STUDI ELEKTROFORESIS ISOENZIM DARI DAUN MUTAN PADIVARIETAS CISADANE DAN GALUR MUTAN 627-10-3

Ermin K. Harantung*, Rochestri Sofyan**, clan M. Ismachin*

ABSTRAK

STUDI ELEKTROFORESIS looEHZIK DAKI DAUH !tUTAN PADI VARIETAS CISADAIOI DAN CALOR

!tUTAN 627-10-3. Telah dilakukan penelitian pola pita isoenzim esterase dan peroksi­

dase secara elektroforesis disk gel poliakrilamid terhadap daun padi varietas

Cisadane dan mutan-mutannya nomor : ODS 18, ODS 208, OBS 297, ODS 306, dan ODS 330.

Pene1itian yang sarna juga dilakukan terhadap ga1ur mutan 627-10-3 dan mutan-mutannya

nomor : 1063, 1066, 1067, 1076, dan 1090. Pola pita isoenzim esterase pada varietas

Cisadane dan mutan-mutannya masing-masing terdiri atas 8 pita, kecuali pada mutan

ODS 18 dan ODS 297 yang masing-masing terdiri atas 9 pita. Isoenzim esterase pada

ga1ur mutan 627-10-3 terdiri atas 13 pita, sedang mutan-mutannya kurang dari 13

pita. Jum1ah pita zimogram isoenzim peroksidase pada Cisadane, 627-10-3, dan mutan­

mutannya berkisar antara 8 dan 9 pita. Zimogram isoenzim mutan Cisadane menunjukkan

kesamaan berpo1a Cisadane, yang berbeda dengan pola kesamaan zimogram isoenzim mutan

dari galur 627-10-3. Tampaknya gen pengontro1 enzim peroksidase pada galur 627-10-3

1ebih stabil terhadap iradiasi gamma daripada gen pengontro1 enzim esterase, tetapi

pada varietas Cisadane ter1ihat kebalikannya.

ABSTRACT

STUDIES ON ISOEHZYKES ELECTROPHORESIS FROM THE LEAVES or CISADANE'S MlJTANTS AND

627-10-3'S MUTANTS. Studies on zymograms of esterase isoenzymes and peroxidase iso­

enzymes from the leaves of Cisadane and its mutants : ODS 18, ODS 208, ODS

297, ODS 306, and ODS 330 have been carried out .using polyacrylamide gel disc elec­

trophoresis analysis. The same studies have also been done on mutant line 627-10-3

and its mutants: 1063, 1066, 1067, 1076, and 1090. Zymograms of esterase isoenzymes

of Cisadane and its mutants consist of 8 bands except mutant ODS 18 and mutant

ODS 297 which has 9 bands each. Mutant line 627-10-3 has 13 bands in its esterase

isoenzymes zymograms, while its mutants have less than 13 bands. Number of bands in

the peroxidase isoenzymes zymograms are 8 or 9 bands in all materials used in these

studies. The isoenzymes zymograms of Cisadane's mutants show similar migration pat­

tern specific to Cisadane's bands, which are different from 627-10-3 mutants zymo­

grams pattern. It is assumed that responsible gene(s) controlling peroxidase en-

* Pusat Aplikasi Isotop dan Radiasi, DATAN

** Pusat Pengkajian Teknologi Nuklir, BATAN

339

zyme in mutant line 627-10-3 is (are) more stable toward gamma irradiation thangene( s) responsible to control esterase enzyme. However. the phenomenon is viceversa in Cisadane.

PENDAHULUAN

Suatu metode yang efisien dan sederhana untuk mempelajari va­

riasi isoenzim padi telah dikembangkan melalui teknik elektroforesis

(1). Pada penyidikan genetik tanaman digunakan isoenzim, karena pola

zimogramnya menunjukkan variasi genetik yang berguna sebagai ciri

suatu varietas tanaman (2). UPADHYA dkk. (3) menggunakan esterase

sebagai ciri genetik untuk mengidentifikasi perbedaan varietas padi~

padian. PALANICHAMY dan SIDDIQ (4) telah mempelajari hubungan an­

tara 10 spesies dari genus Oryza berdasarkan variasi pola el~ktrofo­

resis isoenzim esterase dan peroksidase.

