Latar Belakang

adalah salah satu teknik pemisahan paling populer, maka tak heran jika elektroforesis disebut sebagai pintu gerbang dari berbagai penelitian biologi molekular.

Pada prinsipnya elektroforesis itu adalah teknik pemisahan campuran molekul yang didasarkan pada perbedaan muatan listriknya sehingga pergerakan molekul-molekul tersebut pada suatu fasa diam (stationary phase) dalam sebuah medan listrik akan berbeda-beda. Kisah teknik pemisahan DNA/RNA ini berawal dari sekelompok ilmuwan biokimia di awal tahun 1950-an yang sedang meneliti mekanisme molekular DNA/RNA hidrolisis. Saat itu, tepatnya tahun 1952, Markham dan Smith mempublikasikan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui mekanisme pembentukan zat antara (intermediate) posfat siklik, yang kemudian menghasilkan nukleosida 2′-monoposfat dan 3′-monoposfat. Bagaimana keduanya bisa mengungkap rahasia ini? Ternyata mereka menggunakan suatu peralatan yang dapat memisahkan komponen campuran reaksi hidrolisis tadi, salah satunya yaitu nukleotida ‘siklik’ yang membawa pada kesimpulan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui pembentukan intermediate posfat siklik. Peralatan itu mereka namakan ‘elektroforesis‘, yang dibuat dari kertas saring Whatman nomor 3, sebuah tangki kecil dan berbagai larutan penyangga (buffer). Nukleotida yang sudah terhidrolisis ditaruh di atas kertas saring, kemudian arus listrik dialirkan melalui kedua ujung alat elektroforesis. Arus listrik yang dialirkan ini ternyata dapat memisahkan campuran kompleks reaksi tadi menjadi komponen-komponennya, ini akibat adanya perbedaan minor antara struktur molekul RNA yang belum terhidrolisis, zat antara (intermediate) dan hasil reaksi (nukleosida 2′-monoposfat dan nukleosida 3′-monoposfat) yang menyebabkan mobilitas alias pergerakan mereka pada kertas saring berbeda-beda kecepatannya. Karena pada akhir proses elektroforesis komponen tersebut terpisah-pisah, mereka dapat mengisolasi dan mengidentifikasi setiap komponen tersebut.

Tinjauan pustaka

Untuk mengetahui kemampuan hidup mikroorganisme dalam media yang mengandung logam berat, maka dilakukan pengjitungan jumlah sel mikroorganisme yang diinokulasi pada media cair dengan konsentrasi Cr(VI) 0 ppm dan 10 ppm selama 16 jam. Biakan yang tumbuh diencerkan beberapa kali pengenceran 10-5 dan 10-6. hasil pengneceran ditumbuhkan pada media LB padat sebanyak 100 µl, dan diinkubasi lagi selama 16 jam suhu 37 ºC. Koloni yang tebentuk dihitung dengan colony counter dan dihitung jumlah sel mikrooganisme dalam satuan sel/ml (Hadioetomo, 1993).

Elektroforesis dikatakan sebagai analisis yang ideal untuk memurnikan komponen protein dari campuran sampel dengan cara penambahan medium yang dapat mengikat protein selama elektroforesis. Metode terbaik dalam pemurnian protein dengan tehnik elektroforesis adalah dengan bahan polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Gel poliakrilamid merupakan larutan dari akrilamid dan bisakrilamid (Hames, 1990; Matsudaira, 1993; Davis,et.al, 1994).

Protein marker digunakan untuk mengidentifikasi berat molekul dari campuran polypeptida (Hames & Rickwood, 1990). Marker protein yang digunakan memiliki rentang berat molekul 212 kDa- 11,3 kDa. Dari hasil elektroforesis terdapat sejumlah pita protein yang memiliki ketebalan berbeda-beda. Protein yang memiliki ketebalan dan intensitas warna yang lebih besar dibandingkan protein lain dan selalu ada di setiap variaetas disebut protein mayor (Wijaya & Rahman: 2005). Penggunaan SDS dan

merkaptoetanol disertai dengan pemanasan akan memecah struktur tiga dimensi dari protein, terutama ikatan disulfida menjadi subunit-subunit polipeptida secara individual. SDS juga membungkus rantai protein yang tidak terikat dengan muatan negatif yang sama membentuk kompleks SDS-protein. Kompleks SDS protein mempunyai densitas muatan yang identik dan bergerak pada gel hanya berdasarkan ukuran protein (Wijaya & Rohman, 2005).

