54

DETEKSI KEBERADAAN ANTIGEN Ascaridia galli DENGAN

IMUNOGLOBULIN YOLK MELALUI METODE IMUNOHISTOKIMIA

ABSTRAK

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui keberadaan antigen

ekskretori/sekretori Ascaridia galli dengan metode imunohistokimia. Cacing A.

galli dewasa dipotong secara melintang dan memanjang pada bagian kepala dan

ekor. Jaringan tubuh A. galli yang dipotong diblok di dalam parafin dan preparat

histologi dibuat melalui proses tahapan dehidrasi, clearing, infiltrasi dan

embeding dengan parafin, pemotongan dan pewarnaan. Keberadaan antigen pada

jaringan cacing A. galli dideteksi dengan uji imunohistokimia. Slide dihangatkan

di dalam buffer sitrat pada temperatur 90-95oC. Aktivitas endogen dihambat

dengan H2O2 3% dan skim milk 0,1%. Slide diinkubasikan dengan antibodi

primer imunoglobulin yolk (IgY) selama satu malam pada temperatur 4oC, dan

antibodi sekunder anti-chicken IgY HRP-conjugat selama satu jam pada

temperatur ruangan. Slide diwarnai dengan kromogen AEC, conterstain dengan

Lillie Mayer Haematoxylin, dan ditutup di dalam genangan gliserin. Hasil

penelitian menunjukkan bahwa antigen dapat dideteksi keberadaannya pada

bagian kutikula dan saluran cerna A. galli. Hasil tersebut merefleksikan bahwa

IgY yang terbentuk oleh rangsangan produk ekskretori/sekretori stadium L3 A.

galli dapat mengenal antigen A. galli sehingga IgY tersebut dapat digunakan

dalam imunodiagnostik.

Kata kunci: Ascaridia galli, antigen ekskretori/sekretori, imunohistokimia

ABSTRACT

The purpose of the present study was to determine the presence of antigen

in the Ascaridia galli. A. galli adult worms were cut in transversal and

longitudinal by mean of cranial and caudal. The tissue of A. galli were blocked in

paraffin and the histologic preparates were done by means of dehydration,

clearing, infiltration and embedding in paraffin, section and staining. The antigen

were detected with immunohistochemistry. Slides were warmed in citrate buffer at

90-95oC. Endogenous activities were blocked with 3% H2O2 and 0.1% skim milk.

Slides were incubated with both primary antibody yolk immunoglobulin (IgY) for

overnight at 4oC and secondary antibody rabbit anti-chicken IgY HRP-conjugate

for one hour at room temperature. Slides were stained with AEC chromogen,

counterstained with Lillie Mayer Haematoxylin, and mounted in glyserin aqueous

mount. The result showed that antigen were able detected in cuticle and intestines

of A. galli. This research concluded that IgY stimulated by the excretory/

secretory antigen of L3 stage was able to recognized A. galli antigen so the IgY

could be applied for immunodiagnostic.

Key words: Ascaridia galli, excretory/secretory antigen, immunohistochemistry

55

PENDAHULUAN

Metode deteksi antigen-antibodi telah banyak dikembangkan seiring

dengan penemuan teknologi mutakhir dalam bidang biologi molekuler bersamaan

dengan penemuan terbaru metode produksi antibodi spesifik terhadap antigen di

dalam serum dan kuning telur (yolk). Kemajuan tersebut memberi kesempatan

untuk membuat cara imunodiagnostik yang aman dan akurat (Motoi et al. 2005).

Lehr et al. (1999) menyatakan bahwa kombinasi dari konsep-konsep

imunologis dan histologis merupakan suatu jalan yang terbukti sangat berguna

dalam biologi molekuler dan biomedis, terutama dalam analisis imunoserologis

pada organ-organ dalam keadaan normal maupun patologik. Untuk tujuan tersebut

telah digambarkan pendekatan kuantitatif sejak abad terakhir ini, misalnya oleh

Ehrlich dan Landsteiner sebagai pelopor-pelopor dalam pengembangan teknik ini.

Prinsip dari teknik imunohistokimia adalah adanya ikatan antigen-antibodi

yang digunakan untuk mendeteksi suatu molekul dalam jaringan. Pada penelitian

ini, metode imunohistokimia ditujukan untuk mendeteksi antigen cacing A. galli

dengan menggunakan IgY yang dipicu oleh antigen ekskretori/sekretori stadium

L3 A. galli sebagai antibodi primer sehingga terbentuk kompleks antigen-antibodi.

Motoi et al. (2005) membuktikan bahwa IgY yang dipicu oleh antigen virus rabies

dapat digunakan pada uji imunohistokimia yang sangat rektif mengenal antigen

rabies pada sitoplasma sel-sel neuron (sel syaraf) dari ganglion trigeminal

jaringan otak tikus.

