vaikuttamaan solussa tapahtuvan transkriptioon tai AR ja

muut transkriptioon vaikuttavat tekijät, kuten koaktivaattorit ja -‐repressorit, reagoivat

suoraan LXR-‐ligandiin. LNCaP-‐soluissa AR väheneminen LXR käsittelyllä saattaisi selittää

suoraan geenien ilmentymisessä nähdyt muutokset.

ABC-‐kuljettimien geenien ilmentyminen laski molemmissa soluissa androgeenin ollessa

läsnä GW3965:n kanssa, mutta ilmentyminen pysyi kuitenkin huomattavasti perustasoa

ylempänä. Voidaan olettaa että LXR:n kolesterolia poistavat vaikutukset säilyvät myös

korkeissa androgeenipitoisuuksissa, vaikka näissä kokeissa ne tuskin vaikuttivat geenien

ilmentymiseen suhteellisen lyhyen käsittelyajan (16h) takia.

31

Luultavasti AR:n kohdegeenien ilmentymisen muutokset selittyvät aiemmin mainituilla

seikoilla: koaktivaattori kilpailulla, SULT2A1:n ja p27:n ilmentymisen lisääntymisellä ja

tulehduksen vähenemisellä, joista koaktivaattoreiden kilpailu lienee tärkein tässä

kokeessa.

LXR ja AR ristiinkytkentä näkyy selvästi tuloksista ja näyttäisi, että LXR-‐ligandikäsittely

heikentää androgeenivaikutusta tiettyjen geenien kohdalla.

6.2 TNF-‐α:n vaikutus AR:in eturauhassyövässä

Tässä työssä havaittiin IL-‐6:n ja IL-‐8:n stimuloituvan vahvasti LNCaP-‐soluissa TNF-‐α-‐

käsittelyllä ja R+TNF yhteisvaikutus oli edellistäkin vahvempi. VCaP-‐soluissa nähtiin

samansuuntainen vaikutus, joskin paljon pienempänä. PC3-‐soluilla yhteisvaikutus ei ollut

verrattavissa kahteen edelliseen. Vaikutusten kerroineroja voi selittää geeni-‐ilmentymän

perustason erilaisuus solulinjoissa: IL-‐6 ilmentyy VCaP-‐soluissa noin 10 kertaa enemmän

kuin LNCaP-‐soluissa ja IL-‐8 noin 100-‐kertaa enemmän. PC3-‐solut ilmentävät näitä

interleukiineja vielä huomattavasti enemmän kuin VCaP tai LNCaP-‐solut (tuloksia ei

esitetty). Voi myös olla, että VCaP ja PC3-‐solut eivät ilmennä tarpeeksi tehokkaasti TNF-‐α-‐

reseptoreita tai näiden koaktivaattoreita lisätäkseen huomattavasti interleukiinien

tuotantoa, mutta ensimmäinen selitys lienee todennäköisempi, sillä solut reagoivat

muuten TNF-‐α-‐käsittelyyn. Jotkin syöpäsolulinjat tuottavat endogeenisesti TNF-‐α:a ja

sytokiinejä (Lu & Stark 2004). VCaP ja PC3-‐soluissa IL-‐6 ja IL-‐8 geeniluenta voi olla

aktivoitunut endogeenisen tuotannon takia, mikä voi saada suhteellisen muutoksen

näyttämään pienemmältä.

AR-‐kohdegeenien responssi oli erilainen VCaP-‐ ja LNCaP-‐solulinjoissa, kun taas PC3-‐

soluilla nähtiin hyvin samanlainen vaste käsittelyille kuin VCaP-‐soluilla. Ei ollut yllättävää,

että PC3-‐ ja LNCaP-‐solut käyttäytyivät erilailla kuin LNCaP-‐solut ottaen huomion niiden

alkuperät. Kaikilla solulinjoilla R-‐käsittely lisäsi odotetusti kaikkien geenien ilmentymistä.

TNF-‐α yksinään ei juuri vaikuttanut ilmentymiseen PC3-‐soluissa, kun taas LNcaP-‐ ja VCaP-‐

soluilla nähtiin pientä, mutta merkittävää nousua ilmentymisessä. AR-‐kohdegeenien

transkription lisääntyminen ilman androgeenia viittaa tulehduksen eturauhassyöpää

32

edistävään vaikutukseen. VCaP-‐soluissa 0,1 nM R1881-‐pitoisuudella tehty koe kertoi

vaikutusten olevan samanlaisia ainakin VCaP-‐soluissa myös pienemmillä, enemmän

fysiologisia pitoisuuksia vastaavilla määrillä androgeeniä.

