i

EFEKTIVITAS EKSOSOM PLATELET RICH PLASMA PADA

MIGRASI DAN PROLIFERASI KULTUR SEL FIBROBLAS

YANG DITUAKAN

TESIS

Disusun untuk memenuhi sebagian persyaratan mencapai gelar

Dokter Spesialis Kulit dan Kelamin

Oleh

Anggana Rafika Paramitasari

S201502002

PROGRAM STUDI ILMU KESEHATAN KULIT DAN KELAMIN PROGRAM

PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS I

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS SEBELAS MARET SURAKARTA

2019

ii

LEMBAR PENGESAHAN

EFEKTIVITAS EKSOSOM PLATELET RICH PLASMA PADA MIGRASI

DAN PROLIFERASI KULTUR SEL FIBROBLAS

YANG DITUAKAN

PROPOSAL TESIS

Oleh

Anggana Rafika Paramitasari

S201502002

Jabatan Nama Tanda

Tangan

Tanggal

Pembimbing

I

Prof. DR. dr. Harijono Kariosentono, Sp. KK (K)

NIK: 1946120720171001

....................

Pembimbing

II

Dr. Endra Yustin ES, M.Sc, Sp. KK (K)

NIK: 197509262010012007

....................

Surakarta, April 2019

Mengetahui

Ketua Program Studi Ilmu Kesehatan Kulit dan Kelamin

Dr. Endra Yustin ES, M.Sc, Sp. KK (K)

NIK: 197509262010012007

iii

PERNYATAAN KEASLIAN DAN PERSYARATAN PUBLIKASI

Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa:

1. Tesis yang berjudul: “EFEKTIVITAS EKSOSOM PLATELET RICH PLASMA

PADA MIGRASI DAN PROLIFERASI KULTUR SEL FIBROBLAS YANG

DITUAKAN” ini adalah karya penelitian saya sendiri dan tidak terdapat karya

ilmiah yang pernah diajukan oleh orang lain untuk memperoleh gelar akademik

serta tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh

orang lain, kecuali yang tertulis dengan acuan yang disebutkan sumbernya, baik

dalam naskah karangan dan daftar pustaka. Apabila ternyata di dalam naskah tesis

ini dapat dibuktikan terdapat unsur-unsur plagiasi, maka saya bersedia menerima

sangsi, baik Tesis beserta gelar spesialis saya dibatalkan serta diproses sesuai

dengan peraturan perundang-undangan yang berlaku.

2. Publikasi sebagian atau keseluruhan isi Tesis pada jurnal atau forum ilmiah harus

menyertakan tim promotor sebagai author dan PPs UNS sebagai institusinya.

Apabila saya melakukan pelanggaran dari ketentuan publikasi ini, maka saya

bersedia mendapatkan sanksi akademik yang berlaku.

Surakarta, Juli 2018

Anggana Rafika Paramitasai

S201502002

iv

KATA PENGANTAR

Puji syukur kami panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-

Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis dengan judul “EFEKTIVITAS

EKSOSOM PLATELET RICH PLASMA PADA MIGRASI DAN PROLIFERASI

KULTUR SEL FIBROBLAS YANG DITUAKAN”. Laporan penelitian ini dibuat

sebagai tugas akhir dalam menempuh Program Pendidikan Dokter Spesialis Kulit dan

Kelamin Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta. Penulis berharap

laporan ini dapat memberi kontribusi yang bermanfaat bagi program studi Ilmu

Kesehatan Kulit dan Kelamin. Atas bantuan bimbingan dari berbagai pihak, peneliti ingin

menyampaikan rasa terima kasih kepada:

1. Prof. Dr. dr. Ravik Karsidi, MS selaku Rektor Universitas Sebelas Maret

Surakarta.

2. Prof. Dr. dr. Hartono M.Si selaku Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas

Maret Surakarta.

3. Prof. Dr. dr. Harijono Kariosentono, Sp.KK(K) selaku pembimbing 1 yang telah

meluangkan waktu, memberikan bimbingan, saran dan masukan dalam

penyelesaian tesis.

