29

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1. Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium …... Pemeliharaan dan perlakuan

terhadap hewan coba dilakukan di …. Departemen Biologi, Fakultas …,

universitas ….. Pembuatan ekstrak manggis dilakukan di …..Fakultas …..,

Universitas…... Penelitian dilakukan selama 6 bulan (Agustus 2007 - Januari

2008)

3.2. Bahan dan Alat Penelitian

3.2.1. Hewan coba.

Penelitian ini menggunakan hewan coba yaitu mencit (Mus musculus L.)

jantan dewasa yang berumur 8 – 10 minggu, strain BALB/C dan rentang berat

badan 25-35 g sebanyak 48 ekor, yang diperoleh dari …….

3.2.2. Bahan penelitian.

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah akar ginseng jawa

(Talinum paniculatum Gaertn.) yang diperoleh dari Bantul, Yogyakarta, metanol

sebagai pelarut ekstrak, estrogen sintetik dengan merek dagang Lynoral produksi

P.T. Organon Indonesia yang mengandung ethinyloestradiol (EE2) 0,05 mg per

tablet, bahan fiksasi neutral buffered formaline, akuades, Na2HPO4 dan Na2H2PO4

H2O, etanol 70%, etanol 80%, etanol 96%, etanol absolut, xylol, parafin, alkohol

asam, pewarna ganda Harris’s Hematoxylin-Eosin, entellan (perekat transparan),

30

poly-L-lysin, akuades, xylasin dengan dosis 0,1 ml/20g BB, carboxy methyl

cellulose (CMC) 0,5 %, standar β-sitosterol yang digunakan dari hasil fraksinasi

kedelai produksi Fluka dengan tingkat kemurnian 97%.

3.2.3. Alat penelitian.

Alat-alat yang digunakan selama penelitian ini adalah kandang pemeliharaan

berupa bak plastik putih berukuran 30 x 18 x 12 cm, penutup kawat kasa, botol

minum, timbangan elektrik digital OHAUS Adventurer dengan ketelitian hingga

dua angka dibelakang koma, timbangan elektrik digital OHAUS, disposable

syringe 1 ml yang ditumpulkan ujungnya, botol-botol, mortar dan penggerus,

spatula, gelas ukur, pipet tetes, gelas erlenmeyer 1000 ml, magnetic-stirrer,

aluminium foil, erlenmeyer, shaker, rotary vacuum evaporator, seperangkat alat

bedah, stoples, kapas, botol film, kertas saring, dan silet, kaset, beaker glass, kain

kassa, karet gelang, paraffin bath, wadah blok parafin, rotary microtome, kuas,

pipet tetes, cover dan object glass, holder, cutter, bunsen, oven, label, mikroskop

cahaya, mikrometer okuler dan hand counter.

3.3. Rancangan Penelitian

Penelitian eksperimental ini menggunakan rancangan acak lengkap pola

faktorial 4 x 3 (Nazir, 1988).

3.4. Variabel Penelitian

Variabel penelitian ini adalah:

31

1. variabel terikat (dependent variable): jumlah sel spermatogenik

mencit berdasarkan masing-masing jenis sel (spermatogonium,

spermatosit I dan spermatid bundar).

2. variabel bebas (independent variable): jenis perlakuan (ekstrak akar

ginseng jawa, standar β-sitosterol) dan lama waktu perlakuan.

3. variabel terkendali: umur, strain mencit, berat badan, suhu kandang,

pakan dan minum yang diberikan selama pemeliharaan.

3.5. Cara Kerja

3.5.1. Persiapan hewan coba.

Mencit jantan dewasa belum pernah kawin yang berumur 8 -10 minggu,

dengan rentang berat badan 25-35 g sebanyak 48 ekor dikelompokkan dalam 4

kelompok. Aklimasi dilakukan pada hewan coba selama 14 hari dalam rumah

hewan. Selama masa aklimasi dan perlakuan, mencit diberi pakan berupa pakan

ayam petelur “Comfeed PAR LI – PELLET” produksi PT. JAPFA Comfeed

Indonesia Tbk. dan air minum secara ad libitum. Perlakuan dilakukan pada sore

hari pada pukul 15.00 – 16.00 WIB, dan pada akhir perlakuan dilakukan sampling

untuk pengambilan testis. Tiap-tiap kelompok hewan coba ditempatkan pada bak

plastik. Bak plastik dialasi sekam, yang diganti setiap minggu sekali, dengan

kondisi ruang rumah hewan coba pada suhu + 25°C.

32

3.5.2. Pembuatan ekstrak akar ginseng jawa.

Pembuatan ekstrak akar ginseng jawa menurut Winarni (2007), akar ginseng

jawa basah sebanyak kurang lebih 23,16 kg diiris tipis dan dikeringanginkan.

Irisan kering digiling hingga menjadi serbuk seberat 4 kg. Sebanyak 0,5 kg serbuk

halus tersebut di maserasi dalam pelarut metanol selama 24 jam pada suhu kamar,

hingga dapat dipisahkan antara filtrat (cairan) dan residu (ampas)nya. Filtrat yang

didapat yang telah bercampur dengan metanol, disaring dan diuapkan

menggunakan rotary vacuum evaporator pada suhu 40 oC sehingga didapatkan

ekstrak akar ginseng jawa kental yang berbentuk gel.

