BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Metode pemisahan merupakan aspek penting dalam bidang ilmu kimia

karena kebanyakan materi yang terdapat dialam dapat berupa campuran. Untuk

memperoleh materi murni dari suatu campuran , kita harus melakukan suatu

pemisahan. Berbagai teknik pemisahan dapat diterapkan untuk memisahkan

campuran .

Seiring dengan kemajuan zaman yang semakin pesat di negara-negara

berkermbang akan selalu diikuti pula dengan kemajuan ilmu pengetahuan yang

semakin marak di bidang teknologi. Salah satu diantaranya adalah pengembangan

di bidang Biologi Molekuler. Bidang ilmu pengetahuan Biologi Molekuler ini

telah dimulai pada akhir abad ke 19, setelah rnetode elektroforesis ditemukan dan

dipakai untuk menganalisa berbagai kegiatan penelitian di bidang Kimia, Biologi

(Genetika, Taksonomi dan Bio-sistematik). Ringkasnya metode elektroforesis ini

mulai berkembang akhir abad ke 19 setelah ditemukan penelitian yang

menunjukkan adanya efek dari listrik terhadap partikel-partikel atau molekul-

molekul yang bermuatan listrik, dalam ha1 ini termasuk juga protein (Pornet,

Quincke, Hardy. dalam Richardson dkk, 1986). menurut passteur dkk. (1988)

elektroforesis berasal dari bahasa Junani yangmempunyai arti transport atau

perpindahan melalui partikel-partikel listrik.

Penggunaan data khemotaksonomi pada level protein diketahui dapat

digunakan untuk identifikasi organisme pada level spesies dan khususnya untuk

subtypingbakteri dalam spesies yang sama berdasarkan analisis perbandingan

profil protein dan polipeptida (Towner & Cockayne, 1995). Profil protein

mikrobia diperoleh dengan melarutkan komponen sel mikrobia, baik yang

diperoleh dari sel utuh ataupun dari fraksi subselular, dan kemudian dilakukan

pemisahan secara elektroforesis dalam suatu matriks gel seperti poliakrilamid atau

pati. Tergantung pada tipe sistem elektroforesis yang digunakan, protein

dipisahkan berdasarkan sifat-sifat fisikokimiawinya yang meliputi ukuran,

muatan, dan titik isoelektriknya. Protein yang telah dipisahkan, atau subunit

komponen protein, kemudian dapat dideteksi dengan teknik pewarnaan untuk

menghasilkan profil protein.

Salah satu teknik yang sering digunakan untuk analisis protein adalah

SDS-PAGE (Sodium Dodecylsulphate polyacrilamid Gel Electrophoresis). Pola

pita protein sel mikrobia pada PolyAcrilamid GelEelectrophoresis(PAGE) bersifat

spesifik dan reprodusibel. Protein didenaturasi dengan menggunakan panas atau

deterjen, dan untuk menghasilkan subunit polipeptida yang kemudian dapat

dipisahkan dalam elektroforesis berdasarkan berat molekulnya. Agar diperoleh

hasil yang maksimal, maka kultur bakteri yang akan dianalisis ditumbuhkan

terlebih dahulu dalam medium kaya dan dilakukan pemanenan sel pada akhir fase

eksponensial atau awal fase stasioner.

Metode SDS-PAGE telah dibuktikan mampu membedakan sejumlah besar

strain bakteri karena memiliki tingkat resolusi diskriminatif sampai level spesies

dan subspesies atau antar strain dalam satu spesies. Metode ini juga terbukti

memiliki kesesuaian dengan metode hibridisasi DNA-DNA. Nilai similaritas yang

diperoleh dari SDS-PAGE cenderung sama dengan nilai similaritas hasil

hibridisasi DNA sebesar 70 % (Towne & Cockayne, 1995; Vandamme et al.,

1996).