Imunohistokimia diartikan sebagai suatu metode untuk mendeteksi suatu

molekul yang ada di jaringan dengan menggunakan antibodi poliklonal atau

monoklonal terhadap molekul yang akan dideteksi (merupakan reaksi antigen-

antibodi) dan dapat memberikan gambaran kualitatif dari intensitas warna yang

terbentuk maupun gambaran kuantitatif. Teknik imunohistokimia dapat digunakan

untuk mempelajari distribusi enzim yang spesifik pada struktur sel intak

(normal/lengkap), mendeteksikan komponen sel, biomakromolekul seperti

protein, karbohidrat (Lehr et al. 1999; Ding dan Candido 2000; Nagano et al.

2004; Yarim et al. 2004; Rostaing et al. 2004; dan Motoi et al. 2005).

56

Kemajuan teknologi yang telah dicapai untuk produksi imunoglobulin yolk

(IgY) yang mudah dan efisien membuka peluang pemanfaatan IgY dalam

berbagai uji imunodiagnostik dan pencegahan penyakit infeksi. IgY telah

dimanfaatkan untuk mencegah diare dan karies pada gigi (Soejoedono et al.

2005), dan untuk mencegah rabies (Motoi et al. 2006; dan Paryati 2006). IgY

dapat dimanfaatkan untuk imunodiagnostik melalui uji imunohistokimia (Motoi et

al. 2005) dan uji ELISA (Paryati 2006). Tujuan penelitian ini adalah untuk

mengetahui keberadaan antigen A. galli dengan menggunakan IgY terhadap

ekskretori/sekretori A. galli melalui uji imunohistokimia.

BAHAN DAN METODE

Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Patologi, Departemen Klinik,

Patologi dan Reproduksi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.

Waktu Penelitian berlangsung 2 bulan dari bulan Juni sampai dengan Juli 2007.

Rancangan Penelitian

Cacing A. galli dewasa dipotong secara transfersal dan longitudinal setebal

3 – 5 µm. Preparat objek ditetesi antibodi primer terhadap ekskretori/sekretori A.

galli, antibodi sekunder (IgY conjugate HRP, rabbit anti-chicken). Preparat objek

ditetesi dengan peroksidase, dan kromogen 3-amino-9-ethyl-carbazole (AEC).

Counterstain dilakukan dengan meneteskan Lillie Mayer Hematoksilin secara

merata dan dicuci dengan dionized water. Preparat objek ditutup dengan cover

glass yang digenangi dengan gliserin. Visualisasi endapan berwarna

(kromogranin) yang terbentuk diamati di bawah mikroskop yang menunjukkan

adanya kompleks antigen-antibodi (Lehr et al. 1999).

Uji Imunohistokimia

Preparat histologi jaringan tubuh cacing A. galli dibuat melalui proses

tahapan dehidrasi, clearing, infiltrasi dan embeding dengan parafin, pemotongan

dan pewarnaan. Jaringan diblok di dalam parafin dan disimpan di dalam lemari es

57

agar parafin menjadi lebih keras sehingga memudahkan pemotongan. Cacing A.

galli dipotong secara transfersal dan longitudinal setebal 3 – 5 µm dengan

mikrotom. Sayatan jaringan diapungkan diatas air hangat pada temperatur 60oC

dan dilekatkan pada gelas objek. Parafin dihilangkan dengan xylol (III, II, dan I)

masing-masing selama 3 menit. Rehidrasi dilakukan dengan cara merendam

preparat objek secara bergantian dalam alkohol konsentrasi 95%, 90%, 80%, dan

70% masing-masing selama 3 menit. Preparat objek dicuci (clearing) dengan

diionized water selama 15 menit. Peroksidase endogen dihilangkan dengan H2O2

3% selama 20 menit dan skim milk 0,1% selama 30 menit, dibilas dengan

diionized water dan PBS masing-masing 3 kali 5 menit (Yarim et al. 2004).

Slide (preparat objek) ditetesi antibodi primer IgY terhadap

ekskretori/sekretori A. galli secara merata. Antibodi primer yang digunakan pada

penelitian ini diperoleh dari hasil purifikasi IgY dengan metode fast performans

liquid chromatografi (FPLC) di dalam kuning telur (yolk) dari ayam yang

diimunisasi dengan antigen ekskretori/sekretori stadium L3 A. galli. Preparat

objek dimasukkan ke dalam kotak preparat (humidity chamber) diberi kertas

tissue yang ditetesi dengan PBS untuk menjaga kelembaban, dimasukkan ke

dalam lemari es pada temperatur 4oC selama satu malam, dan dicuci 3 kali 5 menit

dengan PBS. Preparat objek ditetesi antibodi sekunder (IgY conjugate HRP rabbit

anti-chicken, Promega), diinkubasi pada temperatur ruangan selama satu jam, dan

dicuci 3 kali 5 menit dengan PBS. Preparat objek ditetesi dengan peroksidase,

diinkubasi pada temperatur ruangan selama 30 menit, dan dicuci 3 kali 5 menit

dengan PBS (Ding dan Candido 2000; Inoue et al. 2003; Rostaing et al. 2004; dan

Motoi et al. 2005).