Yhteisvaikutus eri solulinjoilla oli erilainen: VCaP ja PC3-‐soluilla AR:n kohdegeenit joko

pysyivät R:n indusoimalla tasolla tai nousevat yhteisvaikutuksesta hieman enemmän.

Solujen samanlainen reagoiminen käsittelyihin voidaan luulatavasti edelleen selittää

niiden samankaltaisella alkuperällä. LNCaP-‐solulinjassa taas TNF-‐α vähensi geenin

ilmentymistä R1881:aan verrattuna, mikä on mielenkiintoista verrattuna aiemmin

käsiteltyyn yhteyteen tulehduksen ja syövän välillä. On olemassa tutkittua dataa, joka

osoittaa TNF-‐α-‐käsittelyn vähentävän LNCaP-‐solujen androgeenisensitiivisyyttä (Mizokami

A ym. 2001). On myös saatu tuloksia siitä, että pitkäaikainen TNF-‐α-‐käsittely voisi muuttaa

LNCaP-‐solut kokonaan androgeeniriippumattomiksi (Harada S ym. 2001) ja täten

vähentynyt geeni-‐ilmentymä yhteiskäsitellyissä soluissa saattaisi viestiä pitemmässä

juoksussa eturauhassyöpää edistävästä vaikutuksesta. Lisäksi kohonneet veren kemokiini

ja sytokiini pitoisuudet (kuten TNF-‐α) huonontavat ennustetta eturauhassyöpä potilailla ja

viittaavat nopeampaan kemiallisen kastraation tehon menetykseen. (Sharma J ym. 2014)

Kuitenkin kokeesta saadut tulokset näyttävät TNF-‐α:n vähentävän AR:n vaikutuksia

ainakin lyhytaikaisesti LNCaP-‐soluissa.

Delfinon ym. vuonna 2003 tekemässä tutkimuksessa TNF-‐α stimulaatio lisäsi AR:n

ilmentymistä Sertolin soluissa kiveksissä. Mikäli TNF-‐αlla on samanlainen vaikutus

eturauhassyöpä soluihin, se voisi selittää isomman AR-‐vasteen VCaP-‐ ja PC3-‐soluissa. Joka

tapauksessa TNF-‐α vaikutti AR:n kohdegeenien ilmentymisen kaikissa solulinjoissa ainakin

vähän, mikä viestii ristiinkytkennästä systeemien välillä.

6.3 Yhteenveto

LXR:n ja tulehduksen yhteyttä syöpään on tutkittu aiemmin ja tässä tutkimuksessa saadut

tulokset antavat ainakin viitteitä näiden vaikutuksesta eturauhassyöpään AR:n kautta.

TNF-‐α voi edistää tulehdusta ja sitä kautta vaikuttaa suotuisasti syövän kehittymiseen.

TNF:n stimuloimat interleukiinit taas voivat edistää AR:n toimintaa

33

androgeeniriippumattomassa eturauhassyövässä. LXR taas laskee kolesterolia ja ehkäisee

niin suoraan kuin välillisesti androgeenivaikutuksia soluissa. Lääkehoitoa TNF-‐α:n

toimintojen estämiseksi ja LXR:n aktivoimieksi on aktiivisesti kehitetty (Sharif 2013 ja de

Boussac 2013). Jatkotutkimuksia TNF-‐α:n ja LXR:n vaikutuksista AR:n toimintaan kuitenkin

tarvitaan vielä mahdollisten hoitoratkaisujen edistämiseksi. Ainakin genominlaajuiset

ChIP-‐seq (Chromatin Immunoprecipitation Sequencing, Kromatiini Immunosaostus

sekvensointi) -‐analyysit tuovat paljon lisätietoa AR:n käyttäytymisestä tässä

tutkimuksessa käsiteltyjen tekijöiden läsnä ollessa.

KUVA 8. TNF-‐alfan ja LXR:n mahdollinen vaikutus eturauhassyöpään.