Akan tetapi tidak semua isoenzim mempunyai sHat-sifat yang

diperlukan untuk karakterisasi dan identifikasi tanaman. Oleh sebab

itu analisis rutin untuk setiap individu perlu dilakukan (2). Hasil

penelitian terdahulu memberikan informasi bahwa pola esterase mutan

padi Atomita 1 dan A227/5 yang tahan terhadap wereng coklat berbeda

dengan varietas asalnya yang peka terhadap wereng coklat (5).

Melalui metode elektroforesis ini ingin dipelajari ciri-ciri genetik

akibat mutasi pada padi varietas Cisadane dan galur mutan 627-10-3

serta mutan-mutannya, berdasarkan pola isoenzim esterase dan per­

oksidasenya.

BAHAN DAN METODE

Bahan Percobaan. Bahan percobaan ialah mutan-mutan padi varie­

tas Cisadane dan galur mutan 627-10-3. Mutan OBS 18, OBS 208,

OBS 297, OBS 306, dan OBS 330 berasal dari padi varietas Cisadane.

Mutan 1063, 1066, 1067, 1076, dan 1090 berasal dari galur mutan 627­

10-3. Mutan-mutan tersebut merupakan hasil Kelompok Pemuliaan Tanam­

an PAIR-Batan melalui perlakuan iradiasi gamma terhadap varietas

asalnya.

Bahan Ki.ia. Bahan kimia yang digunakan antara lain : akrila­

mid, N,N'-metilenbisakrilamid, dan Fast blue RR salt diperoleh dari

340

BDH, Poole, England ; 1-naftil asetat dan 2-naftil asetat diperoleh

dari E. Merck, Darmstadt, Jerman Barat ; 3-amino-9-etil karbazol dan

N,N-dimetil formamid diperoleh dari Sigma Chemicals, Saint Louise

Missouri, USA. Semua zat kimia lain yang digunakan berkualitas pro

analisis.

Pe.buatan Larutan Contoh. Daun padi yang berumur 1 minggu dan

akuades digerus bersama-sama dengan perbandingan 1:1 (b/v) dalam

wadah yang dingin. Hasil penggerusan disaring, lalu disentrifuga

dengan kecepatan 6.000 putaran per menit selama 1 jam, supernatan

diambil sebanyak 100 ul/gel untuk elektro'foresis.

Elektroforesis. Elektroforesis disk gel poliakrilamid dilakukan

menu rut metode DAVIS (6). Konsentrasi gel poliakrilamid sebesar 7,5

%, sebagai bufer elektroda digunakan bufer tris glisin pH 8,3.

Elektroforesis berlangsung selama 50 sampai 60 menit pada suhu 3-4oC

dan kuat arus yang digunakan sebesar 4 mAl gel. Setelah gel-gel

dikeluarkan dari tabung-tabung, gel tersebut direndam dalam larutan

pewarna.

Pe~arnaan Isoenzi. Esterase. Gel direndam dalam larutan pewarna

esterase selama 25 menit di ruang gelap pada suhu ruang. Larutan

pewarna esterase ini dibuat dengan cara mencampurkan larutan A ke

dalam larutan B sampai volume 100 ml, p~ncampurannya dilakukan pada

saat akan dipakai. Larutan A dibuat dengan melarutkan 100 mg Fast

blue RR salt dalam bufer fosfat 0,1 M pH 7,0 sampai volume 100 ml,

lalu disaring. Larutan B dibuat dengan melarutkan 60 mg 1-naftil

asetat dan 20 mg 2-naftil asetat dalam 3 ml aseton. Naftil asetat

digunakan sebagai substrat pada reaksi untuk mengaktifkan isoenzim

esterase.