Alasan elektroforesis digunakan dalam penelitian ini karena memiliki peran sangat penting dalam proses pemisahan molekul-molekul biologi, khususnya protein. Karena disamping metode tersebut tidak mempengaruhi struktur biopolimer, tetapi juga sangat sensitif terhadap perbedaan muatan dan berat molekul yang cukup kecil (Bachrudin, 1999). Protein yang dialirkan dalam medium yang menagndung medan listrik maka senyawa-senyawa yang bermuatan akan bergerak dalam larutan sebagai akibat dari sifat polaritas yang berlawanan, maka mobilitas suatu molekul meupakan fungsi dari bentuk, ukuran molekul, dan besar tipe muatan.

Elektroforesis

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik . Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:

F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik.

Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA.

Jenis elektroforesis

Perangkat elektroforesis gel

Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion kompleks.Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut.

Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein. Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media.

Banyak molekul biologis seperti asam amino, peptida, protein, nukleotida dan asam-asam nukleat memiliki gugus yang dapat engion sehingga bermuatan listrik, baik sebagai kation (+) atau anion (-). Bahkan senyawa yang non polar seperti karbohidrat dapat diberi muatan.

Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan lisrtik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat di deteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, atau pun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi keelektroda negative dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatanya. Oleh karena partikel sol bermuatan listrik, maka partikel ini akan bergerak dalam medanlistrik. Pergerakan ini disebut elektroforesis. Jika system koloid bermuatan negative, maka partikel itu akan menuju electrode positif

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik . Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:

Fe = qE, F= gaya Lorentz, q= muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik.

Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA. Pergerakan molekul terutama tergantung di muatan yang ada pada permukaan partikel, tanda dan besarnya muatan pembawa oleh variasi group ionogenik. Tergantung kepada kekuatan molekul listrik dan pH dari medium dalam mengkateristik, sehingga pemisahan molekul dapat terjadi karena efek seleksi dan medium yang sesuai.

Jenis Elektroforesis

1. Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut.

2. Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein. Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media.

Medium Pendukung

Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan medium pendukung untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan medium pendukung yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Efek penguapan juga dapat diturunkan minimal jika elektroforesis dilakukan di medium pendukung yang dicelupkan dengan larutan buffer. Pemisahan sempurna suatu campuran dapat terjadi efektif dalam zona tertentu.

Meskipun medium pendukung relatif stabil (inert), komposisinya mungkin akan menyebabkan penyerapan, migrasi elektron (elektro osmosis) atau penyaringan berdasarkan ukuran molekulnya, yang kesemuanya mempengaruhi kecepatan gerak senyawa.

1. Cellulose asetat

2. Larutan Buffer

Larutan buffer (penyangga) ini menstabilkan pH medium pendukung. Buffer juga dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena beberapa hal, yaitu :

- Komposisi => Buffer harus tidak mengikat senyawa yang dipisahkan karena akan mempengaruhi kecepatan gerak. Buffer borat dipakai untuk memisahkan karbohidrat, karena dapat membentuk gabungan yang bermuatan listrik dengan karbohidrat.

- Konsentrasi => Dengan naiknya kekuatan ion buffer, jumlah arus listrik yang terbawa meningkat dan bagian aliran yang dibawa sampel menurun, sehingga memperlambat geraknya. Kekuatan ion tinggi dalam buffer akan meningkatkan arus keseluruhan sehingga panas juga meningkat, biasanya dipilih 0,05 -0,10M.

- Ph => Tingkat ionisasi asam-asam organik akan bertambah apabila pH bertambah, sebaliknya untuk basa-basa organik,oleh sebab itu tingkat kecepatan geraknya juga terpengaruh oleh pH. Kedua pengaruh dapat terjadi pada senyawa seperti asam aminoyang memiliki sifat asam dan basa

3. Medan elektrik

Apabila voltase diberikan diantara dua elektroda, arus ditentukan oleh tahanan dalam medium.

- Voltase => Apabila jarak antara dua elektroda adalah 1 meter dan perbedaan potensial antara keduanya adalah V volt sehingga gradient potensialnya adalah V/1m. Kenaikan gradient potensial akan menyebabkan kecepatan gerak ion.