34

7. LÄHTEET

Aaltomaa S, Jousilahti P, Kataja V, Korpela M, Kujala P, Laato M, Lindholm P, Matikainen M, Rannikko A, Sipilä R, Tammela T. Eturauhassyöpä, Käypä hoito. Duodecim Terveyskirjasto [päivitetty 27.5.2014] http://www.terveyskirjasto.fi/terveyskirjasto/tk.koti?p_artikkeli=hoi11060

Alberti S, Schuster G, Parini P, Feltkamp D, Diczfalusy U, Rudling M, Angelin B, Bjorkhem I, Pettersson S, Gustafsson JA. Hepatic cholesterol metabolism and resistance to dietary cholesterol in LXRβ-‐deficient mice. J Clin Invest., 2001;107:565–73.

American Cancer Society, Preventing and treating prostate cancer spread to bone [verkkoartikkeli], [päivitetty 05.01.2015] http://www.cancer.org/cancer/prostatecancer/detailedguide/prostate-‐cancer-‐treating-‐treating-‐pain

American Cancer Society, What is prostate cancer? [verkkoartikkeli], [päivitetty 05.01.2015], www.cancer.org/cancer/prostatecancer/detailedguide/prostate-‐cancer-‐what-‐is-‐prostate-‐cancer

Attard G, Clark J, Ambroisine L, Fisher G, Kovacs G, Flohr P, Berney D, Foster CS, Fletcher A, Gerald WL, Moller H, Reuter V, De Bono JS, Scardino P, Cuzick J, Cooper CS. Duplication of the fusion of TMPRSS2 to ERG sequences identifies fatal human prostate cancer. Oncogene 2008;27(3):253-‐263

Balk SP, Ko YJ, Bubley GJ. Biology of Prostate-‐Specific Antigen. J Clin Oncol., 2003;15;21(2):383-‐91.

Balkwill F, Mantovani A. Inflammation and cancer: Back to Virchow. Lancet, 2001;357:539–545

Balkwill F. TNF-‐α in promotion and progression of cancer Cancer Metastasis Rev., 2006 ;25:409–416

Balkwill F. Tumor necrosis factor or tumor promoting factor? Cytokine Growth Factor Rev., 2002;13(2):135-‐41.

Banner DW, D'Arcy A, Janes W, Gentz R, Schoenfeld HJ, Broger C, Loetscher H, Lesslauer W. Crystal structure of the soluble human 55 kd TNF receptor-‐human TNF β complex: implications for TNF receptor activation. Cell. 1993;7;73(3):431-‐45.

Berg J.M. DNA binding specificity of steroid receptors. Cell, 1989;57:1065–1068

Beyaert R, Fiers W. Molecular mechanisms of tumor necrosis factor-‐induced cytotoxicity. What we do understand and what we do not. FEBS Lett 1994 ;340:9 –16

Biddie SC, John S, Hager GL. Genome-‐wide mechanisms of nuclear receptor action. Trends Endocrinol Metab., 2010;21(1): 3.

Blood. 1995;15;85(12):3378-‐404.

Breslow N, Chan CW, Dhom G ym. Latent carcinoma of prostate at autopsy in seven areas. The International Agency for Research on Cancer, Lyons, France. Int J Cancer, 1977;20:680-‐8 Buchan G, Barrett K, Turner M, Chantry D, Maini RN & Feldmann M. Interleukin-‐1 and tumour-‐necrosis factor mRNA expression in rheumatoid arthritis: prolonged production of IL-‐1 . Clin. Exp. Immunol., 1988;73, 449–455. Burke F, Relf M, Negus R, Balkwill F. A cytokine profile of normal and malignant ovary. Cytokine 1996;8:578–585