Preparat objek ditetesi kromogen AEC, diinkubasi pada temperatur

ruangan selama 3 menit, dan dicuci 3 kali 5 menit dengan PBS. Counterstain

dilakukan dengan meneteskan Lillie Mayer Hematoksilin secara merata selama

satu menit dan dicuci dengan dionized water. Preparat objek ditutup dengan cover

glass yang direkatkan dengan gliserin. Imunoreaktivitas positif dievaluasi di

bawah mikroskop dengan lensa objektif 40 kali. Visualisasi endapan berwarna

(kromogranin) yang terbentuk menunjukkan adanya kompleks antigen-antibodi

(Lehr et al. 1999).

58

HASIL PENELITIAN

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa antibodi poliklonal IgY yang

terbentuk oleh rangsangan antigen ekskretori/sekretori stadium L3 A. galli dapat

mengenal keberadaan antigen cacing A. galli. Kompleks antigen-antibodi

ditunjukkan oleh reaksi positif yang ditandai munculnya warna jingga kontras

pada potongan melintang dan memanjang pada bagian kutikula dan saluran cerna

A. galli (Gambar 12).

Gambar 12. Reaksi positif uji imunohistokimia terhadap antigen A. galli

Keterangan: A = potongan melintang (20x), B = potongan memanjang (10x).

Panah tebal = kutikula, Panah tipis = saluran cerna

B

A

20 µm

20 µm

59

PEMBAHASAN

Teknik polymer peroxidase merupakan teknik yang banyak digunakan.

Teknik ini menggunakan dua antibodi, yaitu antibodi primer dan antibodi

sekunder yang telah dikonjugasikan dengan peroksidase. Reaksi yang ditimbulkan

dapat diamati dengan mikroskop cahaya yang dapat memberikan gambaran

kualitatif dari intensitas produk warna yang terbentuk (Lehr et al. 1999).

Pembentukan kompleks reaksi antigen-antibodi tersebut berlangsung seperti yang

ditunjukkan pada Gambar 13.

Gambar 13. Kompleks antigen-antibodi pada teknik polimer peroksidase

Untuk mendeteksi peroksidase, ditambahkan suatu kromogen yang dapat

menghasilkan endapan berwarna (kromogranin) pada suatu reaksi sehingga

produk dapat tervisualisasi. Tujuan umum teknik imunohistokimia adalah untuk

mengidentifikasi dan mengkarakterisasi komponen struktur dan fungsi sel, oleh

karena itu kompleks antigen-antibodi yang terjadi harus dilabel dengan suatu cara

khusus agar dapat tervisualisasi. Substansi yang cocok untuk melabel kompleks

tersebut adalah yang memberikan reaksi warna yang tegas. Kromogen yang

digunakan pada reaksi yang berperoksidase adalah AEC sehingga reaksi

berlangsung seperti yang terlihat pada Gambar 14.

Peroksidase

H2O2 Endapan merah jambu

(kromogranin)

AEC

Gambar 14. Reaksi pembentukan produk berwarna

P

60

Penambahan AEC tidak akan menghasilkan kromogranin tanpa adanya

H2O2 dan peroksidase. Antibodi primer akan bereaksi/berikatan dengan antigen

(molekul) jaringan yang dideteksi, selanjutnya antibodi yang dilabel dengan

peroksidase akan bereaksi dengan antibodi primer tersebut. Sehingga keberadaan

enzim peroksidase ini melambangkan adanya kompleks antigen-antibodi. Pada

penelitian ini, kompleks antigen-antibodi yang terbentuk pada kutikula dan

sepanjang saluran cerna cacing A. galli menghasilkan warna jingga kontras

(Gambar 12). Lehr et al. (1999) melaporkan bahwa uji imunohistokimia terhadap

karsinoma sel-sel tumor epitel pada itik membentuk dua warna yang kontras.

Warna turquoise (biru hijau) adalah representasi positif sitokeratin sel-sel tumor

sedangkan warna pink (merah jambu) adalah representasi positif vimentin stroma.

Teknik imunohistokimia adalah salah satu metode imunokimiawi yang

sudah dikembangkan pada imunodiagnostik penyakit parasitik. Yarim et al.

(2004) menyatakan bahwa uji imunohistokimia dapat mendeteksi keberadaan

enzim 3β-hydroxysteroid-dehidrogenase (3β-HSD) pada bradyzoit yang menutupi

sarcocysts di dalam otot skelet domba sebagai inang intermediet Sarcocystis spp.

Nagano et al. (2004) membuktikan bahwa antibodi primer dapat mengenal antigen

cacing Clonorchis sinensis yang berlokasi pada sel-sel epitel intestinal cacing

dewasa dan pada telur intrauterin.

KESIMPULAN

Dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa IgY yang terbentuk oleh

rangsangan antigen ekskretori/sekretori larva L3 A. galli dapat mengenal antigen

yang berada pada kutikula dan saluran cerna A. galli.

SARAN

Dari hasil penelitian ini dapat disarankan bahwa untuk mengetahui

kemungkinan antigen ekskretori/sekretori stadium L3 dan atau IgY dapat

mengurangi kelangsungan hidup A. galli perlu dilakukan penelitian secara in vivo

dan in vitro.