- Aliran listrik => Arus aliran listrik dalam larutan antara dua elektroda disebabkan umumnya oleh ion buffer dan sedikit oleh ion dalam sampel. Kenaikan voltase akan meningkatkan jumlah muatan yang dipindahkan setiap detik kearah elektroda. Jarak yang ditempuh ion akan sebanding dengan waktunya.

- Tahanan => Medium elektroforesa menimbulkan pada aliran ion sebanding dengan jenis medium, jenis buffer dan konsentrasinya. Tahanan akan meningkat dengan bertambahnya jarak antara elektroda, namun berkurang dengan bertambahnya luas permukaan elektroda dan konsentrasi ion dalam buffer.

Daftar Pustaka

Paper Electrophoresis. Image from http://www.funsci.com

Wijaya. S.K.S & Rohman, L. 2005. Fraksinasi dan Karakterisasi protein Utama Biji Kedelai.Fakultas MIPA Universitas Jember

Hadioetomo, R.S. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta: UI Press

Bachrudin. Z. 1999. Petunjuk Laboratorium: Isolasi, Identifikasi, dan Pewarnaan Protein. PAU Bioteknologi: UGM Yogyakarta.

Hames, B.D & Rickwood.1990. A Practical Approach: Gel elektrophoresis protein. Huntington: Robert E Krieger Publishing Company

Matsudaira, P. 1993. A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencing. 2nd Ed. California: Academic Press. Inc

Davis, P.H dan V.H Heywood. 1963.Basic Methods in Molecular Biology. 2nd Ed. Conecicut: Appleton & Lange.

Finkelstein, 2007, Nature Milestones; DNA Technologies, Nature Publishing Group.

http://dukeresearch.blogspot.com/2009/04/flipping-through-chronicles-of-nobel.html

http://sciencebiotech.net/elektroforesis-pintu-gerbang-penelitian-biologi-molekular

Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik.

Kecepatan molekul yang bergerak pada medan lisrtik tergantung pada muatan, bentuk dan

ukuran. Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat di deteksi dengan pewarnaan atau

autoradiografi, atau pun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. 

Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi

medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul

biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi keelektroda negative dan sebaliknya.

Banyak molekul biologis seperti asam amino, peptida, protein, nukleotida dan asam-asam nukleat

memiliki gugus yang dapat engion sehingga bermuatan listrik, baik sebagai kation (+) atau anion

(-). Bahkan senyawa yang non polar seperti karbohidrat dapat diberi muatan.

Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi

keelektroda negative dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk

memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatanya. Oleh karena partikel sol bermuatan listrik,

maka partikel ini akan bergerak dalam medan listrik. Pergerakan ini disebut elektroforesis. Jika

sistem koloid bermuatan negative, maka partikel itu akan menuju elektrode positif

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan

perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik . Medan listrik dialirkan pada suatu

medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini digunakan dengan

memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan

negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri

arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan

bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada

nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini

dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang

diamati dan kondisi elektris lingkungan:

Fe = qE

F= gaya Lorentz, q= muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik.

Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan

fragmen DNA.

Pergerakan molekul terutama tergantung di muatan yang ada pada permukaan partikel, tanda dan

besarnya muatan pembawa oleh variasi group ionogenik. Tergantung kepada kekuatan molekul

listrik dan pH dari medium dalam mengkateristik, sehingga pemisahan molekul dapat terjadi

karena efek seleksi dan medium yang sesuai.

Jenis jenis Elektroforesis

1. Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan

partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan

ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel

dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang

digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut.

2. Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk

memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel kanji

(sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein.

Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai

gel media.

Medium Pendukung

Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan medium pendukung untuk mencegah terjadinya

difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa

merupakan medium pendukung yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat.

Efek penguapan juga dapat diturunkan minimal jika elektroforesis dilakukan di medium pendukung

yang dicelupkan dengan larutan buffer. Pemisahan sempurna suatu campuran dapat terjadi efektif

dalam zona tertentu.

Meskipun medium pendukung relatif stabil (inert), komposisinya mungkin akan menyebabkan

penyerapan, migrasi elektron (elektro osmosis) atau penyaringan berdasarkan ukuran molekulnya,

yang kesemuanya mempengaruhi kecepatan gerak senyawa.