35

Cancer Research UK, Prostate Cancer Incidence Statistics [verkkoartikkeli], [päivitetty 11.6.2014] http://www.cancerresearchuk.org/cancer-‐info/cancerstats/types/prostate/incidence/ Carroll JS, Liu XS, Brodsky AS, Li W, Meyer CA, Szary AJ, Eeckhoute J, Shao W, Hestermann EV, Geistlinger TR, Fox EA, Silver PA, Brown M. Chromosome-‐wide mapping of estrogen receptor binding reveals long-‐range regulation requiring the forkhead protein FoxA1. Cell 2005;15;122(1):33-‐43. Center MM, Jemal A, Lortet-‐Tieulent J ym. International variation in prostate cancer incidence and mortality rates. Eur Urol., 2012;61:1079-‐92 Chan FK, Chun HJ, Zheng L, Siegel RM, Bui KL, Lenardo MJ. A domain in TNF receptors that mediates ligand-‐independent receptor assembly and signaling. Science, 2000;30;288(5475):2351-‐4 Cubbage ML, Suwanichkul A, Powell DR. Insulin-‐like growth factor binding protein-‐3. Organization of the human chromosomal gene and demonstration of promoter activity. J Biol Chem., 1990;25;265(21):12642-‐9. de Boussac H, Pommier AJ, Dufour J, Trousson A, Caira F, Volle DH, Baron S, Lobaccaro JM. LXR, prostate cancer and cholesterol: the Good, the Bad and the Ugly. Am J Cancer Res., 2013;3(1):58-‐69.

Delfino FJ, Boustead JN, Fix C, Walker WH. NF-‐kappaB and TNF-‐alpha stimulate androgen receptor expression in Sertoli cells. Mol Cell Endocrinol., 2003 ;28;201(1-‐2):1-‐12.

Dennis LK, Lynch CF, Torner JC. Epidemiologic association between prostatitis and prostate cancer. Urology 2002;60:78-‐83

Dutt SS, Gao AC. Molecular mechanisms of castration-‐resistant prostate cancer progression. [kuva] Future Oncol., 2009;5(9):1403-‐13.

Eck MJ, Sprang SR, The structure of tumor necrosis factor-‐alpha at 2.6 A resolution. Implications for receptor binding. J Biol Chem., 1989;15;264(29):17595-‐605

Edwards J, Krishna NS, Grigor KM, Bartlett JM. Androgen receptor gene amplification and protein expression in hormone refractory prostate cancer. Br J Cancer, 2003;4;89(3):552-‐6.

Ekbom A, Helmick C, Zack M, Adami H-‐O. Ulcerative colitis and colorectal cancer. N Engl J Med., 1990;323:1228–1233

Fesik SW. Insights into programmed cell death through structural biology. Cell, 2000 ;13;103(2):273-‐82.

FitzGerald LM, Agalliu I, Johnson K, Miller MA, Kwon EM, Hurtado-‐Coll A, Fazli L, Rajput AB, Gleave ME, Cox ME, Ostrander EA, Stanford JL, Huntsman DG. Association of TMPRSS2-‐ERG gene fusion with clinical characteristics and outcomes: results from a population-‐based study of prostate cancer. BMC Cancer, 2008;8:230.

Flotho A1, Melchior F. Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease. Annu Rev Biochem., 2013;82:357-‐85.

Geiss-‐Friedlander R, Melchior F. Concepts in sumoylation: a decade on. Nat Rev Mol Cell Biol., 2007;8(12):947-‐56.

Giguere V. Orphan nuclear receptors: from gene to function. Endocr Rev., 1999;20:689–725.

36

Gregory CW, He B, Johnson RT, Ford OH, Mohler JL, French FS, Wilson EM. A mechanism for androgen receptor-‐mediated prostate cancer recurrence after androgen deprivation therapy. Cancer Res., 2001;1;61(11):4315-‐9.

Gruss HJ, Dower SK. Tumor necrosis factor ligand superfamily: involvement in the pathology of malignant lymphomas. Blood. 1995;15;85(12):3378-‐404.

Guo Z, Dai B, Jiang T, Xu K, Xie Y, Kim O, Nesheiwat I, Kong X, Melamed J, Handratta VD, Njar VC, Brodie AM, Yu LR, Veenstra TD, Chen H, Qiu Y. Regulation of androgen receptor activity by tyrosine phosphorylation. Cancer Cell, 2006;10(4):309-‐19.

Gutierrez-‐Hartmann A, Duval DL, Bradford AP. ETS transcription factors in endocrine systems. Trends Endocrinol Metab. 2007;18(4):150-‐8.

Harada S, Keller ET, Fujimoto N, Koshida K, Namiki M, Matsumoto T, Mizokami A. Long-‐term exposure of tumor necrosis factor alpha causes hypersensitivity to androgen and anti-‐androgen withdrawal phenomenon in LNCaP prostate cancer cells. Prostate. 2001;1;46(4):319-‐26.