Pe~arnaan Isoenzia Peroksidase. Larutan pewarna peroksidase

dibuat dengan cara melarutkan 20 mg 3-amino-9-etil karbazol dalam

2,5 ml N,N-dimetil formamid, lalu ditambahkan 5 ml bufer asetat 1 M

pH 4,65 dan 1 ml larutan CaCl2 0,1 M. Campuran ini diencerkan dengan

akuades sampai volume 50 mI. Pada saat akan dipakai, ke dalamnya

ditambahkan 1 ml H202 0,7 %. Pewarnaan dilakukan pada suhu ruang dan

suasana gelap selama 40 menit. Pereaksi warna yang digunakan harus

segar.

341

HASI L DAN PEMBAHASAN

Galur mutan nomor 1063, 1066, 1067, 1076, dan 1090 merupakan

hn~il irntlin~i Inlur IDutnn o~l-lO-u tlrnKnn ~innr InIDIDntlolil 0JkGy. Kelima galur mutan dari 627-10-3 tersebut dipilih karena

umurnya lebih genjah dari galur asalnya (627-10-3) dan lebih tahan

terhadap wereng coklat khususnya biotip 2. Meskipun demikian

morfologi mutan-mutan tersebut masih seperti galur mutan 627-10-3.

Galur mutan yang berasal dari varietas Cisadane, yaitu OBS 18

dan OBS 208 umurnya lebih genjah daripada varietas asalnya, tetapi

mutan-mutan yang lain : OBS 297, OBS 306, dan OBS 330 umur dan

morfologinya sama dengan Cisadane.

Dari hasil zimogram yang diperoleh, ternyata kuat arus sebesar

4 mA/gel menghasilkan zimogram yang lebih tajam pemisahan pita-pita

proteinnya dibandingkan dengan kuat arus 2 mA/gel. Pola pi ta

isoenzim pada gel langsung diukur jarak migrasinya dan ditampilkan

pada zimogram, karena ada beberapa pita yang segera menghilang.

Zimogram merupakan suatu diagram berdasarkan harga Rm, untuk

mempermudah interpretasi genetik. Harga Rm yaitu perbandingan antara

jarak migrasi pita isoenzim dan jarak migrasi pita perunut.

- • Katoda+ • Anoda

627-10-30

0,10,20.3.~10,4

cd~.~I 0.5•111 0,6

~ .0,70,80,91,01.+

1063 1066 1067 1076 1090

}C

Gambar 1. Zimogram isoenzim esterase daun padi galur mutan627-10-3, mutan 1063, 1066, 1067, 1076, dan 1090.

342

Esterase. Zimogram esterase dari galur mutan 627-10-3 pada

Gambar 1 menunjukkan. 13 pita, sedang mutan-mutannya yaitu mutan

1063 dan 1066 masing-masing terdiri dari 11 pita, mutan 1067

terdiri dari 12 pita, mutan 1076 mempunyai 7 pita dan mutan 1090

terdiri dari 9 pita.

Zimogram esterase padi vari etas Ci sadane pad a Gambar 2

menunjukkan 8 pita, sedang mutan-mutannya yaitu OBS 18 dan OBS 297

masing-masing terdiri dari 9 pita, OBS 208, OBS 306, dan OBS 330

masing-masing mempunyai 8 pita, mirip dengan varietas asalnya.

Pada mutan OBS 18, OBS 297, dan OBS 330 muncul pita ke-9 dengan

Rm = 0,82.

Pada umumnya jarak migrasi pita-pita mutan mengalami perubahan,

intensitas warna pita bervariasi, warna pita terdiri atas coklat,

biru, dan merah tua, juga ada pita baru yang muncul tetapi ada pula

pita yang tidak muncul.

CISADANE OBS 18 OBS 208 OBS 297 OBS 306 OBS 330

0

0,10,20,3'"I0,4

~tc'"10,5II

~ 10,60,70,8o,9r

_ a Katoda

1,OL+

+ • Anoda

- }a

}c

Gambar 2. Zimogram isoenzim esterase daun padi,varietasCisadane, mutan OBS 18, OBS 208, OBS 297,OBS 306, dan OBS 330.