1. Cellulose asetat

2. Larutan Buffer

Larutan buffer (penyangga) ini menstabilkan pH medium pendukung. Buffer juga dapat

mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena beberapa hal, yaitu :

- Komposisi

Buffer harus tidak mengikat senyawa yang dipisahkan karena akan mempengaruhi kecepatan

gerak. Buffer borat dipakai untuk memisahkan karbohidrat, karena dapat membentuk gabungan

yang bermuatan listrik dengan karbohidrat.

- Konsentrasi

Dengan naiknya kekuatan ion buffer, jumlah arus listrik yang terbawa meningkat dan bagian aliran

yang dibawa sampel menurun, sehingga memperlambat geraknya. Kekuatan ion tinggi dalam

buffer akan meningkatkan arus keseluruhan sehingga panas juga meningkat, biasanya dipilih 0,05

-0,10M.

- pH

Tingkat ionisasi asam-asam organik akan bertambah apabila pH bertambah, sebaliknya untuk

basa-basa organik,oleh sebab itu tingkat kecepatan geraknya juga terpengaruh oleh pH. Kedua

pengaruh dapat terjadi pada senyawa seperti asam aminoyang memiliki sifat asam dan basa

3. Medan elektrik

Apabila voltase diberikan diantara dua elektroda, arus ditentukan oleh tahanan dalam medium.

- Voltase

Apabila jarak antara dua elektroda adalah 1 meter dan perbedaan potensial antara keduanya

adalah V volt sehingga gradient potensialnya adalah V/1m. Kenaikan gradient potensial akan

menyebabkan kecepatan gerak ion.

- Aliran listrik

Arus aliran listrik dalam larutan antara dua elektroda disebabkan umumnya oleh ion buffer dan

sedikit oleh ion dalam sampel. Kenaikan voltase akan meningkatkan jumlah muatan yang

dipindahkan setiap detik kearah elektroda. Jarak yang ditempuh ion akan sebanding dengan

waktunya.

- Tahanan

Medium elektroforesa menimbulkan pada aliran ion sebanding dengan jenis medium, jenis buffer

dan konsentrasinya. Tahanan akan meningkat dengan bertambahnya jarak antara elektroda,

namun berkurang dengan bertambahnya luas permukaan elektroda dan konsentrasi ion dalam

buffer.

Elektroforesis

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam

sebuah medan listrik. Teknik ini dipelopori pada tahun 1937 oleh ahli kimia Swedia Arne Tiselius untuk pemisahan protein.

Sekarang telah meluas ke banyak pemisahan kelas yang berbeda lain dari biomolekul termasuk asam nukleat, karbohidrat dan

asamamino. Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan.

Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan

negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke

kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak

molekul tersebut tergantung pada muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini

dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris

lingkungan:

F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik.Secara umum, elektroforesis

digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA.

Jenis-Jenis Elektroforesis dan Cara Kerja

1. Elektroforesis Kertas

Kisah teknik pemisahan DNA/RNA ini berawal dari sekelompok ilmuwan biokimia di awal tahun 1950-an yang sedang meneliti

mekanisme molekular DNA/RNA hidrolisis. Saat itu, tepatnya tahun 1952, Markham dan Smith mempublikasikan bahwa

hidrolisis RNA terjadi melalui mekanisme pembentukan zat antara (intermediate) posfat siklik, yang kemudian menghasilkan

nukleosida 2′-monoposfat dan 3′-monoposfat. Ternyata mereka menggunakan suatu peralatan yang dapat memisahkan

komponen campuran reaksi hidrolisis tadi, salah satunya yaitu nukleotida ‘siklik’ yang membawa pada kesimpulan bahwa

hidrolisis RNA terjadi melalui pembentukan intermediate posfat siklik. Peralatan itu dinamakan ‘elektroforesis‘, yang dibuat dari

kertas saring Whatman nomor 3, sebuah tangki kecil dan berbagai larutan penyangga (buffer). Nukleotida yang sudah

terhidrolisis ditaruh di atas kertas saring, kemudian arus listrik dialirkan melalui kedua ujung alat elektroforesis.

Arus listrik yang dialirkan ini ternyata dapat memisahkan campuran kompleks reaksi tadi menjadi komponen-komponennya, ini

akibat adanya perbedaan minor antara struktur molekul RNA yang belum terhidrolisis, zat antara (intermediate) dan hasil reaksi

(nukleosida 2′-monoposfat dan nukleosida 3′-monoposfat) yang menyebabkan mobilitas alias pergerakan mereka pada kertas

saring berbeda-beda kecepatannya. Karena pada akhir proses elektroforesis komponen tersebut terpisah-pisah, sehingga

dapat mengisolasi dan mengidentifikasi setiap komponen tersebut.

Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel yang terlarut sebagai

fase gerak, terutama ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang system pemisahan.

Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang

digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorbsivitas zat terlarut.

2. Elektroforesis Gel Kanji

Selanjutnya teknik elektroforesis dikembangkan untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar. Tahun 1955 Smithies

mendemonstrasikan bahwa gel yang terbuat dari larutan kanji dapat digunakan untuk memisahkan protein-protein serum

manusia. Caranya yaitu dengan menuangkan larutan kanji panas ke dalam cetakan plastik, setelah dibiarkan mendingin kanji

tersebut akan membentuk gel yang padat namun rapuh. Gel kanji berperan sebagai fasa diam (stationary phase)

menggantikan kertas saring Whatman pada teknik terdahulu. Ternyata elektroforesis gel yang diperkenalkan Smithies memicu

para ilmuwan untuk menemukan bahan kimia lain yang dapat digunakan sebagai bahan gel yang lebih baik, seperti agarosa

dan polimer akrilamida. Dan penemuan elektroforesis gel kanji di awal karir Smithies membawanya menerima hadiah nobel

bidang kedokteran tahun 2007.

Teknik elektroforesis gel makin berkembang dan disempurnakan, hingga 12 tahun kemudian ditemukan gel poliakrilamida

(PAGE = Polyacrilamide Gel Electrophoresis) yang terbentuk melaluiproses polimerisasi akrilamida dan bis-akrilamida. PAGE

ini sanggup memisahkan campuran DNA/RNA atau protein dengan ukuran lebih besar. Meskipun aplikasi elektroforesis makin

berkembang luas, namun ternyata teknik ini masih menyerah jika digunakan untuk memisahkan DNA dengan ukuran yang

super besar, misalnya DNA kromosom. Campuran DNA kromosom tidak dapat dipisahkan meskipun ukuran mereka berbeda-

beda.

1.1. Latar Belakang

Elektroforesis merupakan metode yang sudah dipakai oleh banyak peneliti terutama peneliti yang berkaitan dengan genetika ataupun molecular. Seiring dengan kemajuan zaman yang semakin pesat dinegara-negara berkembang akan selalu diikuti pula dengan kemajuan ilmu pengetahuan yang semakin marak dibidang teknologi. Salah satu diantaranya adalah pengembangan di bidang Biologi Molekul. Bidang ilmu pengetahuan Bidang Molekuler ini telah dimulai pada akhir abad ke 19, setelah metode elektroforesis ditemukan dan dipakai untuk menganalisa berbagai kegiatan penelitian di bidang Kimia, Biologi (Genetika, Taksonomi dan Bio-sistematik).

Metode elektroforesis mulai berkembang akhir abad ke-19 setelah ditemukan penelitian yang menunjukkan adanya penelitian yang menunjukkan adanya efek dari listrik terhadap partikel-partikel atau molekul-molekul yang bermuatan listrik, dalam hal ini termasuk juga protein. Elektroforesis berasal dari bahasa Yunani yang mempunyai arti transport atau perpindahan melalui partikelpartikel listrik. Metode elekroforesis telah digunakan dan dikembangkan didalam teknik analisa untuk penelitian di bidang biologi dan genetika. Metode tersebut berkembang sangat pesat sekali di zaman kemajuan teknologi, disebabkan karena pengerjaannya sangat sederhana dan sangat mudah. Di dalam ilmu biologi maupun biologi molekuler, metode elektrorofesis banyak digunakan untuk taksonomi, sistematik dan genetik dari hewan ataupun tumbuhan.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.

Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Elektroforesis biasanya memerlukan media penyangga sebagai tempat bemigrasinya molekul-mulekul biologi. Media penyangganya bermacam-macam tergantung pada tujuan dan bahan yang akan dianalisa. Media penyangga yang sering dipakai dalam elektroforesis antara lain yaitu kertas, selulose, asetat dan gel. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat.

Beberapa faktor mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein yakni:

Ukuran molekul protein

Migrasi molekul protein berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul berukuran kecil.

Konsentrasi gel

Migrasi molekul protein pada gel berkosentrasi rendah lebih cepat daripada migrasi molekul protein yang sama pada gel berkosentrasi tinggi.

