Uji Cemaran Mikroba dan Uji Sterilitas

I. Tujuan1.1. Uji Cemaran MikrobaDapat melakukan penetapan jumlah cemaran mikroba yang terdapat pada sediaan farmasi (baik obat, kosmetika, maupun bahan baku), makanan, dan minuman.1.2. Uji SterilitasDapat menentukan apakah sediaan atau alat yang harus ada dalam kondisi steril, memenuhi syarat steilitas sebagai bagian persyaratan resmi dari pengawasan mutu.

II. Prinsip2.1. Uji Cemaran MikrobaBerdasarkan pada mikroorganisme yang hidup atau ada dalam suatu bahan ata cuplikan, ditumbuhkan pada media dengan kondisi yang sesuai, suhu optimal dan nutrisi yang cukup, maka sel akan berkembngbiak dan membentuk koloni yang dapat diamati dengan mata. Tiap sel yang hidup akan berkembangbiak menjadi 1 koloni. Jumlah kolon yang muncul pada cawan merupakan petunjuk bagi jumlah mikroorganisme hidup yang terkandung dalam bahan atau cuplikan tersebut.2.2. Uji SterilitasBerdasarkan pada ada atau tidaknya pertumbuhan mikroba pada media yang diinokulasikan dan diinkubasikan pada suhu yang sesuai.

III. Teori Dasar3.1. Uji Cemaran MikrobaCemaran merupakan bahan kimia, fisik, biologik yang keberadaannya dalam panganpada batas tertentu dapat menimbulkan risiko terhadap kesehatan. Cemaran mikroba merupakan mikroba yang keberadaanya dalam pangan pada batastertentu dapatmenimbulkan risikoterhadap kesehatanKoloni yang tumbuh tidak selalu berasal dari satu sel mikroorganisme, karena beberapa mikroorganisme tertentu cenderung untuk berkelompok. Bila ditumbuhkan pada media atau lingkungan yang sesuai, kelompok bakteri ini hanya akan menghasilkan satu koloni. Berdasakan hal tersebut, seringkai digunakan istilah Colony Forming Units.Pemahaman tentang satuan dalam menghitung sel mikroba khususnya bakteri adalah sangat penting. Pada hasil akhir penghitungan bakteri pada cawan digunakan satuan CFUs/volume atau berat. CFUs adalah singkatan dariColoni Forming Units yang artinya unit-unit/satuan pembentuk koloni. Yang dimaksud satuan pembentuk koloni adalah sel tunggal atau sekumpulan sel yang jika ditumbuhkan dalam cawan akan membentuk satu koloni tunggal. Pada dasarnya sel tersebar homogen pada sampel, tetapi ada jenis bakteri yang memang pembelahan selnya dapat terpisah baik sehingga tersebar merata tiap sel dan ada pula bakteri yang setelah membelah sel anakan masih menempel pada induknya, seperti halnya yang terjadi padastreptococcus, diplococcus, sarcinadan lain-lain, sehingga penyebarannya berkelompok-kelompok. Pada jenis yang seperti ini jika tersebar merata dalam kelompok-kelompok sel maka pertumbuhan menjadi koloni tunggal bukan berasal dari satu sel saja melainkan dari beberapa sel.Mikroorganisme dapat kita jumpai pada seluruh lingkunganbaiklingkungan normal maupun ekstrim. Setiap mikroorganisme membutuhkan kondisi lingkungan tertentu terkait dengan karakter morfologi dan biokimia (metabolisme) yang dimilikinya. Oleh karena itu, lingkungan hidup suatu mikroorganisme akan berbedabeda dan ada kalanya hanya spesifik untuk mikroorganisme tertentu.Dalam suatu lingkungan, tidak dapat dihindari bahwa mikroorganismeakan selalu berinteraksi dengan organisme lain, baik dengan kelompoknya sendiri maupun dari kelompok lain. Kondisi lingkungan yang kompleks telah membentuk suatu pola interaksi dengan organisme lain.Mikroorganisme memiki berbagai peran penting dalam suatu ekosistem. Peran inidapatdiemban dalam kapasitasnya sebagai organisme tunggal (sel atau koloni) maupun dalam kaitannya sebagai organisme yang memiliki kebutuhan dan kemampuan untuk berinteraksi dengan organisme lain.Untuk menumbuhkan mikroorganisme,pertama harus memahami kebutuhan dasarnya.Kemudian memformulasikan suatu medium atau bahan yang akan digunakan.Air sangat penting bagi organisme bersel tunggal sebagai komponen utama protoplasmanya serta untuk masuknya nutrien ke dalam sel.Pertumbuhan kuman merupakan peningkatan umlah sel kuman yang terjadi akibat peningkatan biomassa kuman yang teratur, pertumbuhan kuman memerlukan lingkungan nutrisi yang cocok sehingga dapat mendukung proses perkembangbiakan kuman. Konsentrasi sel kuman dapat diukur dengan perhitungan jumlah sel hidup dengan cara pengenceran yang diikuti dengan penentuan unit pembentukan koloni pada permukaan media agar.Pengenceran adalah suatu cara atau metoda yang diterapkan pada suatu senyawa dengan jalan menambahkan pelarut yang bersifat netral, lazim dipakai yaitu aquadest dalam jumlah tertentu. Penambahan pelarut dalam suatu senyawa dan berakibat menurunnya kadar kepekatan atau tingkat konsentrasi dari senyawa yang dilarutkan/diencerkan.Karena jumlah sel bakteri biasanya sangat tinggi dalam sampel asli.Metode ini memiliki beberapa kelemahan, namun. Cedera bakteri mungkin tidak selalu membentuk koloni. Juga, karena tidak ada solusi tunggal yang pengencer mendukung pertumbuhan semua jenis bakteri, beberapa bakteri dapat dibiarkan keluar dari setiap prosedur penghitungan