EKSPLORASI AGENS HAYATI

1. Eksplorasi Jamur Entomopatogen dengan Metode Umpan Serangga (Insect Bait Method)

Eksplorasi adalah suatu kegiatan mencari dan mengumpulkan agens hayati yang ada di

lapangan, diperlukan untuk mendapatkan sumber inokulum. Eksplorasi bertujuan mencari

sumber genetik baru yang berpotensi sebagai agens pengendalian hayati. Eksplorasi dilakukan

pada wilayah luas yang diperkirakan terdapat sumber genetik baru. Serangga yang ditemukan

terserang patogen dikoleksi dan selanjutnya dimanfaatkan untuk tahapan selanjutnya.

Eksplorasi dilakukan dengan dua metode guna mendapatkan spesies agens hayati.

Pertama, menggunakan umpan serangga (insect bait method) seperti dilakukan Hasyim &

Azwana (2003). Serangga umpan yang biasa digunakan ialah larva Tenebrio monilitor Linn.

(ulat Hongkong). Kedua mencari serangga terinfeksi jamur, bakteri, maupun virus dilapang.

Kemudian serangga terinfeksi yang ditemukan diisolasi untuk mendapatkan agens hayati yang

diinginkan.

Jamur entomopatogen dapat diperoleh dari dalam tanah menggunakan metode umpan

serangga. Umumnya serangga yang digunakan sebagai umpan adalah ulat hongkong (Tenebrio

molitor). Infeksi jamur entomopatogen terjadi akibat adanya kontak konidia melalui sistem

pernafasan serangga dan celah di antara segmen tubuh serta bagian ekor serangga.

Konidia memenetrasi kutikula serangga dengan bantuan enzim pengurai, antara lain

kitinase, lipase, amylase, fosfatase, esterase, dan protease serta racun dari golongan destruksin,

beauverisin, dan mikotoksin yang menghambat produksi energi dan protein. Akibat gangguan

dari toksin tersebut, gerakan serangga menjadi lambat, perilaku tidak tenang, kejang-kejang, dan

akhirnya mati. Setelah serangga mati jamur membentuk klamidiospor di dalam tubuh serangga,

selanjutnya tubuh serangga akan ditumbuhi oleh konidia jamur.

Alat: wadah/toples, cawan petri, pinset, kain kasa, timbangan, ayakan 600 mesh, bunsen, objek

glass, cover glass, kamera, alat tulis.

Bahan: sampel tanah, ulat hongkong instar 3, aquades steril, alkohol 70%, NaOCl 1%, media

PDA.

Metode:

1. Trapping

Menyiapkan alat dan bahan

Sampel tanah dibersihkan dari perakaran tanaman dan diayak dengan ayakan 600 mesh

Menimbang sampel tanah sebanyak 300 gr.

Sampel tanah dimasukkan ke dalam wadah

Tanah dilembabkan dengan aquades steril

Sebanyak 10 ekor ulat hongkong instar 3 dimasukkan ke dalam wadah yang berisi tanah

Wadah ditutup dengan potongan kain kasa dan disimpan ditempat gelap

Amati selama 1 minggu

2. Isolasi

Mengambil larva yang terinfeksi oleh jamur entomopatogen

Larva disterilisasi menggunakan NaOCl 1% selama 3 menit

Dibilas dengan aquades steril sebanyak 3 kali, lalu dikeringkan diatas tissue steril

Larva diisolasi pada media PDA

Diinkubasi selama 3 hari

Purifikasi untuk memperoleh biakan murni

3. Identifikasi

Menyiapkan biakan jamur entomopatogen

Mengambil sedikit media dan diletakkan diatas objek glass

Mengambil konidia jamur entomopatogen dan diletakkan diatas media pada objek glass dengan

jarum ose

Menutup dengan cover glass

Masukkan dalam cawan petri yang berisi tissue yang sudah dilembabkan

Inkubasi selama 3 hari

Amati dengan menggunakan mikroskop

2. Isolasi Bakteri dan Jamur dengan Metode Dilution Plate

Dalam mengisolasi mikroba yang terdapat di alam harus digunakan berbagai media

biakan karena tidak satupun media yang dapat menumbuhkan semua mikroba. Penentuan jumlah

mikroba menggambarkan jumlah mikroorganisme yang terdapat dalam sampel dan mampu

tumbuh dalam media dengan suhu inkubasi yang digunakan. Maka dari itu, diperlukan sebuah

metode untuk isolasi (Lay, 1994).