343

Zimogram esterase pada galur mutan 627-10-3 menunjukkan perubahan

pita-pita yang berada dekat kedua kutub elektroda. Pada mutan 1063,

vita ke-l dun ke-J tidak muncul, pada mutan 1066 pita ke-12 dan ke­

13 tidak muncul. Pita ke-l dan ke-2 pada mutan 1067 tidak muncul,

tetapi muncul pita baru antara pita ke-l1 dan ke-12. Pada mutan 1076

terdapat 6 pita yang tidak muncul, sedang pada mutan 1090 ada 4 pita

yang tidak muncul.

Agar perubahan pita yang terjadi dapat dilihat dengan mudah,

maka dari pewarnaan gel dengan Fast blue RR salt dihasilkan 5

kelompok zimogram esterase yang dibedakan berdasarkan warna dan

jarak migrasi pitanya sebagai berikut

1. Kelompok a : warna coklat, migrasi antara Rm ° - 0,15

2. Kelompok b : warna biru, migrasi antara Rm 0,3- 0,5

3. Kelompok c : warna coklat, migrasi antara Rm 0,5 -0,6

4. Kelompok d : warna coklat - merah tua - coklat,

migrasi antara Rm 0,6 -0,75

5. Kelompok e : warna merah tua,

migrasi antara Rm 0,75-0,9

Peroksidase. Pewarnaan peroksidase dengan 3-amino-9-etil karba­

zol hanya menghasilkan 1 macam warna, yaitu coklat kemerahan untuk

,semua pitanya, sehingga tidak dapat dilakukan pengelompokan pita

berdasarkan warnanya seperti pada zimogram isoenzim esterase.

Zimogram peroksidase galur mutan 627-10-3 pada Gambar 3 menun­

jukkan 8 pita, sedang mutan-mutannya,yaitu : mutan 1063, 1067, 1076,

dan 1090 masing-masing terdiri dari 9 pita, hanya mutan 1066 yang

mirip dengan varietas asalnya yang terdiri atas 8 pita.

Zimogram peroksidase varietas Cisadane pada Gambar 4 menunjuk­

kan adanya 9 pita, sedang mutan-mutannya yaitu : OBS 18 dan OBS 306

terdiri dari 8 pita. Pada mutan OBS 208, OBS 297, dan OBS 330 ma­

sing-masing terdapat 9 pita yang berpola mirip dengan varietas

asalnya, tetapi harga Rm dari pita-pita antara 0,45 - 0,85 saling

berbeda.

Pola pita isoenzim peroksidase dauD padi galur mutan 627-10-3

dan varietas Cisadane beserta mutan-mutannya secara umum mirip satu

dengan yang lain, namun berbeda pada jarak migrasi, intensitas warna

pita, dan ada pita di ujung anoda yang tidak muncul. Pita ke-9 pada

varietas Cisadane (Rm = 0,82) tidak muncul pada mutan OBS 18 dan

344

627-10-310631066106710761090

00, 10,20,3'rll 0,4

toajI-..~ 0,58~I 0,6H< ,0,7

0,8r.9

-,:X Katoda1,oL +

+ = Anoda

Gambar 3. Zimogram isoenzim peroksidase daun padi galurmutan 627-10-3, mutan 1063, 1066, 1067, 1076,dan 1090.

OBS 306. Demikian juga pada zimogram peroksidase galur mutan

627-10-3 tidak ditemui pita ke-9, namun sebaliknya pada mutan 1063,

1067, 1076, dan 1090 terdapat pita ke-9.

Dari zimogram isoenzim (Gambar 1 vs Gambar 2 dan Gambar 3 vs

Gambar 4) terlihat jelas bahwa pola zimogram isoenzim antara mutan

dan varietas/galur asalnya tidak banyak berbeda, tetapi an tara

varietas/galur asal atau antara mutan yang berbeda varietas/galur

asalnya jelas sekali pola zimogram isoenzimnya berbeda.

Hasil penelitian ini membuktikan bahwa keeratan hubungan

kerabat, seperti varietas/galur asal dengan mutannya, dengan mudah

dapat ditelusuri lewat pola zimogram isoenzim-isoenzim tertentu.