B. Tujuan

a. Memahami konsep teknik elektroforesis khususnya SDS-PAGE dan

memiliki kompetensi melakukannya

b. Mengidentifikasi suatu protein berdasarkan berat molekulnya

C. Prinsip

Pemfokusan isoelektrik adalah merupakan satu modifikasi elektroforesis.

Dalam kes ini, protein dipisahkan oleh cas didalam suatu medan elektrik

pada matrik gel yang telah diwujudkan kecerunan pH menggunakan

amfolit (ampholytes). Protein difokuskan atau migrasi ke lokasi didalam

kecerunan dimana pH sama dengan pI protein tersebut (Rajah 6).

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Elektroforesis

Elektroforesis adalah metode pemisahan berdasarkan perbedaan

mobilitas analit menunjukkan dalam medan listrik diterapkan. metode

elektroforetik dapat diterapkan untuk pemisahan dari suatu sampel dengan

variety luas, termasuk protein, asam nukleat, asam amino dan karbohidrat.

pemisahan dapat dilakukan pada analisis serta skala preparatif. keuntungan

utama atas metode khromatografi cair adalah efisiensi yang lebih tinggi

dari pemisahan elektroforesis. hal ini terutama berlaku bagi molekul besar.

(Andreas Manz, et.al, 2010)

Elektroforesis adalah pergerakan partikel bermuatan listrik atau

molekul dalam medium konduktif di bawah pengaruh medan listrik

diterapkan. media konduktif biasanya buffer berair, juga disebut sebagai

elektrolit atau run penyangga. campuran analit dimasukkan ke dalam

medium yang mengandung jangka penyangga dan medan listrik

diterapkan. Dalam contoh yang ditunjukkan pada gambar 2.1 campuran

analit mengandung molekul bermuatan negatif. berdasarkan atas

permohonan dari medan listrik, anion mulai bergerak menuju elektroda

positif (anoda). perbedaan muatan dan ukuran menyebabkan mobilitas

yang berbeda dan dengan demikian pemisahan komponen sampel yang

berbeda. sama, ion bermuatan positif bergerak menuju katoda dalam

medan listrik diterapkan.(Andreas Manz, et.al, 2010)

Gambar. 2.1. Prinsip Pemisahan Elektroforesis (Andreas Manz, et.al,

2010)

Pemisahan elektroforesis dapat dilakukan dalam larutan bebas atau dalam

larutan yang mengandung matriks non-konduktif seperti agarosa atau

poliakrilamid gel. gratis pemisahan berbasis solusi, capilaries bore sempit

digunakan. pemisahan ion analit terjadi karena perbedaan dalam mobilitas,

perbedaan yaitu di tuntut untuk rasio ukuran. dua analit hanya dapat dipisahkan

jika mereka memiliki biaya yang berbeda untuk rasio ukuran. pemisahan analit

dalam gel juga didasarkan pada perbedaan dalam mobilitas. tambahan, gel

memiliki efek pemisahan. compoundes besar terbelakang lebih dari senyawa yang

lebih kecil. ini berarti bahwa dalam elektroforesis gel dua senyawa dengan biaya

dua rasio ukuran yang sama dapat dipisahkan selama mereka berbeda dalam

ukuran. (Andreas Manz, et.al, 2010)

Jenis- Jenis Elektroforesis

Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase

diam untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan

dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang

lebih besar seperti protein-protein. Kemudian elektroforesis gel berkembang

dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media.

Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas

sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak,

terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi

konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas

tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang

digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas

zat terlarut.

Elektroforesis Gel (GE)

Elektroforesi gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi

molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat

dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut

dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam

matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul

bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun

dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul

sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometer massa, PCR,

kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode

karakterisasi lebih lanjut.

Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang

(crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk

memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau

oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida,

dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang

memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan

poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam

nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang

digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.

Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur

(well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan

kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel

ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat,

arah pergerakan adalah menuju elektrodapositif, disebabkan oleh muatan negatif

alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju

perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu

panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk

menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi

dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein

tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.

Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining)

agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak,

atau pewarna "biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan untuk

keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya

setelah "diwarnai" dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet.

Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut

dibuat.

Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak

setelah proses pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari

"sumur" gel. Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis

mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis

dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti bahwa molekul-molekul

tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda (marker) yang merupakan

campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk

menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis

marka tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur

marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan

ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma

ukuran molekul.

DNA dapat ditentukan ukurannya dengan melakukan migrasi didalam gel

agarose atau gel poliakrilamid. Migrasi DNA didalam gel ini biasa disebut dengan

elektroforesis. Untuk dapat divisualisasikan, maka DNA yang ada di gel harus

diwarnai dengan ethidium bromida kemudian dilihat diatas sinar UV.

DNA merupakan molekul bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan di

medan listrik, DNA akan bergerak (migrasi) dari kutub negatif ke kutub positif.

Pergerakan kecepatannya tergantung dari :

a. Ukuran molekul DNA

b. Kerapatan media gel yang dilalui DNA

c. Arus listrik yang diberikan

Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA harus dicampur dengan

penyangga muatan perwarna loading buffer (dye), yang berfungsi untuk :

1. Menambah densitas, sehingga DNA berada dibagian bawah dari

sumur

2. Perwarna untuk memudahkan meletakkan contoh DNA kedalam

sumur.

3. Dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan.

Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen

DNA dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda

ukuran, kemudian di-sequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA.

Elektroforesis dapat diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan sebagai

berikut.

a. Membandingkan gen homolog dari sspesies yang berbeda,

mengetahui susunan sekuens berbagai genom

b. DNA Fingerprinting

c. Mendeteksi kelainan genetik.

d. Mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan

tertentu

e. Mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel

organisme atau percobaan perlakuan gen

f. Mempelajari evolusi tingkat molecular

g. Mengetahui variasi genetik yang ada di alam

h. Menentukan atau mengidentifikasi berat molekul DNA, RNA, dan

protein tertentu.

i. Mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu

j. Mengetahui jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan

DNA plasmid

k. Menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi lewat PCR

Dalam elektroforesis gel, pemisahan terjadi dalam media hidrogel elektrik

non-konduktif seperti agarosa atau poliakrilamid (PA) yang berisi, buffer

elektrolit. pori-pori fungsi gel molekuler saringan, yang menghambat molekul

bermigrasi menurut ukuran mereka. Selanjutnya, gel bertindak sebagai media

pendukung anticonvective, yang dapat meminimalkan difusi dari molekul sampel,

dan dengan demikian mengurangi pelebaran pita. karenanya, nomor plat tinggi

dan resolusi tinggi dapat dicapai, terutama untuk molekul berat molekul tinggi

seperti DNA atau protein.a jumlah yang sangat besar senyawa karenanya dapat

dipisahkan dalam bentuk tunggal .. sebagai EOF ditekan dalam elctroporesis gel,

hanya analit dengan muatan bersih dapat dipisahkan. senyawa netral tidak

bermigrasi melalui gel bawah pengaruh medan listrik diterapkan. elektroforesis

gel adalah agak lambat dan tenaga kerja - metode intensif, yang tidak mudah

otomatis.

B. SDS-PAGE

SDS-PAGE merupakan suatu teknik elektroforesis yang menggunakan

polyacrylamide sebagai bahan pemisah. SDS-PAGE banyak digunakan dalam

praktikum biologi molekuler, genetik, biokimia, dan biomedik. SDS-PAGE

biasanya digunakan untuk memisahkan protein berdasarkan sifat

electrophoretic mobility (pemisahan komponen atau molekul bermuatan

berdasarkan perbedaan tingkat migrasi dan berat molekulnya (BM) dalam

sebuah medan listrik). Protein yang dipisahkan dengan SDS-PAGE dapat

dikarakterisasi berdasarkan berat molekulnya dengan satuan Kilo Dalton

(kDa). Satu dalton sama dengan satu hidrogen molekul

SDS-PAGE merupakan teknik purifikasi skala kecil yang menghasilkan

pemisahan suatu protein berdasarkan berat molekulnya dalam band (pita)

spesifik yang tampak pada gel polyacrylamide. Teknik purifikasi dalam skala

besar kita dapatkan degnan menggunakan chromatography.