4. dr. Endra Yustin ES, M.Sc, Sp.KK selaku ketua program studi Ilmu Kesehatan

Kulit dan Kelamin Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta dan

pembimbing 2 yang telah meluangkan waktu untuk membantu, membimbing dan

memberikan dukungan dan masukan dalam penyelesaian tesis.

5. dr. Nugrohoaji Dharmawan, M.Kes, Sp.KK selaku Kepala Bagian Ilmu Kesehatan

Kulit dan Kelamin Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta.

6. Dr. dr. Moerbono Mochtar Sp.KK(K) selaku penguji II yang telah meluangkan

waktu, memberikan bimbingan, saran dan masukan dalam penyelesaian tesis.

7. Dr. dr. Indah Julianto Sp.KK(K) sebagai penguji I yang telah meluangkan waktu,

memberikan bimbingan, saran dan masukan dalam penyelesaian tesis.

8. dr. Arief T.Q, MS yang telah memberikan arahan dan bimbingan tentang tata cara

penulisan dan metodologi penelitian sehingga tesis ini dapat diselesaikan.

9. Seluruh staf pengajar bagian kulit dan kelamin RSUD Dr. Meowardi Surakarta:

Prof. Dr. dr. Harijono Kariosentono, Sp.KK (K), Dr. dr. Indah Julianto,

v

Sp.KK(K), Dr. dr. Moerbono Mochtar, Sp.KK(K), Dr. dr. Prasetyadi Mawardi,

Sp.KK(K), dr. Muh. Eko Irawanto, Sp.KK, dr. Nugrohoaji Dharmawan, M.Kes,

Sp.KK, dr. Arie Kusumawardani, Sp.KK, dr. Endra Yustin Ellista Sari, M.Sc,

Sp.KK, dr. Nurrachmat Mulianto, M.Sc, Sp.KK, dr. Suci Widhiati, M.Sc, Sp.KK,

dr.Triasari Oktavriana, M.Sc, Sp.KK, dan dr.Ammarilis Murastami, M.Sc,

Sp.KK, yang telah memberikan dukungan, masukan dan saran kepada penulis.

10. Rekan-rekan Program Pendidikan Dokter Spesialis I, Ilmu Kesehatan Kulit dan

Kelamin Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret atas segala motivasi,

semangat dan doa serta kebersamaannya selama menempuh pendidikan kepada

penulis.

11. Susanti Rosmala Dewi, Ance Imelda Betaubun, Dendy Zulfikar dan Ferry

Arrochman sebagai teman seangkatan yang sama-sama berjuang, mendukung satu

sama lain, saling mengingatkan dan memberi nasehat serta selalu berusaha

menjadi pribadi yang lebih baik selama pendidikan ini.

12. Seluruh staf perawat Poliklinik Bagian Ilmu Kesehatan Kulit dan Kelamin RSUD

Dr. Moewardi Surakarta atas pengertian, bantuan dan kerjasamanya selama proses

penelitia berjalan serta motivasi dan dukungan yang diberikan kepada penulis.

13. Seluruh supporting staf administrasi Bagian Ilmu Kesehatan Kulit dan Kelamin

atas bantuan dan kerjasamanya kepada penulis.

14. Yenie Astuti, Iwan, Khaula, Ryan serta seluruh staf UPT - Laboratorium

Dermama Surakarta atas masukan, pengetahuan dan bantuannya dalam

pelaksanaan penelitian tesis ini.

15. Ibu, bapak, ibu dan bapak mertua, eyang, adik-adik serta seluruh keluarga besar

yang selalu memberikan doa, semangat dan dukungan baik moral maupun

material serta kasih sayang yang luar biasa kepada penulis.

16. Suami tercinta Arif Khozin Setiawan atas segala kesabaran, kasih sayang, restu,

doa, dukungan moral dan material dalam perjalanan pendidikan yang berliku ini.

17. Duo abellic - Annabelle Ghaniyya Lafatunnisa dan Alaric Zafran Nareswara - atas

semua doa, keceriaan, kesabaran, pengertian dan kasih sayangnya selama bunda

menjalani pendidikan.