Secara morfologis mutan 1066 tidak begitu berbeda dengan

345

crSADANE

°

0, ,

0,2

0,3

0,7

0,8

0,9

',0 L +

OBS 18 OBS 208 OBS 297 OBS 306 OBS 330

= Katoda

+ = Anoda

Gambar 4. Zimogram isoenzim peroksidase daun padi varietas

Cisadane, mutan OBS 18, OBS 208, DBS 297,

DBS 306, dan DBS 330.

DBS 18, sehingga bagi mereka yang awam terhadap kedua mutan tersebut

dapat terjadi kekeliruan penentuan. Melalui gambaran berbagai pola

zimogram isoenzim, maka kekeliruan tersebut akan dapat segera

diluruskan.

Di muka telah diungkapkan bahwa pada Gambar 1 terlihat zimogram

isoenzim esterase galur mutan 627-10-3 terdiri atas 13 pita, sedang

mutan-mutannya kurang dari 13 pi ta. Bila dibandingkan dengan

zimogram isoenzim esterase dari Cisadane (Gambar 2) terlihat hanya 8pita, tetapi mutannya ada yang terdiri dari 9 pita. Migrasi pita

pada zimogram isoenzim mutan nyata sekali terlihat lebih mendekati

346

migrasi pita pada zimogram varietas asal. Hal ini juga terlihat pada

pita zimogram isoenzim peroksidase (Gambar 3 dan Gambar 4), meskipun

jumlah pita antara galur mutan 627-10-3 dan mutannya tidak berbeda

dengan jumlah pita Cisadane dan mutannya.

Bila hasil pewarnaan isoenzim esterase digunakan sebagai cirl

lokus allozim yang sama, maka pada mutan yang berasal dari galur

627-10-3 umumnya terjadi perubahan allel pada lokus a, d, dan e,

tetapi pada mutan Cisadane terjadi pada lokus d dan e saja (Gambar 1

dan Gambar 2).

Pewarnaan isoenzim peroksidase ternyata hanya menghasilkan satu

warna, sehingga tidak dilakukan pengelompokan untuk mencirikan

allozim dari lokus tertentu. Meskipun demikian, dari Gambar 3 dan

Gambar 4 tampak bahwa mutan yang berasal dari 627-10-3 hanya

mengalami perubahan pada allozim yang bermigrasi lebih jauh dari

Rm = 0,8, sedang pada mutan dari Cisadane perubahan sudah terjadi

pada Rm = 0,4 dan Rm yang lebih besar lagi.

Dari kenyataan di atas tampaknya pada galur mutan 627-10-3 gen

yang mengontrol enzim peroksidase lebih mantap terhadap iradiasi

gamma daripada gen yang mengontrol enzim esterase. Sebaliknya pada

varietas Cisadane, gen pengontrol enzim peroksidaselah yang lebih

labil terhadap iradiasi.

KESIMPULAN

1. Pola pita isoenzim esterase dan peroksidase menunjukkan adanya

perbedaan pola pita antara mutan dan varietas asalnya.

2. Perbedaan pola pita isoenzim mutan dengan varietas asalnya masih

tidak sebanyak perbedaan pola pita antar-varietas, atau antar-mu­

tan yang berbeda varietas asalnya.

3. Pola pita isoenzim dapat digunakan sebagai bahan penduga varietas

asal suatu mutan atau mutan-mutan yang sevarietas asal.

4. Pada galur mutan 627-10-3 gen pengontrol isoenzim peroksidase

diduga lebih stabil terhadap iradiasi gamma daripada gen pengon­

trol enzim esterasenya, sedang pada varietas Cisadane ditemukan

hal yang sebaliknya.

347

UCAPAN TERIMA KASIH

Ucapan terima kasih disampaikan kepada saudara Firdaus dan

ini.

DAFTAR PUSTAKA

1. GLASZMANN, J.C., de los ROYES, B.G., and KHUSH, G.S., Electropho­retic variation of isoenzymes in plumules of rice (Oryza sativa

L.) - a key to the identification of 76 alleles at 24 loci,IRRIResearch Paper Series 134 (1988) 1.

2. NIELSON, G., The use of isoenzymes probes to identify and labelplant varieties and cultivars, Biological and Medical Research12 (1985) 1.