Gel acrylamide alam SDS-PAGE diletakkan diantara dua plat kaca. Ada dua

macam gel yang digunakan, yaitu main atai separating gel dan stacking gel.

Main gel merupakan gel yang komposisinya paling banyak dan terletak

dibagian bawah alat. Main gel berfungsi untuk memisahkan protein

berdasarkan berat molekulnya. Stacking gel terletak pada bagian atas,

digunakan untuk mencetak sumuran (sekat pemisah untuk penempatan

sempel). Protein tertarik ke bagian bawah oleh arus listrik. Protein yang

memiliki berat molekul paling kecil bergerak cepat sehingga tertarik sampai

bagian bawah gel, sedangkan protein yang memiliki berat molekul paling

besar akan berada pada bagian atas dari gel. Protein marker digunakan sebagai

standart untuk menentukan berat molekul dari sampel.

Sejumlah mode pemisahan yang mungkin. Dalam gel native elektroforesis

dibebankan analit dibedakan menurut mobilitas jelas mereka, dan ukuran. natrium

dedocylsulfate-poliakrilamida gel elektroforesis (SDS-PAGE) analit diperlakukan

sedemikian rupa sehingga mereka semua menunjukkan muatan yang sama untuk

sixe rasio. maka mereka hanya dipisahkan oleh perbedaan ukuran mereka.

Gambar 2.3 Elektroforesis Gel (GE)

Gel Media

Elektroforesis Gel poliakrilamida termasuk salah satu elektroforesis yang

umum digunakan selain elektroforesis gel Agarosa dan memiliki kelebihan yaitu :

mudah atau cepat pengerjaanya, murah harganya, pemisahan suatu makromolekul

biologic, biaya pemisahan yang sangat besar.

Menurut Stenesh dalam Titrawani (1996) teknik elektroforesis dapat

dibedakan menjadi dua cara, yaitu : elektroforesis larutan (moving boundary

electrophoresis) dan elektroforesis daerah (zone electrophoresis). Pada teknik

elektroforesis larutan, larutan penyangga yang mengandung makro-molekul

ditempatkan dalam suatu kamar tertutup dan dialiri arus listrik. Kecepatan migrasi

dari makro-molekul diukur dengan jalan melihat terjadinya pemisahan dari

molekul (terlihat seperti pita) di dalam pelarut. Sedangkan teknik elektroforesis

daerah adalah menggunakan suatu bahan padat yang berfungsi sebagai media

penunjang yang berisi (diberi) larutan penyangga. Media penunjang yang biasa

dipakai adalah gel agarose, gel pati, gel poliakrilamida dan kertas sellulose

poliasetat. Adapaun menurut Sargent & George (1975) elektroforesis daerah

disebut sebagai elektroforesis gel dengan dua buah model yaitu horizontal dan

vertikal. Metode yang biasa digunakan adalah model horizontal, karena

mempunyai beberapa keuntungan yaitu peralatan yang digunakan sangat

sederhana, relatif murah dan pemisahan untuk enzim tertentu dapat menghasilkan

pemisahan yang lebih baik.

Gel yang digunakan dalam elektroforesis ada 3 macam:

1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi dalam penanda oligonukleotida

dan menganalisis pemanjangan primer.

2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang

berukuran besar.

3. Gel agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem

elektroforesis RNA pada Ukuran Standar (Davis dkk. 1994: 151).