yang diberikan.Banyak tersedia metode untuk menganalisa jumlah mikroorganisme dalam suatu sampel, diantaranya adalahplate count(spread plate, pour plate, spiral plate),membrane filtration, MPN, menghitung langsung dengan Petroff Hausser ataupun cara lainnya (misalnya aktivitas metabolik, turbidimetri, berat kering dan lain-lain)Jumlah mikrobia pada suatu bahan dapat ditentukan dengan bermacam-macam cara, tergantung pada bahan dan jenis mikrobia yang ditentukan. Jenis populasi mikrobia dlama tanah, air, bahan makanan, dll. Berbeda-beda tergantung pada susunan bahan tersebut. Ada 2 cara perhitungan jumlah mikrobia, yaitu perhitungan secara langsung (direct method) dan secara tidak langsung (indirect method).1. Perhitungan Jumlah Mikrobia secara LangsungCara ini dipakai untuk menentukan jumlah mikrobia keseluruhan baik yang mati maupun yang hidup. Ada beberapa cara perhitungan antara lain :a. Menggunakan counting chamberPerhitungan ini dapat memakan haemacytometer, Petroff-Hausser Bacteria Counter atau alat-alat lain yang sejenis. Dasar perhitungannya ialah dengan menempatkan 1 tetes suspensi bahan atau biakan mikrobia pada alat terebut, ditutup dengan gelas penutup kemudia diamat idengan mikroskop yang perbesarannya tergantung pada besar kecilnya mikrobia. Dengan menentukan jumlah sel rata-rata tiap petak (ruangan) yang telah diketahui volumenya dari alat tersebut dapat ditentukan jumlah sel mikrobia tiap cc.b. Menggunakan cara pengecatan dan pengamatan mikroskopikPada cara ini mula-mula dibuat preparat mikroskopik pada gelas benda : suspensi bahan atau biakan mikrobia yang telah diketahui volumenya diratakan di atas gelas benda pada suatu luas tertentu. Setelah itu preparat dicat dan dihitung jumlah rata-rata sel mikrobia tiap bidang pemandangan mikroskop. Luas bidang pemandangan mikroskop dihitung dengan mengukur garis tengahnya. Jadi jumlah mikrobia yang terdapat pada gelas benda seluruhnya dapat dihitung. Dengan perhitungan dapat diperoleh jumlah mikrobia tiap cc bahan/cairan yang diperiksa. Cara yang hampir sama yang biasanya dipakai untuk menghitung jumlah bakteri ialah dengan mencampurkan 1 cc biakan bakteri dengan 1 cc dara manusia; setelah tercampur homogen dibuat preparat mikroskopik. Dari perbandingan jumlah rata-rata sel bakteri dan jumlah sel darah merah dalam tiap bidang pemandangan, jumlah bakteri tiap cc dapat dihitung, sebab darah manusia yang normal rata-rata mengandung 5 juta sel darah merah tiap cc.c. Menggunakan filter membran (milliporefilter)Mula-mula disaring sejumlah volume tertentu suatu suspensi bahan atau biakan mikroba kemudian disaring dengan filter membran yang telah disterilkan. Dengan menghitung jumlah sel rata-rata tiap kesatuan luas pada filter membran dapat dihitung jumlah sel dari volume suspensi yang disaring. Kalau perhitungan secara biasa sukar, perlu dilakukan pengecatan pada filter membran, kemudia filter membran dijenuhi dengan minyak imersi supaya dapat menjadi trasparan.2. Perhitungan Jumlah Mikrobia secara Tidak Langsunga. Menggunakan sentrifugeCaranya ialah 10 cc biakan cair mikrobia disentrifuge dengan memakai sentrifuge yang biasa dipakai untuk menentukan jumlah butir-butir darah. Supaya hasilnya dapat dipertanggungjawabkan, maka kecepatan dan waktu sentrifugasi harus diperhatikan. Setelah diketahui volume mikrobia keseluruhan makan dapat dipakai untuk menentukan jumlah sel-sel mikrobia tiap cc, yaitu dengan membagi volume mikrobia keseluruhan dengan volume rata-rata tiap sel mikrobia.b. Berdasarkan kekeruhanDasar penentuan cara ini ialah jika seberkas sinar dilewatkan pada suatu suspensi mikrobia makan makin pekat (keruh) suspensi tersebut makin besar intensitas sinar yang diabsorpsi sehingga intensitas sinar yang diteruskan makin kecil. Untuk keperluan ini dipakai alat-alat seperti photoelectric turbidimeter : electrophotometer; spectrophotometer; nephelometer dan alat lain yang sejenis. Alat tersebut memakai sinar monokromatik dengan panjang gelombang tertentu. Dengan membaca persentase sinar yang diabsorpsi atau sinar yang diteruskan dan dibandingkan dengan suspensi standar mikrobia sama yang telah diketahui jumlahnya tiap cc. Alat yang paling sederhana untuk penentuan tersebut ialah komparator blok, tapi penggunaan alat ini kesalahannya sangat besar sebab cara pengamatannya hanya memakai mata biasa.c. Menggunakan penghitung elektronik (electronic counter)Alat ini dapat menentukan beribu-ribu sel tiap detik secara tepat. Prinsip kerjanya ialah adanya gangguan-gangguan pada aliran ion-ion (listrik) yang bergerak di antara kedua elektrode. Penyumbatan sementara oleh sel mikrobia pada pori sekat yang terdapat di antara kedua elektrode itu menyebabkan terputusnya aliran listrik. Jumlah pemutusan aliran tiap satuan waktu dihubungkan dengan kecepatan aliran cairan yang mengandung mikrobia merupakan ukuran jumlah mikrobia dalam cairan tersebut.d. Berdasarkan