Proses isolasi bakteri bertujuan untuk mendapatkan kultur murni, yaitu kultur yang hanya

terdiri dari satu jenis bakteri maupun jamur. Dari tahap isolasi ini diharapkan akan didapatkan

satu strain patogen serangga. Proses isolasi bakteri patogen serangga menggunakan mekanisme

Dilution Plate, diadopsi dari teknik isolasi yang dilakukan oleh Djauhari dan Sastrahidayat

(2007) yang mengisolasi mikroorganisme lain dengan proses sebagai berikut:

Gambar 2. Isolasi dengan metode pengenceran

Secara sederhana proses ini dilakukan dengan memasukkan tanah dan diencerkan pada

aquades tertentu hingga pengenceran yang diinginkan. Suspensi hasil pengenceran kemuadian

ditanam pada media pertumbuha utuk bakteri dan jamur. Proses pegenceran ini juga dapat

dilakukan pada tanah gambut. Beberapa jamur yang didapatkan dari proses pengenceran ialah

Aspergillus sp., Fusarium sp., Penicilium chysogenum, dan Mucor sp (Saragih, 2008).

Alat

- mikrotube 1,5 ml

- mikropipet

- tip

- timbangan analitik

- laminar air flow cabinet

- bunsen

- alkohol 70%

Bahan

- sampel tanah

- aquades steril

- nutrient agar

- potato dextrose agar (PDA)

Prosedur Pelaksanaan

- menimbang tanah sampel yang akan digunakan sebanyak 1 gram dengan menggunakan

timbangan analitik

- dalam melaksanakan semua kegiatan pengenceran dilakukan pada kondisi aseptis dimana

tangan, alat dan lingkungan harus bebas dan telah disemprot dengan menggunakan

alkohol 70%. Kegiatan dilution plate dilakukan di dalam LAFC

- memasukkan 1 gram tanah ke dalam mikrotube yang berisi aquades steril sebanyak 1000

µl dan dihomogenkan. Setelah itu, digunakan metode dilution plate 10-7dengan

menggunakan mikrotube untuk mendapatkan bakteri patogen serangga dan 10-3 untuk

mendapatkan jamur patogen serangga.

- Kemudian hasil larutan yang telah homogen diambil dengan menggunakan mikropipet

sebanyak 0,1 ml ke dalam tabung reaksi yang berisi aquades steril sebanyak 9 ml dan

seterusnya hingga pada tabung reaksi yang ketujuh untuk bakteri dan ketiga untuk jamur.

- dari larutan pengenceran yang ketujuh, dilakukan penanaman bakteri dengan

memasukkan larutan tersebut sebanyak 1 ml ke dalam media NA (Natrium Agar) dan

pada tabung ketiga diambil 1 ml dan ditanam pada media PDA (Potato Dextrose Agar)

- setelah koloni-koloni petogen serangga tumbuh tumbuh, maka dilakukan purifikasi

menggunakan jarum ose untuk mendapatkan satu spesies atogen serangga. Pada tahap

terakhir dilakukan identifikasi patogen serangga sesuai karakteristik.

Penanaman suspensi dapat dilakukan dengan dua teknik yaitu pour plate dan spread plate.

a) Metode tuang (pour plate)

Pada metode tuang ini media yang digunakan media cair dengan suhu 450 C.

Tahapan yang dilakukan ialah dengan memasukkan suspensi pengenceran sebanyak 0,1

ml terlebih dahulu ke dalam cawan petri dan ditambahkan media cair. Cawan petri

kemudian digoyang membentuk angka delapan.

b) Metode sebar (spread plate)

Metode sebar dilakukan ketika media yang digunakan ialah media yang telah ditung

dalam cawan petri dan mengeras. Suspensi pengenceran sebanyak 0,1 ml dimasukkan ke

dalam cawan petri dan diratakan dengan menggunakan stick L.

Purifikasi Bakteri dan Jamur

Pemurnian (purifikasi) dilakukan pada setiap koloni bakteri dan jamur yang dianggap

berbeda berdasarkan morfologi makroskopis meliputi warna dan bentuk koloni. Purifikasi

dilakukan untuk mendapatkan kultur murni bakteri dan jamur yag diinginkan. Proses purifikasi

ini dicocokkan dengan morfologi makroskopisya. Masing-masing mikroorganisme tersebut

diambil dengan jarum ose, kemudian ditumbuhkan lagi pada cawan petri yang berisi natrium

agar (NA) untuk bakteri dan Potato Dextrose Agar (PDA) untuk jamur. Dari beberapa koloni

jamur yang tumbuh pada cawan petri, jika terdapat koloni yang memiliki ciri makro sama maka

diambil salah satu koloni untuk dipurifikasi.

Pemurnian jamur dilakukan dengan menggambil koloni dengan menggunakan jarum ose

dan diletakkan di tengah pada media baru. Hal ini berguna untuk memisahkan koloni-koloni

jamur dan agar miselium tumbuh dengan baik. Pemurnian bakteri dilakukan dengan

menggunakan ose dan di streak pada media baru. Bakteri akan tumbuh pada 1 x 24 jam

sedangkan jamur kurang lebih 3 hari.

Alat

- ose

- alkohol 70%

- laminar air flow cabinet

- bunsen

Bahan

- media pertumbuhan NA dan PDA

- hasil isolasi

Prosedur Pelaksanaan

- mengambil 1 ose koloni bakteri dan ditanam pada media NA

- mengambil 1 ose koloni jamur dan ditanam pada media PDA