Hay CW, McEwan IJ. The impact of point mutations in the human androgen receptor: classification of mutations on the basis of transcriptional activity. PLoS One., 2012;7(3):e32514.

Hehlgans T, Männel DN. The TNF-‐TNF receptor system. Biol Chem. 2002;383(10):1581-‐5.

Hehlgans T, Pfeffer K. The intriguing biology of the tumour necrosis factor/tumour necrosis factor receptor superfamily: players, rules and the games. Immunology. 2005;115(1):1-‐20.

Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM. Real time quantitative PCR. Genome Res., 1996;6(10):986-‐94.

Hermans KG, van Marion R, van Dekken H, Jenster G, van Weerden WM, Trapman J. TMPRSS2:ERG fusion by translocation or interstitial deletion is highly relevant in androgen-‐dependent prostate cancer, but is bypassed in late-‐stage androgen receptor-‐negative prostate cancer. Cancer Res., 2006 ;66(22):10658-‐10663

Hori S, Butler E, McLoughlin J. Prostate cancer and diet: food for thought? BJU Int., 2011;107:1348-‐59

Horoszewicz JS, Leong SS, Kawinski E, Karr JP, Rosenthal H, Chu TM, Mirand EA, Murphy GP LNCaP model of human prostatic carcinoma. Cancer Res 1983;43(4):1809–18.

Huang CK, Lai KP, Luo J, Tsai MY, Kang HY, Chen Y, Lee SO, Chang C. Loss of androgen receptor promotes adipogenesis but suppresses osteogenesis in bone marrow stromal cells. Stem Cell Res., 2013;11(2):938-‐50.

Idriss HT, Naismith JH. TNF alpha and the TNF receptor superfamily: structure-‐function rela-‐tionship(s). Microsc Res Tech. 2000;1;50(3):184-‐95.

Inoue J, Ishida T, Tsukamoto N, Kobayashi N, Naito A, Azuma S, Yamamoto T.Tumor necrosis factor receptor-‐associated factor (TRAF) family: adapter proteins that mediate cytokine signaling. Exp Cell Res., 2000;10;254(1):14-‐24.

Ishak MB, Giri VN. A systematic review of replication studies of prostate cancer susceptibility genetic variants in high-‐risk men originally identified from genome-‐wide association studies. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev., 2011;20:1599-‐610

Berg JM. DNA binding specificity of steroid receptors Cell, 1989;57:1065–1068

37

Jakobsson T, Venteclef N, Toresson G, Damdimopoulos AE, Ehrlund A, Lou X, Sanyal S, Steffensen KR, Gustafsson J-‐Å, Treuter E. GPS2 is required for cholesterol efflux by triggering histone demethylation, LXR recruitment, and coregulator assembly at the ABCG1 locus. Mol Cell, 2009;34:510–518

Janowski BA, Willy PJ, Devi TR, Falck JR ja Mangelsdorf DJ. An oxysterol signalling pathway mediated by the nuclear receptor LXRα. Nature 1996;383:728-‐31

Jemal A, Murray T, Ward E ym. Cancer statistics, 2005. CA Cancer J Clin., 2005;55:10-‐30

Kaighn ME, Narayan KS, Ohnuki Y, Lechner JF, Jones LW. Establishment and characterization of a human prostatic carcinoma cell line (PC-‐3). Invest. Urol. 1979;17:16-‐23,.

Kaikkonen S., Paakinaho V., Sutinen P., Levonen A., Palvimo J.J. Prostaglandin 15d-‐PGJ(2) inhibits androgen receptor signaling in prostate cancer cells. Mol. Endocrinol., 2013;27:212–223.

Karvonen U, Kallio PJ, Jänne OA, Palvimo JJ. Interaction of androgen receptors with androgen response element in intact cells. Roles of amino-‐ and carboxyl-‐terminal regions and the ligand. J Biol Chem. 1997;20;272(25):15973-‐9.

Kitakata H, Nemoto-‐Sasaki Y, Takahashi Y, Kondo T, Mai M, & Mukaida N. Essential roles of tumor necrosis factor receptor p55 in liver metastasis of intrasplenic administration of colon 26 cells. Cancer Research, 2002;62,6682–6687.