3.5.4. Pembuatan larutan.

Ethinyloestradiol (EE2), ekstrak akar ginseng jawa dan standar β-sitosterol

masing-masing dilarutkan dalam 0,5% Carboxy methyl cellulose (CMC) sesuai

dosis masing-masing.

1. Dosis ekstrak akar ginseng jawa yang diberikan setara dengan 1,96 mg

serbuk/20 g BB/hari, sedangkan 1 g serbuk ginseng jawa setara dengan

46,3158 x 10-3 g ekstrak kasar ginseng jawa.

3.5.5. Pengelompokan dan perlakuan hewan coba.

Mencit sebanyak 48 ekor dikelompokkan dalam 4 kelompok, yaitu

kelompok kontrol positif, kontrol negatif, dan 2 kelompok perlakuan meliputi

ekstrak akar ginseng jawa dan standar β-sitosterol. Selanjutnya untuk masing-

masing perlakuan dibedakan lagi berdasarkan lama waktu perlakuan, yaitu 9, 18

dan 27 hari. Masing-masing sub kelompok terdiri dari 4 ekor mencit.

33

Tabel 3.1. Pengelompokan dan perlakuan hewan coba

Kelompok perlakuan

Lama waktu perlakuan (hari) 9

18

27

Kontrol positif (Kp) Kp-9 Kp-18 Kp 27 Kontrol negatif (Kn) Kn-9 Kn-18 Kn-27 Ginseng jawa (Gj) Gj-9 Gj-18 Gj-27

Standar β-sitosterol (Ps) Ps-9 Ps-18 Ps-27 Keterangan :

Kontrol positif (Kp) :larutan 0,5% CMC sebanyak 0,5 ml/hari tanpa estrogen, ginseng Jawa, ataupun standar β-sitosterol.

Kontrol negatif (Kn) :EE2 0,5 ml/hari setara dengan dosis 0,56 μg EE2/20g BB/hari

Ginseng jawa (Gj) :larutan 0,5% CMC sebanyak 0,25 ml/hari dan 0,25 ml/ hari ekstrak akar ginseng Jawa setara 1,96 mg serbuk/20 g BB/hari.

Standar β-sitosterol (Ps) :larutan 0,5% CMC sebanyak 0,25 ml/hari dan 0,25 ml/ hari larutan standar β-sitosterol

Carboxy methyl cellulose atau CMC digunakan sebagai pelarut, CMC

adalah derivat dari selulosa dengan gugus carboxymethyl (-CH2-COOH) berikatan

dengan gugus hidroxyl. Carboxy methyl cellulose digunakan sebagai pengental

dan untuk menstabilkan larutan, yang memiliki tingkat kekentalan yang tinggi dan

tidak beracun (Chaplin, 2008). Tujuan penggunaan CMC karena CMC berbasis

lipid yang dapat melarutkan hormon steroid dan ekstrak ginseng jawa. Sebelum

diberikan perlakuan, mencit diaklimasi dahulu dalam rumah hewan selama 14

hari. Sembilan hari sebelum perlakuan dimulai, dilakukan pra perlakuan terlebih

dahulu dengan pemberian 0,5 ml/hari estrogen yang setara dengan 1,4 μg EE2/20

g BB/hari.

34

3.5.6. Pengambilan Darah

Kadar glukosa darah mencit dapat diketahui dengan…… Cara pengambilan

darah dengan cara…

3.5.7. Pengumpulan data.

Data diperoleh dengan cara menghitung jumlah sel spermatogenik meliputi

spermatogonium, spermatosit I dan spermatid bundar dalam satu tubulus

seminiferus. Pengumpulan data dilakukan dengan mengamati sediaan testis di

bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 400 x. Dalam satu sediaan, berisi

sepasang irisan testis, dengan setiap sediaan diamati sebanyak lima lapang

pandang secara acak. Setiap lapang pandang diamati satu tubulus seminiferus

bentuk bundar dengan kriteria jenis sel spermatogenik mengacu pada tahap 7 dari

siklus epitel (van Tienhoven, 1983), yaitu spermatogonia tipe A, spermatosit

primer tahap istirahat, spermatosit pakiten, spermatid bundar tahap 7, dan

spermatozoa tahap 19. Penghitungan jumlah sel yaitu spermatogonium,

spermatosit I dan spermatid bundar dengan hand counter. Dari penghitungan

sebanyak 5 kali, dibuat rata-rata dan selanjutnya dilakukan analisis data hasil

penelitian.

Gambar 3.1. Lokasi lapangan pandang pada irisan testis untuk pengamatan jumlah sel spermatogenik

35

3.6. Analisis Data

Data yang diperoleh kemudian dianalisis dengan uji Anava (analisis

varians) dua arah dan satu arah untuk menguji hipotesis yaitu mengetahui

pengaruh pemberian perlakuan ginseng jawa dan standart β-sitosterol, pengaruh

lama waktu serta pengaruh interaksi keduanya terhadap proses spermatogenesis

mencit. Selanjutnya jika terdapat perbedaan yang signifikan dilanjutkan dengan

uji LSD (Least significant differences) atau BNT (beda nyata terkecil)

menggunakan α = 0,05 dengan perbedaan signifikan pada p (probabilitas) < 0,05.

Sebelum dilakukan uji Anava, terlebih dahulu distribusi datanya diuji dengan

Kolmogorov-Smirnov dan dilanjutkan dengan uji homogenitas.