18. Semua pihak terkait yang tidak bisa penulis sebutkan satu persatu, yang telah

memberikan bantuan dan masukan kepada penulis.

vi

Penulis menyadari laporan ini masih banyak kekurangan, oleh karena itu penulis

mengharapkan kritik, saran dan masukan yang membangun dari seluruh pihak. Selain itu

penulis menyadari bahwa dalam proses perjalanan menempuh pendidikan spesialis ini

banyak kesalahan baik dalam tutur kata, perilaku, sikap, dan perbuatan. Oleh karena itu

dengan segala kerendahan hati penulis memohon maaf yang sebesar-besarnya kepada

semua pihak.

Surakarta, 2019

Anggana Rafika Paramitasari

vii

ABSTRAK

Latar Belakang

Senescence atau penuaan pada sel secara in vitro merupakan kondisi penghentian pertumbuhan sel yang

terlihat saat proses kultur sel yang terus menerus. Masa replikasi sel yang terbatas pada kultur dapat

dipengaruhi oleh faktor genetik dan lingkungan serta sering dipakai sebagai model penuaan pada manusia

atau penyembuhan luka yang kronis. Platelet Rich Plasma (PRP) merupakan konsentrasi platelet yang

tinggi minimal 1,000,000/L dalam 5 ml volume plasma darah. Eksosom adalah mikro vesikel dengan

membran lipid berdiameter 30-100 nm yang merupakan produk metabolik sel serta berperan penting dalam

komunikasi antar sel. Eksosom yang didapatkan dari PRP memiliki ekspresi protein dan faktor

pertumbuhan seperti bFGF, PDGF-BB, VEGF, dan TFG-β yang lebih tinggi dibandingkan dengan PRP

serta micro Ribo Nucleic Acid (miRNA) yang diharapkan akan berguna untuk memperbaiki migrasi dan

proliferasi kultur sel fibroblas yang dituakan.

Tujuan

Untuk mengetahui efektivitas eksosom PRP pada migrasi dan proliferasi kultur sel fibroblas yang dituakan

Metode Penelitian

Desain penelitian ini adalah penelitian eksperimental laboratoris post test only control group design dengan

membandingkan migrasi dan proliferasi fibroblas yang dituakan dan diberi penambahan eksosom PRP 1%

dibandingkan dengan PRP 1% dan kontrol negatif dengan DMEM + FBS 1%. Uji migrasi dilakukan

menggunakan scratch assay lalu diukur menggunakan software image J, sedangkan proliferasi dihitung

menggunakan teknik Dye exclusion test dengan pengecatan Trypan blue lalu dihitung dengan

hemositometer. Pengamatan dilakukan selama 48 jam dengan inverted microscope Nikon dan hardware

Nikon DS-U3 digital sight camera control unit with software NIS-element F-package

Hasil

Analisis data migrasi dan proliferasi dilakukan menggunakan SPSS 22 menggunakan uji One way annova

untuk data dengan distribusi normal, serta uji Kruskal wallis untuk data dengan distribusi tidak normal.

Perbedaan yang signifikan terlihat pada laju migrasi seluruh kelompok eksosom PRP dan PRP saat

dibandingkan dengan kelompok kontrol di semua waktu (p<0.05), namun tidak ada perbedaan signifikan

antara kelompok eksosom PRP dan PRP pada jam ke 6,12 dan 24 (V6, V12 dan V24) (p>0.05), sedangkan

pada jam ke-48 (V48) terdapat perbedaan yang bermakna (p=0.001). Proliferasi pada jam ke 24 (T24) dan

48 (T48) pada seluruh kelompok eksosom PRP dan PRP bermakna secara signifikan dibandingkan dengan

kontrol (p<0.05), namun antara kelompok PRP dan PRP tidak bermakna secara signifikan pada jam ke-24

(p=0.05). Proliferasi antara kelompok eksosom PRP dan PRP bermakna secara signifikan pada jam ke 48

(p=0.000).

Kesimpulan

Seluruh kelompok perlakuan baik eksosom PRP 1% maupun PRP 1% lebih efektif secara signifikan

dibandingkan kelompok kontrol terhadap migrasi dan proliferasi kultur sel fibroblas yang dituakan.