Klug JWR, Schwabe A. Zinc fingers. FASEB J., 1995;9:597–604

Koehne C-‐H, Dubois RN. COX-‐2 inhibition and colorectal cancer. Semin. Oncol., 2004:31:12–21

Kontoyiannis D, Pasparakis M, Pizarro TT, Cominelli F & Kollias G. Impaired on/off regulation of TNF biosynthesis in mice lacking TNF AU-‐rich elements: Implications for joint and gut-‐associated immunopathologies. Immunity, 1999:10:387–398

Krycer JR, Brown AJ. Cross-‐talk between the androgen receptor and the liver X receptor: implications for cholesterol homeostasis. J Biol Chem. 2011;10;286(23):20637-‐47.

Lee JH, Gong H, Khadem S, Lu Y, Gao X, Li S, Zhang J, Xie W. Androgen deprivation by ac-‐tivating the liver X receptor. Endocrinology. 2008;149:3778–88.

Li L, Lou Z, Wang L. The role of FKBP5 in cancer aetiology and chemoresistance. Br J Cancer. 2011;4;104(1):19-‐23.

Lichtenstein P, Holm NV, Verkasalo PK ym. Environmental and heritable factors in the causation of cancer-‐-‐analyses of cohorts of twins from Sweden, Denmark, and Finland. N Engl J Med., 2000;343:78-‐85

Locksley RM, Killeen N, Lenardo MJ. "The TNF and TNF receptor superfamilies: integrating mammalian biology". Cell 2001;104(4):487–501.

Lu T & Stark GR. Cytokine overexpression and constitutive NFκB in cancer. Cell Cycle 2004;3:69–72.

Luboshits G, Shina S, Kaplan O, et al. Elevated expression of the CC chemokine regulated on activation, normal T cell expressed and secreted (RANTES) in advanced breast carcinoma. Cancer Res., 1999;59:4681–468

Luisi BF, Xu WX, Otwinowski Z, Freedman LP, Yamamoto KR, Sigler PB () Crystallographic analysis of the interaction of the glucocorticoid receptor with DNA. Nature 1991;352:497–505.

38

Luo, J. L., Maeda, S., Hsu, L. C., Yagita, H., & Karin, M. Inhibition of NFD-‐kappaB in cancer cells converts inflammation-‐induced tumor growth mediated by TNFalpha to TRAIL-‐mediated tumor regression. Cancer Cell 2004;6:297–305

Mangelsdorf DJ, Thummel C, Beato M, Herrlich P, Schütz G, Umesono K, Blumberg B, Kastner P, Mark M, Chambon P, Evans RM. The nuclear receptor superfamily: The second decade. Cell 1995;15;83(6):835-‐9

Mantovani A, Allavena P, Sica A. Tumour-‐associated macrophages as a prototypic type II polarised phagocyte population: Role in tumour progression Eur. J. Cancer, 2004;40:1660–1667

McCarty MF, Hejazi J, Rastmanesh R. Beyond Androgen Deprivation: Ancillary Integrative Strategies for Targeting the Androgen Receptor Addiction of Prostate Cancer. Integr Cancer Ther. 2014;13(5):386-‐95

Michalaki V, Syrigos K, Charles P, Waxman J. Serum levels of IL-‐6 and TNF-‐alpha correlate with clinicopathological features and patient survival in patients with prostate cancer. Br J Cancer. 2004;14;90(12):2312-‐6.

Mizokami A, Gotoh A, Yamada H, Keller ET, Matsumoto T. Tumor necrosis factor-‐alpha represses androgen sensitivity in the LNCaP prostate cancer cell line. J Urol. 2000;164:800-‐5.

Negus RPK,Stamp GWQ, Hadley J, Balkwill FR. Quantitative assessment of the leucocyte infiltrate in ovarian cancer and its relationship to the expression of C-‐C chemokines. Am J Pathol, 1997;150:1723–1734

Ni M, Chen Y, Fei T, Li D, Lim E, Liu XS, Brown M. Amplitude modulation of androgen signaling by c-‐MYC. Genes Dev. 2013;1;27(7):734-‐48.