Bufer (penyangga) dapat berperan sebagai penstabil medium pendukung dan dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena ion sebagai pembawa protein yang bermuatan. Kekuatan ion yang tinggi dalam bufer akan meningkatkan panas sehingga aliran listrik menjadi maksimal. Hal ini dapat mempercepat gerakan molekul protein. Kekuatan ion rendah dalam bufer akan menurunkan panas sehingga aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi molekul protein sangat lambat.

Medium penyangga

Medium pendukung ideal untuk elektroforesis adalah bahan kimia inert yang bersifat relatif stabil, mudah ditangani dan mempunyai daya serap yang baik, sebagai migrasi elektron atau penyaringan berdasarkan ukuran molekul seperti gel poliakrilamid.

Jika ukuran pori dari medium kira-kira sama dengan molekul, maka molekul yang lebih kecil akan berpindah lebih bebas di dalam medan listrik, sedangkan molekul yang lebih besar akan dibatasi dalam migrasinya. Besarnya pori-pori dapat diatur dengan mengubah konsentrasi penyusun gel poliakrilamidnya yaitu akrilamid dan bisakrilamid.

Kekuatan voltase

Ø Voltase yang dipakai rendah (100-500) V, kecepatan migrasi molekul sebanding dengan tingginya voltase yang digunakan.

Ø Voltase yang dipakai tinggi (500-10000) V, mobolitas molekul meningkat secara lebih tajam dan digunakan untuk memisahkan senyawa dengan BM rendah serta jenis arus yang dipakai selalu harus searah (bukan bolak balik).

6.Temperatur medium disaat proses elektroforesis berlangsung. Jika temperatur tinggi akan mempercepat proses bermigrasinya protein dan sebaliknya jika temperatur rendah akan mengurangi kekuatan bermigrasinya protein.

Pada saat elektroforesis berlangsung, protein akan bergerak dari elektroda negatif menuju elektroda positif sampai pada jarak tertentu pada gel poliakrilamid tergantung pada berat molekulnya. Semakin rendah berat molekulnya maka semakin jauh pula protein bergerak atau mobilitasnya tinggi. Sebaliknya protein dengan berat molekul lebih besar akan bergerak pada jarak yang lebih pendek atau mobilitasnya rendah.

Hasil elektroforesis akan didapatkan pita-pita protein yang terpisahkan berdasarkan berat molekulnya. Tebal tipisnya pita yang terbentuk dari pita protein menunjukkan kandungan atau banyaknya protein yang mempunyai berat molekul yang sama yang berada pada posisi pita yang sama. Hal ini sejalan dengan prinsip pergerakan molekul bermuatan, yakni molekul bermuatan dapat

bergerak bebas di bawah pengaruh medan listrik, molekul dengan muatan dan ukuran yang sama akan terakumulasi pada zona atau pita yang sama atau berdekatan.

Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut.

Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.

Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.

Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna "biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah "diwarnai" dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.

Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak setelah proses pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda (marker) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis marka tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk

menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul

Cara kerja metode elktroforesis adalah sebagai berikut:

Ektraksi enzim

Setelah sampel dibersihkan ditempatkan didalam mortal dan diberi pengestrak sebanyak ± 200 (tergantung dari banyaknya, sedikitnya sampel atau besar kecilnya sampel) kemudian smpel digerus hingga halus. Penggerusan dilakukan pada kondisi dingin (± 4 0C) dan dilakukan didalam meja pendingin. Agar suhu tetap konstan. Hasil gerusan tersebut dimasukkan kedalam tabung eppendrof dan kemudian dilakukan sentrifuse dengan kecepatan 2000 rpm selama 20 menit. Supernatan yang didapat dipisahkan dari endapan yang selanjutnya dimasukkan dalam tabung eppendof yang disimpan dalam lemari pendingin (freezer) dalam suhu sekitar 70 0C.