analisa kimiaCara ini didasarkan atas hasil analisa kimia sel-sel mikrobia. Makin banyak sel-sel mikrobia, makin besar hasil analisa kimianya secara kuantitatif. Yang dipakai sebagai dasar penentuan umummnya ialah kandungan protein : asam-asam nukleat (DNA dan RNA) atau fosfor dari asam-asam nukleat, dan sebagainya.e. Berdasarkan berat keringCara ini terutama digunakan untuk penentuan jumlah jamur benang misalnya dalam industri mikrobiologi. Kenaikan berat kering suatu mikrobia berarti juga kenaikan sintesa dan volume sel-sel yang dapat dipakai untuk menentukan jumlah mikrobia.f. Menggunakan cara pengenceranCara pengenceran ini dipakai untuk menentukan jumlah mikrobia yang hidup saja. Dasar perhitungannya ialah mengencerkan sejumlah volume tertentu suatu suspensi bahan atau biakan mikroba secara bertingkat. Seletah diinokulasikan ke dalam medium dan diinkubasikan dilihat adanya pertumbuhan mikrobia. Misalnya suatu seri pengenceran dengan kelipatan 10 pada pengenceran 1 : 1000 ada pertumbuhan tetapi pada pengenceran 1 : 10000 tidak ada pertumbuhan, berarti secara teoretis jumlah mikrobia pada suspensi bahan atau biakan mikrobia antara 1000 dan 10000 tiap cc.g. Menggunakan cara Most Probable Number (MPN)Cara di atas kurang tepat mengingat tidak semua mikrobia dapat tumbuh dalam suatu medium pada keadaan tertentu. Untuk mengatasinya makan tiap pengenceran dibuat beberapa ulangan, hasilnya secara matematik dapat untuk menentukan kemungkinana besar jumlah mikrobia yang terdapat dalam suspensi bahan tersebut. Cara ini dikenal sebagai Most Probable Number (jumlah mikrobia yang paling mungkin). Untuk penentuan jumlah mikrobia yang paling mungkin digunakan daftar Most Probable Number misalnya daftar HOSKINS atau daftar MC.CRADY.h. Berdasarkan jumlah koloni (plate count)Cara ini yang paling umum dipakai untuk perhitungan jumlah mikrobia. Dasarnya ialah membuat suatu seri pengenceran bahan dengan keliapatan 10; dari masing-masing pengenceran diambil 1 cc dan dibuat taburan dalam petridish (pour plate) dengan medium agar yang macam dan caranya tergantung pada jenis mikrobia. Setelah diinkubasikan, dihitung jumlah koloni tiap petridish dari masing-masing pengenceran. Dari jumlah koloni dengan kebalikan pengencerannya, misalnya untuk pengenceran 1 : 10000 terdapat 45 koloni bakteri maka tiap cc atau gram bahan mengandung 450000 bakteri. Untuk membantu menghitung jumlah koloni dalam petridish dapat digunakan colony counter yang biasanya dilengkapi dengan electronic register. Pada perhitungan dengan cara ini ada beberapa syarat yang harus dipenuhi, antara lain : Jumlah koloni tiap petridish antara 30-300 koloni, jika memang tidak ada yang memenuhi syarat dipilih yang jumlahnya mendekati 300. Tidak ada koloni yang menutup lebih besar dari setengah luas petridish, koloni tersebut dikenal sebagai spreader. Perbandingan jumlah bakteri dari hasil pengenceran yang berturut-turut antara pengenceran yang lebih besar dengan pengenceran sebelumnya, jika sama atau lebih kecil dari dua hasilnya maka di rata-rata; tapi jika lebih besar dari dua yang dipakai jumlah mikrobia dari hasil pengenceran sebelumnya. Jika dengan ulangan setelah memenuhi syarat hasilnya di rata-rata.Karena ukuran bakteri sangat kecil, menghitung jumlah bakteri dalam sampelsangatsulit. Meskipunmenghitungjumlah langsung dengan mikroskop,akanmemerlukan banyak waktu dan keahlian. Sebuah metode yang lebih mudah adalah untuk menyebarkan bakteri di wilayah yang luas (plate agaryaitu nutrisi) dan menghitung jumlah koloni yang tumbuh. Jika bakteri ini menyebar cukup, setiap sel bakteri dalam sampel asli harus menghasilkan koloni tunggal. Biasanya, sampel bakteri harus diencerkan jauh untuk mendapatkan jumlah yang wajar.Ketika seseorang bermaksud untuk menentukan jumlah sel dalam kultur bakteri salah satu cara untuk melakukan ini adalah dengan melakukan pengenceran serial.Prosedur mikrobiologis untuk pemeriksaan dalam makanan tekhnik mikroskopik dan metode diferensial digunakan secara ektensif untuk memudahkan isolasi dan perhitungan tipe dari mikroorganisme tertentu. Macam pemeriksaan yang dilakukan ditentukan oleh tipe produk pangan yang akan diperiksa dengan tujuan pemeriksaan.Kebanyakan pada bahan makanan merupakan suatu media yang baik pertumbuhan banyak macam mikroorganisme. Pada keadaan fisik yang menguntungkan terutama pada kisaran 70 50oC organisme akan tumbuh dan menyebabkan terjadinya suatu perubahan dalam hal penampilan rasa, bau, serta sifat sifat lain pada suatu bahan makanan.Berbagai penyakit atau infeksi yang berbeda-beda mungkin terjadi karena memakan makanan yang terkontaminasi dengan organisme patogen. Infeksi makanan terjadi karena memakan makanan yang mengandung organisme hidup yang mampu sembuh atau bersporulasi dalam usus yang menimbulkan penyakit.3.2. Uji SterilitasJika perkembangan mikroba terdeteksi dalam uji sterilitas, maka hal