Nuclear Receptor Signaling Atlas, LXR-‐α : Anatomical Q-‐PCR Expression Data [verkkodokumentti], [siteerattu 3.6.2014], http://www.nursa.org/nursa/molecules/nr.jsf?doi=10.1621/WD46UVPRKT

Nuclear Receptor Signaling Atlas, LXR-‐β : Anatomical Q-‐PCR Expression Data [verkkodokumentti], [siteerattu 3.6.2014], http://www.nursa.org/nursa/molecules/nr.jsf?doi=10.1621/4Y2DTEP5D8

Ou Z, Jiang M, Hu B, Huang Y, Xu M, Ren S, Li S, Liu S, Xie W, Huang M. Transcriptional Regulation of Human Hydroxysteroid Sulfotransferase SULT2A1 by LXRα. Drug Metab Dispos. 2014;42(10):1684-‐9

Owerbach D, McKay EM, Yeh ET, Gabbay KH, Bohren KM. A proline-‐90 residue unique to SUMO-‐4 prevents maturation and sumoylation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005;337:517–20

Pakkanen S, Baffoe-‐Bonnie AB, Matikainen MP ym. Segregation analysis of 1,546 prostate cancer families in Finland shows recessive inheritance. Hum Genet 2007;121:257-‐67

Pascual A. Nuclear hormone receptors and gene expression. Physiol Rev., 2001;81(3):1269-‐304.

Peet DJ, Turley SD, Ma W, Janowski BA, Lobaccaro JM, Hammer RE, Mangelsdorf DJ. Cholesterol and bile acid metabolism are impaired in mice lacking the nuclear oxysterol receptor LXR alpha. Cell. 1998;93:693–704.

Petrovics G, Liu A, Shaheduzzaman S, Furusato B, Sun C, Chen Y, Nau M, Ravindranath L, Chen Y, Dobi A, Srikantan V, Sesterhenn IA, McLeod DG, Vahey M, Moul JW, Srivastava S: Frequent overexpression of ETS-‐related gene-‐1 (ERG1) in prostate cancer transcriptome. Oncogene 2005;24(23):3847-‐3852.

Pfitzenmaier J, Vessella R, Higan CS, Noteboom JL, Wallace D Jr., & Corey E. Elevation of cytokine levels in cachectic patients with prostate carcinoma. Cancer, 2003;90:1211–1216

39

Reich K, Nestle FO, Papp K, Ortonne JP, Evans R, Guzzo C, Li S, Dooley LT, Griffiths CE; EXPRESS study investigators. Infliximab induction and maintenance therapy for moderate-‐to-‐severe psoriasis: a phase III, multi-‐centre, double-‐blind trial. Lancet. 2005;15-‐21;366(9494):1367-‐74.

Richards J, Lim AC, Hay CW, Taylor AE, Wingate A, Nowakowska K, Pezaro C, Carreira S, Goodall J, Arlt W, McEwan IJ, de Bono JS, Attard G. Interactions of abiraterone, eplerenone and prednisolone with wild-‐type and mutant androgen receptor: a rationale for increasing abiraterone exposure or combining with MDV3100. Cancer Res. 2012;72(9):2176–82

Roehrborn CG, Black LK. The economic burden of prostate cancer. BJU Int. 2011;108(6):806-‐13

Rytinki M, Kaikkonen S, Sutinen P, Paakinaho V, Rahkama V, Palvimo JJ. Dynamic sumoylation is linked to the activity cycles of androgen receptor in the cell nucleus. Mol. Cell. Biol. 2012;32:4195–420

Saarelma O. Eturauhassyöpä [verkkoartikkeli] Lääkärikirja Duodecim [päivitetty 10.3.2014], www.terveyskirjasto.fi/terveyskirjasto/tk.koti?p_artikkeli=dlk00210

Saitoh H, Hinchey J. Functional heterogeneity of small ubiquitin-‐related protein modifiers SUMO-‐1 versus SUMO-‐2/3. J. Biol. Chem. 2000;275:6252–58

Schwabe JW, Chapman L, Finch JT, Rhodes D The crystal structure of the estrogen receptor DNA-‐binding domain bound to DNA: how receptors discriminate between their response elements. Cell 1993;75:567–578.

Sharifi N. Mechanisms of androgen receptor activation in castration-‐resistant prostate cancer. Endocrinology. 2013;154(11):4010-‐7.

Sharma J, Gray KP, Harshman LC, Evan C, Nakabayashi M, Fichorova R, Rider J, Mucci L, Elevated IL-‐8, TNF-‐α, and MCP-‐1 in men with metastatic prostate cancer starting androgen-‐deprivation therapy (ADT) are associated with shorter time to castration-‐resistance and overall survival. Prostate. 2014;74(8):820-‐8.