Eksosom PRP 1% efektif secara signifikan terhadap migrasi dan proliferasi kultur sel fibroblas yang

dituakan dibandingkan dengan kelompok PRP 1% dan kontrol pada jam ke 48.

Kata kunci: eksosom, fibroblas, migrasi, proliferasi, PRP

viii

ABSTRACT

Background

Senescence is a condition of cells whereby they divide for a limited number of times before they cease to

proliferate and acquire a state of long-term arrest. Cellular senescence in cultured primary cells is triggered

by a variety of factors and being studied for many years to be a model for aging or chronic wound healing.

Platelet Rich Plasma (PRP) has a working definition for concentration of 1,000,000 platelets/µl in a 5-ml

volume of plasma. Exosomes are a membrane-bound micro vesicles of 30–100 nm in diameter which are

present in almost all biological fluids and has an important role in interceluller communication. The

exosomes derived from PRP (PRP-exos) have been proven to show higher expression and encapsulate

principal growth factors from platelets such as bFGF, PDGF-BB, VEGF, and TFG-β than PRP does. PRP-

exos also have some micro Ribonucleic Acid (miRNA).

Objectives

To know efficacy of PRP-exos in migration and proliferation of serum starved fibroblast culture

Methods

We divided the serum starved fibroblast into three group which are PRP-exos 1%, PRP 1% and control

(DMEM+FBS1%). We compare migration rate for each group using scratch assay test and measuring it

with image J while proliferation using dye exclusion test and counted with hemocytometer. Observation

was done in 48 hours using inverted microscope Nikon and hardware Nikon DS-U3 digital sight camera

control unit woth software NIS-element F-package.

Results

We use SPSS 22 software to analyze migration and proliferation of fibroblast with One way annova for

parametric test and Kruskal wallis for non parametric test. Significance difference of migration rate were

seen in all of PRP exos and PRP group when compared with control group (p<0.05), but there were no

significancy between exos PRP and PRP in 6, 12 and 24 hours (V6, V12 and V24) ) (p>0.05), while in 48

hours (V48) there is significancy (p=0.001). Proliferation of fibroblast in 24 hours (T24) and 48 hours

(T48) between all PRP exos and PRP group was significance when compared to control group (p<0.05),

but there is no significancy between PRP exos and PRP group in T24 (p=0.05). Proliferation of fibroblast

between PRP exos and PRP were seen in T48 (p=0.000).

Conclusion

Both PRP exos 1% and PRP 1% group were significantly effective compared with control group in

migration and proliferation of serum starved fibroblast culture.

PRP exos 1% were significantly effective for migration and proliferation of serum starved fibroblast culture

compared with PRP 1% and control group in T48.

Kata kunci: eksosom, fibroblas, migrasi, proliferasi, PRP

ix

DAFTAR ISI

Halaman

Judul.......................................................................................................................... i

Lembaran Pengesahan............................................................................................... ii

Pernyataan Keaslian dan Persyaratan Publikasi…………………………………… iii

Kata pengantar ......................................................................................................... iv

Abstrak .................................................................................................................... vii

Daftar Isi....................................................................................................................ix

Daftar singkatan........................................................................................................ xii

Daftar tabel............................................................................................................... xiii

Daftar gambar........................................................................................................... xiv

BAB I

Pendahuluan............................................................................................................... 1

A. Latar Belakang.............................................................................................. 1

B. Rumusan Masalah.......................................................................................... 4

C. Tujuan Penelitian........................................................................................... 4

D. Manfaat Penelitian......................................................................................... 4

E. Keaslian Penelitian........................................................................................ 5

BAB II

Tinjauan Pustaka...................................................................................................... 6

A. Platelet Rich Plasma..................................................................................... 7

B. Eksosom, eksosom PRP dan miRNA........................................................... 9

1. Eksosom.................................................................................................... 9

2. Peran miRNA dalam eksosom PRP..........................................................16

C. Fibroblas yang dituakan dan penyembuhan luka kronis.............................. 22

D. Kerangka Konsep......................................................................................... 28

E. Hipotesis…………………………………………………………………... 29

BAB III

Metode Penelitian...................................................................................................... 30

A. Desain Penelitian .......................................................................................... 30

B. Tempat dan Waktu Penelitian ....................................................................... 30

x

C. Sampel penelitian ......................................................................................... 30

D. Kriteria Inklusi dan Eksklusi ....................................................................... 30

E. Variabel Penelitian ....................................................................................... 31

F. Definisi operasional ...................................................................................... 31

G. Bahan dan Instrumen Penelitian ................................................................... 32

H. Prosedur Penelitian ....................................................................................... 33

I. Kelaikan etik Penelitian……………………………………………………. 39

J. Alur Penelitian……………………………………………………………... 40

BAB IV

Hasil dan pembahasan ..............................................................................................