ini dapt mencerminkan pembacaan positif yang salah (false positive reading) karena masalah kontaminasi aksidential dari media kultur pada saat uji sterilitas berlangsung.Pengjian sterilitas dilakukan terhadap hanya satu bagian kecil dari suatu batch atau lot sediaan, tetapi hasilnya harus dapat mereflesikan keadaan dari keseluruhan batch/lot tersebut. Jumlah sample yang diambil untuk pemeriksaan sterilitas harus mewakili seluruh batch dan jumlahnya harus cukup agar hasilnya dpat memenuhi batas batas keyakinana memadai.Menurut Farmakope edisi IV (1995), uji sterilitas digunakan untuk menetapkan apakah suatu bahan/sediaan farmasi yang diharuskan steril memenuhi syarat sesuai dengan uji sterilitas seperti yang tertera pada masing-masing monografi, diaman untuk penggunaannya sesuai dengan prosedur pengujian sterilitas sebagai bagian dari pengawasan mutu pabrik, seperti yang tertera dalam sterilisasi dan jaminan sterilitas bahan.Uji sterilitas merupakan suatu cara pengujian untuk mengetahui suatu sediaan atau bahan farmasi atau alat-alat kesehatan yang dipersyaratkan harus dalam keadaan steril. Dengan demikian sediaan dan peralatan tersebut harus bebas dari mikroorganisme. Jadi, hanya dikenal sediaan dan peralatan tersebut steril atau tidak steril, tidak ada istilah hampir atau setengah steril. Suatu bahan dinyatakan steril apabila bebas dari mikroorganisme hidup yang patogen maupun yang tidak, baik dalam bentuk vegetatif maupun dalam bentuk tidak vegetatif.Definisi sterilitas dan sterilisasi. Menurut beberapa pustaka/ sumber :1) Menurut RPS Sterilitas adalah karakteristik yang disyaratkan untuk sediaan farmasetik bebas dari mikroorganisme hidup karena metode, wadah atau rute pemakaian.2) Menurut Sterile Dosage FormSterilitas adalah karakteristik yang disyaratkan untuk sediaan-sediaan farmasetik karena metode, wadah atau rute pemakaian3) Menurut Pharmaceutical Dosage Form Sterilitas didefinisikan sebagai ketidakhadiran dari semua bentuk organisme. BDefinisi sterilisasi, menurut berbagai sumber diantaranya :1) Menurut ScovillesSterilisasi adalah suatu proses membunuh atau menghilangkan bakteri dan mikroorganisme lain.

2) Menurut Ansel Sterilisasi adalah suatu proses yang dilakukan terhadap sediaan farmasetik berarti penghancuran sempurna seluruh mikroorganisme dan sporanya atau penghilangan mikroorganisme dari sediaan.3) Menurut Mikrobiologi Farmasi DasarSterilisasi adalah suatu proses untuk membunuh atau memusnahkan semua mikroorganisme atau jasad renik yang ada, sehingga jika ditumbuhkan didalam suatu medium tidak ada lagi mikroorganisme atau jasad renik yang dapat berkembang biakSterilisasi ialah proses untuk membunuh semua jasad renik yang ada, sehingga di tumbuhkan di dalam suatu medium tidak ada lagi jasad renik yang dapat berkembangbiak. Sterilisasi harus dapat membunuh jasad renik yang paling tahan panas yaitu spora bakteri.Proses sterilisasi dipergunakan pada bidang mikrobiologi untuk mencegah pencemaran organisme luar, pada bidang bedah untuk mempertahankan keadaan asepsis, pada pembuatan makanan dan obat-obatan untuk menjamin keamanan terhadap pencemaran oleh mikroorganisme dan di dalam bidang-bidang lain pun sterilisasi ini juga penting.Tidak seperti syarat banyak sediaan yang lain, syarat sterilitas adalah nilai yang mutlak. Sebuah sediaan baik steril maupun non steril. Secara historis, pertimbangan sterilitas bersandar pada uji sterilitas lengkap yang resmi, namun sediaan akhir pengujian sterilitas mengalami banyak batasan [1-4]. Batasan yang paling nyata adalah sifat dasar dari uji sterilitas. Ini adalah uji yang dekstruktif; sehingga, hal ini tergantung pemilihan statistik sampel acak dari keseluruhan lot. Ketidakpastian akan selalu ada selama sampel secara tegas mewakili keseluruhan. Jika diketahui bahwa satu unit dari 1000 unit terkontaminasi (yakni, angka kontaminasi = 0,1%) dan 20 unit disampel secara acak dari 1000 unit, kemungkinan unit yang terkontaminasi dari 20 sampel itu adalah 0,02. Dengan kata lain, hanya 2% peluang dari yang unit yang terkontaminasi akan dipilih sebagai bagian 20 wakil sampel dari keseluruhan 1000 unit.Batasan-batasan utama ini menunjukkan bahwa kepercayaan pada pengujian sterilitas produk akhir saja dalam memastikan sterilitas sediaan parenteral dapat mengarahkan kepada hasil yang keliru. Salah satu tujuan validasi pada pembuatan sediaan steril adalah untuk meminimalkan ketidakpercayaan terhadap pengujian produk akhir. Tiga prinsip yang terlibat dalam proses validasi sediaan steril adalah :1. Untuk membuat sterilitas kedalam sediaan2. Untuk menunjukkan tingkat kemungkinan maksimum yang pasti dimana proses dan metode sterilisasi memiliki sterilisasi yang terpercaya terhadap semua unit dari batch sediaan.3. Untuk memberikan jaminan yang lebih luas dan mendukung hasil dari uji sterilitas sediaanMetode yang digunakan untuk mendapatkan sterilitas pada sediaan