Pembuatan gel

Cara pembuatan gel adalah dengan melarutkan gel bubuk yang khusus digunakan untuk elktroforesis pada erlenmeyer, kemudian di cetak pada cetakan khusus yang telah disediakan dan ditunggu hingga kering. Dalam pembuatan agar, proporsi campuran antara agar dan pelarutnya harus sesuai, karena kalau tidak maka substratnya tidak akan dapat berjalan

Penempatan sampel

Gel dilepaskan dari cetakan gel dengan cara mengiris keliling tepi gel dengan menggunakan pisau. Bagian ujung gel diiris atau dibuat sumuran dengan cetakan khusus kira 2 cm dari salah satu tepi yaitu dari arah katoda yang sebagai penyimpan ekstrak enzim. Ekstar enzim yang akan diuji dikeluarkan dari freezer dan dibiarkan sebentar hingga mencair. Pengambilan ekstrak enzim dilakukan dengan cara mencelupkan kertas saring berukuran 6 x 15 mm ke ekstrak enzim atau dengan pipet mikro. Potongan kertas saring yang telah berisi ekstrak enzim diletakkan dengan posisi tegak lurus ke celah irisan gel. Jarak anatra celah 1-1.5 mm. Sebagai indikator adanya pergerakan maka celah irisan gel tersebut diberikan sedikit biru brom fenol.

4. Proses Elektroforesis

1) Gel yang telah siap kemudian diletakkan secara horizontal diatas kotak elektroforis yang telah berisi larutan penyangga elektroda. Proses ini dilakukan di dalam lemari pendingin dengan suhu 40C.

2) Kedua sisi gel diberi spons yang telah dibasahi dengan larutan penyangga elektroda sebagai jembatan anatar larutan penyangga elektroda dengan gel.

3) Setelah itu gel ditutup dengan plastik dan di atas gel tersebut diberi gel yang dingin.

4) Proses elekrofororsis dijalankan dengan memberi daya listrik pada gel. Pemberian daya listrik disesuaikan dengan sampel yang akan digunakan, misalnya sebesar 50-70 A, 50-60 A atau 45-55 A selama kurang lebih 3 jam.

5) Setelah terlihat bahwa biru brom fenol mencapai titik yang berjarak ± 3 cm dari ujung gel, maka proses elekrofororsis dihentikan. Bagian gel yang tidak terpakai dipotong, sedangkan potongan gel yang menjadi tempat migrasi enzim diiris tipis secara horizontal dengan menggunakan gergaji yang berkawat tipis.

6) Gel diiris menjadi beberapa lembar gel yang kemudian setiap lembar gel yang diletakkan dalam wadah plastik, untuk selanjutnya diwarnai sesuia enzim yang akan dianalisis.

Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.

Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Elektroforesis yang dibahas di bawah ini menggunakan matriks berupa gel poliakrilamida (PAGE = polyacrilamida gel electrophoresis) untuk separasi sampel protein.

Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi keelektroda negatif dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekulmolekul berdasarkan muatannya.

Cara kerja menggunakan metode elktroforesis adalah:

1) Ektraksi enzim,

2) Pembuatan gel,

3) Penempatan sampel,

4) Proses Elektroforesis,

5) Visualisasi sistem enzim dan

6) Metode Analisis.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim.2008. http.d4him.files.wordpress.com.Tanggal akses 13 Agustus 2010

Anonim.2009.http://id.wikipedia.org/wiki/Biologi_molekular. Tanggal akses 13 Agustus 2010

Anonim.2009.http.ioppijepang.org Tanggal akses 13 Agustus 2010

Pratiwi, R. 2001. Mengenal Metode Elektroforesis. Oseana. Volume XXVI. Nomor 1.

Balitbang Biologi Laut, Puslitbang Osenologi LIPI, Jakarta

Sudarmadji, S., 1996. Teknik Analisa Biokimiawi. Edisi Pertama.Liberty.

Yogyakarta.

Sumitro, S. B, Fatchiyah, Rahayu, Widyarti, dan Arumningtyas. 1996. Kursus

Teknik-Teknik Dasar Analisis Protein dan DNA. Jurusan Biologi FMIPA

Universitas Brawijaya. Malang

Zubay, G. L. 1989. Biochemistry 2nd Edition. Mcmillan Publishing Coorporation.

New York

poin2- prinsip dan teori elektroforesis

- Jenis-Jenis Elektroforesis

- Instrumen dari Elektroforesis

- kegunaan/ aplikasi elekroforesis

- kelebihan dan kekurangan dalam elektroforesis

KAKAK TETE, INI ADA DAPUSNYA, HALAMANNYA KAMU BUAT SEMBARANG AJA GPPA, HEHEHHEHE...

ITU ADA POIN2 YANG TAK KASIH, KALO MSALNYA KURANG BISA TAMBAHIN GA???