3. UPADHYA, ARAVINDA, GOVARDHAN, L.K., and VEERABHADRAPPA, P.S., Es­

terase as genetic markers in finger millet, J. Sci. Food Agric.36 (1985) 319.

4. PALANICHAMY, K., and SIDDIQ, E.A., Study of interrelation-shipamong a-genome species of the genus Oryza through isoenzyme va­riation, Theor. Appl. Genet. 50 (1977) 201.

5. HARANTUNG, E.K., FIRDAUS, ROCHESTRI SOFYAN dan ISMACHIN, M.,"Ana­

lisis isoenzim esterase untuk penyidikan genetik mutan pada ta­

han wereng coklat", Aplikasi Isotop dan-Radiasi (Ris. Simp. IVJakarta, 1989), BATAN, Jakarta (1990) 745.

6. CLARK, J.M. JR, and SWITZER,Freeman W.H. and Co., San

348

R.L., Experimental Biochemistry,Fransisco (1977).

ingin diketahui metode pewarnaan yang

beberapa ke las pada pola pita isoenz im

DISKUSI

SOETJIPTO

1. Apakah suatu varietas yang di tanam di berbagai jenis tanah dan

iklim memiliki jumlah pita yang sama ? Bila memang demikian akan

memudahkan bagi para seleksionis dan inspektor lapang untuk

mengidentifikasi suatu varietas. Apakah mungkin terjadi bahwa

varietas yang berbeda memiliki jumlah pita yang sama. Apakah

mutan-mutan yang berasal dari satu induk (umpamanya Cisadane)

memiliki jumlah pita yang berbeda ?

2. Apakah jurnlah pita varietas padi Cisadane sarna dengan kerabat

terdekatnya (Oryza infipogan) ?

ERMIN K.H.

1. Ya. Varietas yang berbeda mungkin saja memiliki jumlah pita yang

sama. Kemungkinan sama, kemungkinan juga berbeda.

2. Belum tentu sama.

SRI KOERNIATI

Pewarnaan merah atau coklat ?

Dari yang telah disaj ikan,

dipakai sehingga diperoleh

esterase yang diperoleh.

ERMIN K.H.

Pewarnaan esterase dilakukan dengan larutan pewarna yang mengandung

substrat I-naftilasetat dan 2-naftil asetat dengan pewarna Fast blue

RR salt yang masing-masing rnenghasilkan warna coklat dan merah tua

pada pita isoenzirn (terdapat dalam journal IRRI yang ditulis oleh

GIIASSMANN).

MUG! ONO

Dari analisis enzym peroksidase terlihat ada beberapa mutan yang

mempunyai pita berbeda dan ada juga yang sama dengan varietas

349

asalnya. Akan tetapi kalau dilihat tanamannya dilapangan justru

mutan-mutan yang mempunyai pita sama, sifat agronominya berbeda dan

sebaliknVa. Kira-kira baiairnana pendapat And~ menosnQi hBl iniT

ERMIN K.n.

Pengenalan genetik dapat disidik tidak saja melalui penampilan pita­

pita peroksidase, tetapi dapat juga dilihat dari isoenzim yang lain.

Dengan isoenzim peroksidase pola pita masih sama (perbedaan belum

terdeteksi), tapi dengan mencoba pewarnaan isoenzym yang lain kita

dapat menyidik adanya perbedaan yang khusus dengan penelitian lebih

lanjut hal ini diharapkan dapat terjawab.

N. sunARNA

Ki ra-kira apa yang menyebabkan adanya perbedaan kestabilan dengan

pengontrol enzym esterase pada galur 627-10-3 dan Cisadane ?

ERMIN K.n.

Kromosom sebagai pembawa sHat mengandung gen-gen tertentu yang

mengontrol sintesa enzym tertentu. Jika padi diiradiasi kemungkinan

terjadi perubahan-perubahan pada susunan rantai DNA, misalnya ada

ikatan-ikatan yang mendukung rantai terputus. Hal ini menyebabkan

produk yang disintesa oleh gen pengontrol tersebut berubah, yang

juga mempengaruhi penampilan pita isoenzym sebagai salah satu produk

gen.

350