farmasi sangat ditentukan oleh sifat sediaan dan zat aktif yang dikandungnya. Walau demikian, apa pun cara yang digunakan, produk yang dihasilkan harus memenuhi tes sterilitas sebagai bukti dari keaktifan cara, peralatan, dan petugas a. Sterilisasi uap (Lembab Panas). Sterilisasi uap dilakukan didalam autoklaf dan menggunakan uap air dengan tekanan. Cara ini diakui sebagai cara terpilih pada hamper semua keadaan dimana produk mampu diperlukan seperti itu. Sebagian produk yang tidak tahan panas dan tidak dapat dipanaskan dengan aman pada temperature yang dibutuhkan untuk sterilisasi panas kering (lebih kurang 170oC). Bila ada kelembapan (Uap air), bakteri terkoagulasi dan dirusak pada temperature yang lebih rendah dari pada bila tidak ada kelembapan. Kenyataannya, sel bakteri dengan kadar air besar umumnya lebih mudah dibunuh. Spora-spora yang kadar airnya relative rendah lebih sukar dihancurkan. Adanya uap air yang panas dalam sel mikroba menimbulkan kerusakan pada temperature yang relative rendah. Kematian oleh pemanasan kering timbul karena sel mikroba mengalami dehidrasi diikuti dengan pembakaran pelan pelan dari proses oksidasoi. Karena tidak mungkin mendapatkan uap air dengan temperature diatas 100oC pada kondisi atmosfer, maka tekanan digunakan untuk mencapai temperature yang lebih tinggi. Tekanan uap air yang lazim, temperature yang dapat dicapai dengan tekanan tersebut, dan penetapan waktu yang dibutuhkan untuk sterilisasi sesudah system mencapai temperature yang ditentukan, adalah sebagai berikut : Tekanan 10 pound (115,5oC), untuk 30 menit Tekanan 15 pound (121,5oC), untuk 20 menit Tekanan 20 pound (126,5oC), untuk 15 menit.Dapat dilihat, makin besar tekanan yang dipergunakan makin tinggi temperature yang dicapai dan makin pendek waktu yang dibutuhkan untuk sterilisasi.b. Panas kering Panas kering, zat-zat yang tahan peruraian pada temperature diatas kira-kira 140oC (284oF) bisa dibuat sterl dengan cara pemanasan kering. Pemaparan selama 2 jam pada temperature 180oC atau 45 menit dalam 260oC biasa dapat diharapkan membunuh spora dan bentuk vegetative dari semua mikroorganisme. Sterilisasi panas kering umumnya digunakan senyawa-senyawa yang tidak efektif disterilkan dengan uap air panas. Senyawa-senyawa tersebut meliputi minyak lemak, gliserin, berbagai produk minyak tanah seperti petrolatum cair (minyak mineral), paraffin, dan berbagai serbuk yang stabil oleh pemanasan seperti ZnO. c. Sterilisasi dengan penyaringan Sterilisasi dengan penyaringan tergantung pada penghilngan mikroba secara fisik dengan absorbs pada media penyaring atau dengan mekanisme penyaringan, digunakan untuk sterilsasi larutan yang tdiak tahan panas.Dikembangkannya filter berefisiensi tinggi untuk menyaring udara yang berisikan partikel (High Efficiency Particulate Air Filter, atau HEPA) telah memungkinkan dialirkannya udara bersih (bebas debu) ke dalam ruang tertutup. Tipe filtrasi udara semacam ini bersama dengan sistem aliran udara laminar (Laminar Air Flow) kini banyak digunakan untuk menyediakan udara yang bebas dari debu dan bakteri. Filter udara digunakan dalam ruang transfer mikrobiologis untuk mencegah timbulnya kontaminasi pada area-area isolasi untuk mencegah penyebaran infeksi, dan di dalam ruangan-ruangan yang digunakan untuk merakit peralatan elektronik miniatur karena kontaminasi oleh partikel-partikel bahkan sekecil apapun bakteri dapat merusak daya guna komponen peralatan tersebut d. Sterilisasi Gas Beberapa senyawa yang tdiak tahan panas dan uap dapat disterilkan dengan memaparkan gas etilen oksida atau propilen oksida bila dibandingkan dengan cara-cara lain.Sterilisasi gas berjalan lambat waktu sterilisasi tergantung pada keberadaan kontaminasi kelembaban, temperatur dan konsentrasi etilen oksida. Konsentrasi minimum etilen oksida dalam 450 mg/L, 271 Psi, konsentrasi ini 85C dan 50% kelembaban relativ dibutuhkan 4-5 jam pemaparan. Di bawah kondisi sama 1000 mg/L membutuhkan sterilisasi 2-3 jam. Dalam partikel 6 jam pemaparan etilen oksida digunakan untuk menyiapkan tepi yang aman dan memperbolehkan waktu untuk penetrasi gas ke dalam bahan sterilisasi. Sisa gas dihilangkan dengan terminal vakum dilanjutkan oleh pembersihan udara yang difiltrasi. Cara ini digunakan untuk mensterilkan obat serbuk seperti penisilin, juga telah digunakan untuk sterilisasi benang, plastik tube. Penggunaan etilen oksida untuk sterilisasi akhir peralatan parenteral tertentu seperti kertas karf dan lapisan tipis polietilen. Semprot aerosol etilen oksida telah digunakan untuk mensterilkan daerah sempit dimana dilakukan teknik aseptis.e. Sterilisasi dengan radiasi pengionan.Tekhnik-tekhnik yang disediakan untuk sterilisasi beberapa jenis sediaan farmasi dengan sinar gama dan sinar sinar katoda, tetapi menggunakan tekhnik-tekhnik ini terbatas karena memerlukan peralatan yang sangat khusus dan pengaruh radiasi pada produk dan wadah.