A. Hasil .................. .......................................................................................... 42

A.1 Migrasi .........

A.2 Proliferasi ..................

B. Pembahasan ....................................................................... 30

BAB V

Kesimpulan

Daftar Pustaka............................................................................................................ 41

xi

DAFTAR SINGKATAN

AGO : Agonaute

AP-1 : Activator Protein

CD : Cluster of Differentiation

CDK : Cyclin Dependent Kinase

DGCR8 : Di George Syndrome Critical Region Gene 8

DDR : DNA Damage Response

DMEM : Dulbecco’s modified Eagle’s medium

DNA : Deoxyribo Nucleaic Acid

ECM : Extracelluler Matrix

ECGF : Endothelial Cell Growth Factor

EGF : Epithelial Growth Factor

Erk : Extracellular Receptor Kinase

FBS : Fetal Bovine Serum

FGF : Fibroblast Growth Factor

HUVEC : Human Umbilical Vein Endothelial Cells

IGF-I : Insulin-Like Growth Factor

IGFR-I : Insulin-Like Growth Factor Receptor 1

IKK : I-Κb Kinase;

IRAK : IL-1 Receptor-Associated Protein Kinase

MAPK : Mitogen Activated Protein Kinases

MMP : Matrix Metallo Proteinase

MiRISC : miRNA-induced Silencing Complex

MiRNA : Micro Ribo Nucleic Acid

MV : Microvesicles

Myd88 : Myeloid Differentiation Primary-Response Protein 88

NF-κB : Nuclear Factor Κb

PAMP : Pathogen Associated Molecular Patterns

PBS : Phosphat Buffer Saline

PDGF : platelet-derived growth factor

PPP : Platelet Poor Plasma

PRGF : Platelet Rich Growth Factor

PRP : Platelet Rich Plasma

RNA : Ribo Nucleic Acid

xii

TGF : Transforming Growth Factor

TGF-B : Transforming Growth Factor

TIMP : Tissue Inhibitor Matrix Proteinase

TLR : Toll Like Receptor

TRAF : TNF R-Associated Factor

VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor

xiii

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Keaslian penelitian …………………………………………………………… 5

Tabel 2. Hasil uji normalitas berdasarkan kecepatan migrasi …………………………. 44

Tabel 3. Perbedaan laju migrasi pada jam ke 6, 12, 24 dan 48 ……………………….. 45

Tabel 4. Perbandingan laju migrasi antara 2 kelompok pada jam ke 6,12, 24 dan 48…. 45

Tabel 5. Hasil uji normalitas berdasarkan proliferasi kultur sel fibroblas ……………. 46

Tabel 6. Perbedaan proliferasi pada jam ke 12, 24 dan 48 ……………………………. 47

Tabel 7. Perbedaan proliferasi antar kelompok eksosom PRP, PRP dan kontrol pada jam

48 ……………………………………………………………………………………… 48

xiv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Pelepasan eksosom ……………………………………………… 11

Gambar 2. Produksi VE …………………………………………………….. 12

Gambar 3. Representasi skematik mekanisme kerja VE …………………… 14

Gambar 4. Perbaikan jaringan ……………………………………………… 15

Gambar 5. Skema pertukaran informasi genetik yang dimediasi VE ……… 15

Gambar 6. Klasifikasi RNA ………………………………………………... 17

Gambar 7. Proses biogenesis miRNA ………………………………………. 18

Gambar 8. Skema media kultur fibroblas …………………………………... 36

Gambar 9. Metode perhitungan dengan hemositometer ……………………. 39