Gel agarosa merupakan turunan desulfonated agar-agar, suatu senyawa

yang dapat diisolasi dari membran sel ganggang. untuk persiapan gel, agarosa

dilarutkan dalam buffer yang dipilih, dipanaskan sampai titik didih dan

dituangkan ke dalam tangki elektroforesis. pada pendinginan gelasi terjadi. pori-

pori di agarosa gel cukup besar mulai dari 150 nm konsentrasi 1% (10 mg mL-1)

sampai 500 nm FUNDS konsentrasi 0,16% (1,6 mg/mL-1). pori-pori besar hanya

terbatas untuk protein berat molekul yang sangat tinggi atau asam nukleat. untuk

sebagian analit, agarosa gel nonrestrictive.

Gel Poliakrilamida disiapkan oleh co-polimerisasi akrilamida dan agen

cross-linking, NN metilen - bisacrylamide dalam buffer elektroforesis dipilih.

ukuran pori dan sifat pengayakan maka molekul PA gel tergantung pada

konsentrasi total serta tingkat silang C%

Pergerakan DNA pada elektroforesis dipengaruhi oleh beberapa faktor

sebagaberikut:

1. Ukuran molekul DNA.

Molekul DNA kecil akan melintasi gel lebih cepat karena ruang gerak

yang tersedia untuk melintasi gel lebih banyak.

2. Konsentrasi gel.

Konsentrasi agarosa yang semakin tinggi menyebabkan molekul-molekul

DNA sukar melewati gel. Konsentrasi gel tinggi mempermudah DNA

berukuran kecil melewati gel, sedangkan konsentrasi gel rendah

mempermudah molekul DNA berukuran besar untuk melintasi gel.

3. Bentuk Molekul

Molekul yang berbentuk supercoil atau elips akan bergerak lebih cepat

melewati gel.

4. Densitas muatan

Molekul dengan densitas tinggi akan lebih cepat bergerak dibandingkan

molekul dengan densitas yang rendah. Densitas merupakan jumlah muatan

per unit volume molekul.

5. Pori-pori gel.

Pori-pori yang lebih besar akan mempermudah pergerakan DNA melewati

gel, sedangkan pori-pori yang lebih kecil akan lebih sulit dilalui oleh

molekul DNA.

6. Voltase.

Voltase tinggi akan menyebabkan cepatnya pergerakan molekul DNA. Hal

tersebut dikarenakan oleh tingginya muatan positif yang ditimbulkan.

7. Larutan buffer.

Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik

sehingga migrasi DNA akan lebih cepat.

Aliran Elektroforentik.

Sifat alamiah ion-ion selalu bergerak menuju kutub listrik yang berlawanan,

kation akan bergerak menuju katoda (kutub listrik negatif), sebaliknya anion akan

bergerak menuju anoda (kutub listrik positif). Akan tetapi, molekul netral tidak

akan bergerak. Aliran ion-ion menuju kutub listrik yang berlawanan ini disebut

aliran elektroforetik yang diperlihatkan dalam gambar 2. Aliran elektroforetik

inilah yang merupakan dasar pemisahan dalam elektroforesa klasik (Sumar

Hendayana, Ph.D, 2006).

Gambar 2.4. pengaruh medan listrik terhadap ion-ion (aliran

elektroforetik) (sumber: L. Thompson, et.al (1997))

Aliran elektroosmotik.

Dalam elektroforesik kapiler, pipa kapiler yang terbuat dari gelas menggantikan

media kertas atau lempeng silika gel pada elektroforesis klasik. Di sini, latutan

buffer dipakai sebagai pengisis pipa kapiler. Bila permukaan pipa kapiler tersebut

berkontak dengan larutan dalam air maka permukaan gelas akan dilapisi anion

(SiO-) yang berasal dari reaksi hidrolisis silika dengan air sehingga permukaan

pipa kapiler tersebut bermuatan negatif. Akibatnya kation-kation yang berasal dari