IV. Alat dan Bahan4.1. CEMARAN MIKROBA4.1.1. ALAT 4.1.1.1. Cawan petri steril4.1.1.2. Tabung reaksi steril 4.1.1.3. Pipet agar 4.1.1.4. Pipet vol 4.1.2. BAHAN 4.1.2.1. Nutrient agar / PGA4.1.2.2. Sabraud dektrosa agar 4.1.2.3. Lar NaCl 0,9%4.1.2.4. Aquadest steril4.2. UJI STERILITAS 4.2.1. ALAT 4.2.1.1. Cawan petri steril4.2.1.2. Tabung reaksi steril 4.2.1.3. Pipet agar 4.2.1.4. Pipet vol 4.2.2. BAHAN 4.2.2.1. Media fluid thioglycolat4.2.2.2. Media tripstik soybean broth

V. Prosedur5.1. Uji cemaran mikrobaDicairkan media dalam tangas air. Setelah cair, dibiarkan dalam water bath 45-50c kurang lebih 30menit. Dibuat pengenceran decimal dari sampel dengan menggunakan Aquadest steril di dalam labu ukur, lalu diabil filtratnya 10 ml dan diabil 1 ml diencerkan dalam tabung reaksi dari mulai pengenceran 10-1 10-4. Yang akan diujikan yaitu pengujian pada pengenceran 10-3 dan 10-4 secara duplo.

Ditandai cawan petri dengan nama media dan tingkat pengencerannya. Dipipet 1ml dari masing msing media pengenceran dan masukan kedalam cawan petri yang sesuai. Dituangkan agar cair yang suhunya kurang lebih 500C dan homogenkan dengan cara menggoyangkan cawan dengan gerakan searah jarum jam 5x dan gerakan berlawanan sebanyak 5x. dan diusahakan tidak tumpah. Dilakukan duplo untuk setiap pengenceran dan lakukan pada control media untuk setiap media. Kemudian dibiarkan memadat. Setelah itu inkubasi pada suhu yang sesuai. Dihitung jumlah koloni bakteri, kapang dan khamir yang tumbuh pada lempeng agar dan nyatakan dalam satuan cfu/ml.5.2. Uji sterilitas 5.2.1. Uji sterilitas media Uji sterilitas media digunakan untuk melihat apakah media yang akan digunakan itu steril atau tidak. Hasil yang didapat harus steril (media tetap jernih atau tidak ada pertumbuhan mikroba) caranya :Dimasukan 10ml media FTM dan TSB kedalam tabung reaksi inkubasi pada suhu 37c untuk FTM dan 20c untuk TSB, amati selama 1-14hari. Lakukan duplo.5.2.2. Uji fertilitas Uji fertilitas ini untuk melihat apakah media yang akan digunakan memenuhi syarat dapat menumbuhkan mikroba uji atau tidak caranya:Inokulasikan 1ml suspense mikroba uji kedalam 9ml. media dalam tabung reaksi. Bakteri bacillus diinokulasikan pada media FTM dan inkubasikan pada suhu 37c amati selama 1-14 hari. Candida albicans diinokulasikan pada suhu 20-25c amati selama 1-14 hari. Pengerjaan ini dilakukan duplo

5.2.3. Uji bakteriostatik dan fungistatikSebelum melakukan uji sterilitas cara inokulasikan langsung terhadap suatu sediaan, tetapkan dahulu tingkat aktifitas bakteriostatik dan fungiostatik yang mungkin terdapat dalam sediaan yang akan diperiksa.caranya: inkubasikan 1ml suspense nikroba dan 1ml sedian kedalam 9ml media tabung reaksi. Media FTM diinokulasikan dengan bacillus subtilis dan sediaan, inkubasikan pada suhu 35-37c amati 1-14 hari. Media TSB diinokulasikan dengan candida albicans dan sediaan , inkubasikan pada suhu 20-25c amati 1-14 hari. Pengerjaan in dilakukan duplo. Jika sedian uji menunjukan adanya aktifitas bakteriostatik / fungiostatik maka dilakukan uji sterilitas dengan cara penyaringan. Dengan penyaringan zat bakteriostatik / fungistatik yang terdapat dalam sediaan uji akan melewati membrane. Membrane ini yang akan diinokulasikan kedalam media. 5.2.4. Uji sterilitas cara inokulasi langsungCara: inokulasikan 1ml sediaan uji kedalam 9ml media pada tabung reaksi. Media FTM dan TSB, masing masing diinokulasikan dengan 1ml sedian uji. Inkubasikan disuhu 37c untuk FTM dan 20c untuk TSB amati selama 1-14 hari. Pengujian dilakukan duplo.