Smith C.A., Farrah T., Goodwin R.G. The TNF receptor superfamily of cellular and viral proteins: activation, costimulation, and death. Cell, 1994;76:959–962

Suomen Syöpärekisteri. Vuosittaiset keskimääräiset syöpätapauksien määrät vuosina 1966-‐2012 primaaripaikoittain ja kalenterijaksoittain, MIEHET. [verkkodokumentti] [päivitetty 08.10.2014] http://stats.cancerregistry.fi/stats/fin/vfin0003i1.html

Szlosarek PW, Grimshaw MJ, Kulbe H, Wilson JL, Wilbanks GD, Burke F, Balkwill FR. Expression and regulation of tumor necrosis factor-‐a in normal and malignant ovarian epithelium. Molecular Cancer Therapeutics 2006;5:382–390.

Taplin ME, Rajeshkumar B, Halabi S, Werner CP, Woda BA, Picus J, Stadler W, Hayes DF, Kantoff PW, Vogelzang NJ, Small EJ; Cancer and Leukemia Group B Study 9663. Androgen receptor mutations in androgen-‐independent prostate cancer: Cancer and Leukemia Group B Study 9663. J Clin Oncol. 2003;15;21(14):2673-‐8.

van der Steen T, Tindall DJ, Huang H. Posttranslational modification of the androgen receptor in prostate cancer. Int J Mol Sci. 2013;16;14(7):14833-‐59.

Vendramini-‐Costa DB, Carvalho JE. Molecular link mechanisms between inflammation and cancer. Curr Pharm Des. 2012;18(26):3831-‐52.

40

Viennois E, Pommier AJ, Mouzat K, Oumeddour A, El Hajjaji FZ, Dufour J, Caira F, Volle DH, Baron S, Lobaccaro JM. Targeting liver X receptors in human health: deadlock or promising trail? Expert Opin Ther Targets. 2011;15:219–32.

Vilcek J, Lee TH. Tumor necrosis factor. New insights into the molecular mechanisms of its multiple actions. J Biol Chem 1991;266:7313–7316

Wärnmark A, Treuter E, Wright AP, Gustafsson J-‐Å. "Activation functions 1 and 2 of nuclear receptors: molecular strategies for transcriptional activation". Mol. Endocrinol. 2003;17(10):1901–9.

Watts AD, Hunt NH, Hambly BD, Chaudhri G. Separation of tumor necrosis factor alpha isoforms by two-‐dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis 1997;18:1086 –1091.

Williams S, Bledsoe RK, Collins JL, Boggs S, Lambert MH, Miller AB, Moore J, McKee DD, Moore L, Nichols J, Parks D, Watson M, Wisely B, Willson TM. X-‐ray crystal structure of the liver X receptor β ligand binding domain: regulation by a histidine-‐tryptophan switch. J Biol Chem. 2003;278:27138–43.

Willy PJ, Umesono K, Ong ES, Evans RM, Heyman RA, Mangelsdorf DJ. LXR, a nuclear receptor that defines a distinct retinoid response pathway. Genes Dev. 1995;9:1033–45.

Yleisimmät syöpäkuolemansyyt vuonna 2012, MIEHET. [verkkodokumentti] Suomen Syöpärekisteri, [päivitetty 08.10.2014] http://stats.cancerregistry.fi/stats/fin/vfin0020m0.html

Zelcer N, Hong C, Boyadjian R, Tontonoz P. LXR regulates cholesterol uptake through Idol-‐dependent ubiquitination of the LDL receptor. Science. 2009;325:100–4.

Zhuang L, Lin J, Lu ML, Solomon KR, Freeman MR.Cholesterol-‐rich lipid rafts mediate akt-‐regulated survival in prostate cancer cells. Cancer Res. 2002;15;62(8):2227-‐31.

Zu K, Giovannucci E. Smoking and aggressive prostate cancer: a review of the epidemiologic evidence. Cancer Causes Control 2009;20:1799-‐810

gw3965!ja!tnf-αmuuttavat ......3! 2(tumareseptorit(2.1(yleistä((tumareseptorit ovat superperhe!...

Documents