buffer menutupi lapisan negatif pipa kapiler dan merupakan lapisan kedua pada

permukaan pipa kapiler. Kalau arus listrik searah bertegangan tinggi dialirkan

diantara ujung-ujung pipa kapiler maka kation-kation yang melapisi permukaan

pipa kapiler tersebut akan bergerak menuju katoda (kutub negatif). Aliran lapisan

kation yang cepat ke katoda ini dikenal dengan aliran elektrostatik. Aliran

elektroosmotik diilustrasikan dalam gambar 3(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Gambar 2.5. Pengaruh medan listrik terhadap ion-ion (aliran

elektroosmotik) (sumber: L. Thompson, et.al (1997))

Karena cepatnya aliran elektroosmotik maka aliran elektroosmotik akan

lebih dominan dibandingkan dengan aliran elektroforetik. Dengan demikian

secara keseluruhan aliran menuju ke satu arah yaitu ke katoda. Jadi dalam

kenyataannya semua molekul baik yang bermuatan maupun netral akan terbawa

ke katoda. Tentunnya ion positif (kation) bergerak menuju katoda paling cepat

karena aliran elektroforetiknya searah dengan aliran elektroosmotik. Molekul

netral menepati urutan tercepat kedua dan ion negatif (anion) paling lambat karena

aliran elektroforentiknya berlawanan dengan aliran elektroosmotik(Sumar

Hendayana, Ph.D, 2006).

Gerakan ion-ion atau molekul menuju katoda dalam eksperimen

elektroforesis kapiler diperhatikan dalam gambar 3. Untuk lebih memahami

konsep gerakan ion-ion atau molekul netral ke katoda dapat digunakan suatu

analogi. Aliran elektroosrnotik dapat dianalogikan sebagai aliran sungai yang

deras. Ion positif (kation) dapat dianalogikan sebagai ikan yang sedang berenang

ke hilir sedangkan ion negatif (anion) dapat dianalogikan sebagai ikan yang

sedang berenang ke hulu, dan molekul netral dapat dianalogikan sebagai ikan

mati. Bila air sungai mengalir dengan deras maka semua ikatan yang ada dalam

sungai akan menuju ke hilir.

Kecepatan ion-ion atau molekul bermuatan (solut) menuju katoda

dipengaruhi oleh medan listrik yang dapat di formulasi sebagai berikut

V = μef E + μeo EV menyatakan kecepatan solut menuju katoda, μef adalah mobilitas elektroforetik,

μeo adalah mobilitas elektroosmotik, dan E adalah tegangan listrik(Sumar

Hendayana, Ph.D, 2006).

Gambar 2.6 Pengaruh aliran elektroosmotik dalam elektroforesis

kapiler (sumber: L. Thompson, et.al (1997)

C. Instrumentasi Elektroforesis

1. Elektroforesis Gel

Sebuah ruang elektroforesis dengan waduk penyangga dan thermostat

pendingin dan komponen utama yang diperlukan untuk elektroforesis gel.

pemisahan dapat dilakukan secara vertikal atau horizontal. catu daya memberikan

tegangan typi xallally 200-500 V dengan arus listrik cof 400 Artikel Baru 100.

elektroda dicelupkan ke dalam waduk penyangga di setiap sisi gel. untuk sebagian

pemisahan biomolekuler, pH Sochen bahwa analit bermuatan negatif. sehingga

analit bermigrasi ke arah pada anoda. Seluruh instrumen dalam kotak isolasi untuk

melindungi pengguna dari tegangan tinggi .

Ruang elektroforesis mengandung matriks gel direndam dalam buffer

elektrolit. gel vertikal dapat dipolimerisasi dalam tabung kaca atau Perspex

dengan 0,5 sampai 1 cm id dan 3 sampai 10 cm panjangnya. alternatif gel dapat

berperan sebagai lempengan persegi panjang tipis di mana beberapa sampel dapat

dijalankan secara paralel. gel slab dapat dipolimerisasi pada foil lembam untuk

pemisahan horizontal atau dituangkan ke dalam tangki vertikal. ketebalan gel slab

adalah sekitar 1-3 mm. minigel yang memiliki panjang dan lebar sekitar 8cm x 8

cm, tapi gel lebih besar hingga 40 x 20 cm juga umumnya digunakan.