VI. Data Pengamatan

VII. Pembahasan7.1. Uji Cemaran MikrobaPada praktikum kali ini dilakukan uji cemaran mikroba terhadap sample makanan dan uji sterilitas pada sediaan ampul. Tujuan pada pengujian uji cemaran mikroba adalah untuk melakukan penetapan jumlah cemaran mikroba yang terdapat pada sediaan farmasi (baik obat, kosmetika, maupun bahan baku), makanan serta minuman, sedangkan tujuan untuk pengujian sterilitas adalah untuk dapat menentukan apakah sediaan atau alat yang harus ada dalam kondisi steril, memenuhi syarat sterilitas sebagai bagian persyaratan resmi dari pengawasan mutu. Pada awalnya disiapkan alat alat yang akan digunakan beserta bahan yang diperlukan untuk di sterilkan terlebih dahulu.. Untuk mensterilkan seluruh alat dan media yang akan digunakan pada saat praktikum, disterilkan dengan cara dicuci, dikeringkan, untuk kemudian disumbat dengan kapas berlemak (bagi alat yang bermulut) dan dibalut dengan kertas yang tersedia. Barulah dimasukan ke dalam autoklaf hingga suhunya mencapai 121oC, ini dikarenakan pada suhu ini mikroorganisme sudah mati. Pada sterilisasi alat dibutuhkan waktu 20 30 menit, dan untuk bahan 15 menit. Barulah pada saat alat dikeluarkan, maka di masukan ke oven terlebih dahulu dengan suhu 81oC selama 1 jam. Hal ini dikarenakan agar alat yang digunakan benar benar kering dari uap yang timbulkan pada saat alat di sterilkan di dalam autoklaf.Pada waktu sterilisasi alat dan bahan terdapat perbedaan waktu, ini di karenakan besar tekanan yang digunakan tergantung pada macam bahan dan alat yang disterilkan, sehingga terjadi perpanjangan waktu pemanasan. Dalam percobaan ini mungkin saja terjadi faktor kesalahan, contohnya seperti pada saat pembukusan cawan petri mungkin saja akan salah pembukusan dan terbaliknya cawan petri.Cemaran adalah bahan yang tidak dikehendaki ada dalam makanan yang mungkin berasal dari lingkungan atau sebagai akibat proses produksi makanan,dapat berupa cemaran biologis, kimia dan benda asing yang dapat mengganggu, merugikan dan membahayakan kesehatan manusia. Pada praktikum uji cemaran mikroba ini digunakanlah sample makanan, yakni sebuah wafer coklat. Sampel ini ditimbang sebanyak 5 gram dan kemudian digerus terlebih dahulu hingga hancur.kemudian di encerkan dengan aquadest steril dan di saring hingga mendapatkan filtrat sebanyak 10 ml. Dari filtrat tersebut di ambil 1 ml untuk kemudian di encerkan kembali dalam aquadest steril sebanyak 9 ml di dalam tabung reaksi pertama (10-1) dan dilakukan pengambilan lagi sebanyak 1 ml untuk di encerkan ke tabung kedua (10-2) dan seterusnya hingga tabung ke 5 (10-5). Pengenceran bertujuan untuk mendapatkan koloni yang lebih sedikit sehingga memudahkan dalam proses perhitungan. Setelah itu barulah di pipet sebanyak 1 ml pada pengenceran 10-3 dan 10-4 untuk kemudian dimasukkan ke dalam cawan petri yang telah di sterilkan. Kemudian media NA dituang ke dalam cawan petri yang berisi sampel yang akan diamati. Dan sample dengan media yang akan diuji tersebut dibuat duplo. Lalu larutan dari filtrat sampel dan media dalam cawan petri tersebut diputar seperti angka delapan. Hal ini bertujuan untuk menghomogenkan sampel dengan medianya sehingga koloni mikroorganisme akan tumbuh. Kemudian dilakukan pembungkusan pada cawan petri dengan media yang telah memadat dan membaliknya, ini dikarenakan agar sampel yang akan diamati tidak terkontaminasi dengan mikroorganisme lain. menginkubasi selama dua kali 24 jam pada suhu 37oC. Setelah itu dilakukan penginkubasian di dalam inkubator dengan suhu 37oC karena pada suhu tersebut mikroorganisme dapat tumbuh dengan baik. Waktu pengecekkan dilakukan selama 24 jam dalam 7 hari. Waktu ini merupakan waktu yang cukup banyak untuk mikroorganisme tumbuh karena akibat waktunya berlebih, maka ada sample yang akan sulit untuk dihitung berapa banyak koloni yang ada karena mikroba dapat berkembangbiak dengan sangat cepat. Kemudian proses terakhir dilakukan penghitungan koloni dan pengambilan gambar.Pada praktikum kali ini hasil yang di dapat saat hari pertama tidak ada koloni. Pada pengenceran 10-3 pertama di dapatkan dengan hasil rata rata 12 koloni dalam 5 hari, sedangkan pada pengenceran 10-3 yang kedua didapatkan rata rata 9 koloni dalam 5 hari. Akan tetapi lebih dari itu jumlah koloni yang ada tak dapat terhitung karena terlalu banyak. Kemudian pada pengenceran 10-4 yang pertama di dapatkan hasil sebanyak 41 koloni pada hari kedua dan setelah itu hingga 7 hari koloni yang ada takdapat dihitung jumlahnya, sementara pada pengenceran 10-4 yang kedua didapat sebanyak 53 koloni pada hari yang kedua dan setelah itu hingga 7 hari kedepan jumlahnya tak dapat dihitung karena bakterinya menumpuk.Ada beberapa alasan mengapa mikroorganime dijadikan sebagai indikator mutu, yaitu :1) Kandungan mikroorganisme menentukan mutu bahan makannan karena berkaitan dengan mutu bahan mentah, proses sanitasi, dan keefektifan metode pengolahan.2) Karena