Untuk pemisahan vertical,Sampel dilarutkan dalam gliserol atau sukrosa

solusi kepadatan tinggi untuk mencegah mereka dari pencampuran dengan

penyangga di upper reservoir. sumur sampel dalam gela slab dibuat selama

pengecoran dengan menggunakan sisir atau pembentuk yang tepat. karena bentuk

dari sampel sumur, bergerak analit dalam bentuk pita yang sempit dan lebar

Termostat diperlukan untuk kontrol tempratur. ruang dikontrol

temperatrue memastikan lebih direproduksi separatios Dan karena mereka

membantu untuk mengusir panas dan melindungi analit sensitif dari degradasi

termal. Pemisahan dapat memnggunakan waktu beberapa jam. setelah selesai gel

dihapus dari pemegangnya. Pita analit daripada divisualisasikan, biasanya dengan

pewarnaan.

Gambar 2.7 Bentuk –bentuk Elektroforesis Gel; a. bentuk tabung; b. bentuk

horizontal; c. bentuk vertical (Andreas Manz, et.al, 2010).

Visualisasi Dan Deteksi

Bentuk Pita dipisahkan yang paling sering divisualisasikan dengan

pewarnaan dengan warna, pewarna fluorescent atau dengan perak. pewarna dan

commomly digunakan adalah coomassie brilian biru. gel direndam dalam larutan

alkohol asam ini temperatur tinggi pewarna dan dibiarkan selama beberapa jam,

pewarna Kelebihan ini kemudian dihapus oleh jumlah mencuci langkah. Deteksi

batas untuk protein berkisar sekitar 100 ng ke 1. pewarnaan perak lebih sensitif

dengan batas deteksi, 1 ng. proses pewarnaan ini mirip dengan protografhy

Metode Gel Elektroforesis

A. Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel Elektrforesis (SDS – PAGE)

Prinsip pemisahan SDS_PAGE semata-mata didasarkan pada perbedaan

ukuran protein dan berat molekul. protein yang benar-benar didenaturasi dengan

adanya deterjen anionik natrium dedocyl asetat (SDS). Preparasi sampel biasanya

melibatkan pemanasan protein pada temperature 950C. dengan adanya SDS yang

berbih dan agen tiol-reducing seperti ᵝmercapto etanol. Hasilnya lengkap

diperoleh terjadi pada struktur sekunder dan tersier. Molekul melintang melalui

jembtan yaitu sulfide dan ikatan SDS dengan asam amino

B. Isoelektrik Focussing (IEF)

Isoelektrik Focussing (IEF) memungkinkan pemisahan analit zwitterionic

seperti protein atau peptida menurut ke titik isoelektrik mereka. ief diterapkan

untuk pemisahan dan pemurnian protein peptida dan asam amino pada analitis

serta skala preparatif. Gel agarose dan PA keduanya digunakan pada metode IEF.

C. Dua Dimensi Gel Elektroforesis (2D-GE)

Pada 2D-GE, dua metode elektroforesis dikombinasikan dengan gel

tunggal. Bagian yang satu akan terpisah yang dibentuk dengan satu dimensi,

berikutnya yang lain akan terpisah sama dengan yang pertama. Dengan metode

ini, pencampuran seribu protein atau asam nukleat dapat dipisahkan dengan

resolusi yang tinggi. Hasil fingerprint dapat dibandingkan dengan database

elektronik. Hasilnya bisa, bagaimanapun, sulit untuk mereproduksi dan metode

ini secara teknis menantang membutuhkan pengalaman personil dalam operasi.