itu persyaratan mikrobiologi menjadi salah satu persyaratan yang dikeluarkan oleh Badan pengawas obat dan makanan (BPOM/FDA) agar suatu produk makanan dapat beredar di masyarakat.3) Sutau produk makanan harus memenuhi atauran standar dari SNI (Standar nasional indonesia).Dari hasil praktikum kali ini, dapat diketahui bahwa sampel makanan/ wafer coklat tersebut mengandung cemaran mikroorganisme dan tidak layak dikonsumsi karena melebihi nilai cemaran mikroorganisme yang melebihi ketentuan dari Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia (BPOM RI). Karena menurut BPOM makanan dan minuman steril dalam kemasan seharusnya mengandung kurang dari 10 koloni/ 0,1 ml atau kurangdari 10 koloni/ 0,1 gram. Hasil cemaran yang terjadi ini dapat berasal dari lingkungan yang kurang bersih atau bahan yang digunakan dalam pembuatan makanan dan minuman tersebut telah tercemar oleh mikroorganisme.7.2. Uji SterilitasSterilisasi adalah suatu proses dimana kegiatan ini bertujuan untuk membebaskan alat ataupun bahan dari berbagai macam mikroorganisme. Suatu bahan bisa dikatakan steril apabila bebas dari mikroorganisme hidup yang patogen maupun tidak baik dalam bentuk vegetatip walaupun bentuk nonvegetatif (spora).Tujuan sterilisasi adalah untuk menentukan apakah sesediaan atau alat yang harus berada dalam keadaan steril atau kondisi mutlak yang tercipta sebagai akibat penghancuran dan penghilangan semua mikroorganisme hidup.Pada sediaan obat dan alat kesehatan seharusnya bersifat steril, bebas dari kuman terutama sediaan obat yang langsung kontak dengan mukosa atau langsung masuk ke aliran darah seperti injeksi, tetes mata, cairan infuse dan salep mata. Demikian juga dengan alat-alat kesehatan seperti kasa dan benang bedah. Standar ini dibuat dengan tujuan agar tidak terjadi infeksi pada pasien yang menggunakan sediaan obat maupun alat kesehatan tersebut akibat kontaminasi bakteri patogen. Pada praktikum yang dilakukan kali ini adalah menguji sediaan steril injeksi dengan media TSB (Tryptic Soybean Broth).Berdasarkan hasil pengamatan, sample injeksi yang ada menunjukkan keadaan yang kurang steril ditunjukkan dengan larutan yang menjadi keruh berwarna kuning pucat pada media TSB. Dalam literatur yang ada, seharusnya sampel sediaan injeksi tersebut ada dalam keadaan steril. Kemungkinan pada sampel injeksi itu sendiri sudah mengalami kontaminasi. Kontaminasi yang dimaksud dapat disebabkan oleh beberapa faktor, yakni :1) Pada saat pengocokkan dengan melakukan vortex terjadi kontaminasi antara tabung reaksi dengan tangan karena pada tangan mengandung bakteri floral dan mungkin juga terdapat khamir dan kapang.2) Pada saat mensterilkan media kemungkinan tutup tabung reaksi terbuka, sehingga kontaminan dari alat atau media lain yang terdapat dalam autoklaf yang sama dapat masuk.3) Inkubator yang sering dibuka atau ditutup menyebabkan kapang yang bertebangan di sekitar linkungan inkubator masuk ke dalam media, sehingga mengalami kontaminasi.4) Keadaan di dalam inkubator. Di dalam inkubator ada banyak sekali bahan atau sampel yang sedang diinkubasi. Jika tutup tabung tidak sengaja terbuka, maka sangat memungkinkan kontaminan dari sampel lain masuk ke dalam sampel uji.5) Teknik pekerjaan yang kurang aseptis. Apabila teknik pekerjaan yang kita lakukan kurang aseptis, sangat memungkinkan masuknya kontaminan ke dalam sampel.6) Gelas ukur yang digunakan pada saat mengukur volume sampel tidak steril.7) Pada pemindahan media tidak dilakukan flamir dan tidak memindahkan media dekat nyala api hal ini bisa saja memungkinkan mikroba yang ada pada udara ikut masuk pada cawan kemudian menempel di bahan uji sehingga bahan uji tidak jernih setelah penginokulasian selama beberapa hari.

VIII. KesimpulanDari praktikum kali ini dilakukan uji cemaran mikroba pada sample makanan (wafer coklat) dan uji sterilitas pada sample sediaan farmasi (injeksi). Pada uji cemaran mikroba dapat disimpulkan bahwa sample tidak steril, namun bukan berarti tidak steril, hal ini karena bisa saja akibat berbagai faktor faktor yang dapat mempengaruhi hasil pengujian tersebut. Dan pada pengujian sterilitas pada sample ampul diperoleh hasil yang positif karena menumbuhkan bakteri, seharusnya injeksi haruslah steril dan bebas dari bakteri.

IX. Daftar PustakaAnsel, H. C. 1989. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi Edisi keempat. UI-Press. Jakarta.Pelczar, Michael J and Chan. 2008. Dasar- Dasar Mikrobiologi. Universitas Indonesia. Jakarta.Hadioetomo, S. R. 1990. Mikrobiologi Dasar dan Praktek. PT. Gramedia, Jakarta.Djide, Natsir, dkk. 2008. Mikrobiologi Farmasi Terapan. Fak. MIPA-UH. Makassar.

Lembar Distribusi KerjaTujuan, prinsip, teori, daftar pustaka: DittaAlat dan bahan: DiahProsedur: FirmanData pengamatan: DittaPembahasan uji cemaran: DestyPembahasan uji sterilitas: Desty, FirmanKesimpulan: DestyPengecekan hasil pengamatan: Ditta, Desty, Firman, Diah Editor: Ditta