24

BAB IV

METODE PENELITIAN

4.1 Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian experimental dengan menggunakan

desain penelitian The Post Test Only Control Group Design.

4.2 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan selama empat minggu (Desember 2017-Januari

2018) di Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas

Muhammadiyah Malang.

4.3 Populasi dan Sampel Penelitian

4.3.1 Populasi penelitian

Populasi dalam penelitian ini adalah tikus putih (Rattus Norvegicus)

jantan strain wistar.

4.3.2 Sampel penelitian

Sampel dalam penelitian ini adalah tikus putih (Rattus norvegicus)

jantan strain wistar yang dipilih secara acak dengan jenis kelamin jantan,

umur 2-3 bulan, berat badan 150-250 gram.

4.3.2.1 Kriteria inklusi

1) Tikus putih (Rattus Norvegicus) jantan strain wistar

2) Umur 2-3 bulan

3) Berat badan 150-200 gram

25

4) Sehat, gerakan yang aktif, berwarna putih serta

matanya jernih

4.3.2.2 Kriteria eksklusi

1) Tikus yang mati saat perlakuan

2) Tikus yang sakit saat penelitian (gerak tidak aktif, bulu

rontok dan menggumpal).

3) Tikus yang cacat

4.3.3 Teknik pengambilan sampel

Sampel ini diambil secara simple random sampling dari populasi tikus

putih (Rattus norvegicus) jantan strain wistar sebagai hewan coba. Sampel

terdiri dari 4 kelompok perlakuan.

4.3.4 Perhitungan besar sampel

Pencarian besar sampel pada penelitian ini menggunakan resource

equation method. Awalnya harus menghitung besar replikasi sampel

menggunakan rumus Federer. Terdapat 4 kelompok perlakuan yaitu satu

kelompok kontrol dan tiga kelompok perlakuan (tikus yang diberi ekstrak

kayu manis dosis 100mg/kgBB/hari, 200mg/kgBB/hari dan

400mg/kgBB/hari). Penentuan besar replikasi sampel dalam penelitian

ditentukan menggunakan rumus Federer (1999) dalam Rusda (2016) adalah

sebagai berikut:

(n-1) x (t-1) ≥ 15

(n-1) x (4-1) ≥ 15

(n-1) x 3 ≥ 15

26

3n -3 ≥ 15

3n ≥ 18

n ≥ 6

Keterangan : n = jumlah replikasi

t = banyaknya kelompok

Besar sampel yang digunakan dihitung menggunakan resource

equation methode dengan rumus sebagai berikut:

E = jumlah total hewan coba – jumlah kelompok perlakuan

E = (jumlah replikasi x jumlah kelompok perlakuan) – jumlah

kelompok perlakuan

E = (6x4) – 4 = 20 ekor

Keterangan: E = besar sampel

Untuk mengantisipasi adanya tikus yang drop out selama penelitian,

maka diperlukan adanya tikus cadangan dengan rumus koreksi besar

sampel (Sastroasmoro & Ismael, 2011) sebagai berikut:

n’ = [n/1-f]

n’ = 6/ (1-0,1) = 6,67 = 7

Jumlah tikus cadangan = jumlah kelompok x (n’ – jumlah replikasi)

Jumlah tikus cadangan = 4 x (7-6) = 4 ekor

Keterangan:

n’ = besar sampel terkoreksi

27

n = besar sampel minimum

f = perkiraan proporsi drop out, kira-kira 10% (f = 0,1)

Untuk menentukan jumlah tikus yang digunakan sebagai sampel

dalam penelitian ini menggunakan pendekatan Resource Equation (Arifin &

Zahiruddin, 2017). Maka dari itu, untuk mengetahui sampel minimal yang

dapat digunakan menggunakan rumus :

DF = N – k = kn – k = k (n-1)

n = DF/k+1

n = 10/4 + 1

n = 2,5 + 1 = 3,5

n = 4 ekor

Untuk mengetahui sampel maksimal yang dapat digunakan

menggunakan rumus :

DF = N – k = kn – k = k (n-1)

n = DF/k+1

n = 20/4 + 1

n = 5 + 1

n = 6 ekor

Keterangan :

DF : Derajat kebebasan komponen kesalahan

N : Jumlah sampel penelitian

k : Jumlah kelompok perlakuan

n : Jumlah subyek penelitian setiap kelopok

28

Jumlah total sampel penelitian didapatkan dari penjumlahan besar

sampel dan jumlah tikus cadangan yaitu sebesar 24 ekor tikus dalam 4

kelompok perlakuan, sehingga setiap kelompok diisi 4 ekor tikus.

a. Kelompok I: Kontrol positif diberi pakan standar dan

pemberian Aloksan tanpa ekstrak kulit kayu manis

(Cinnmamomum burmannii)

b. Kelompok II: Diberi pakan standar, pemberian Aloksan, dan

ekstrak ekstrak kulit kayu manis (Cinnamomum burmannii)

dengan pemberian dosis 100 mg/kgBB/hari

c. Kelompok III: Diberi pakan standar, pemberian Aloksan,

dan ekstrak ekstrak kulit kayu manis (Cinnamomum

burmannii) dengan pemberian dosis 200 mg/kgBB/hari

d. Kelompok IV: Diberi pakan standar, pemberian Aloksan,

dan ekstrak ekstrak kulit kayu manis (Cinnamomum

burmannii) dengan pemberian dosis 400 mg/kgBB/hari

4.4 Variabel Penelitian

4.4.1 Variabel bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah ekstrak kulit kayu manis

(Cinnamomum burmannii) dengan dosis 100mg/kgBB, 200mg/kgBB dan

400mg/kgBB yang diberikan kepada tikus putih (Rattus norvegicus) jantan

strain wistar (Rattus norvegicus) yang memenuhi kriteria inklusi.

4.4.2 Variabel tergantung

Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah gambaran rerata

jumlah sel β pankreas tikus putih (Rattus norvegicus) jantan strain wistar.

29

4.5 Definisi Operasional

Tabel 4.1 Definisi Operasional

Variabel Definisi Operasional Hasil Ukur

(Indikator)

variabel

Cara Ukur Alat Ukur Skala

data

Ekstrak kulit kayu manis (Cinnamomum

burmannii)

Ekstrak kulit kayu manis (Cinnamomum burmannii) merupakan ekstrak ethanol kulit kayu manis yang dimaserasi dengan etanol 96% selama 5 hari kemudian disaring dan diambil filtratnya, dilakukan di UPT Materia Medica, Batu, Jawa Timur

Ekstrak kulit kayu manis kental. Dosis I : 100mg/kgBB tikus Dosis II : 200mg/kgBB tikus Dosis III : 400mg/kgBB tikus

Ekstrak kulit kayu manis dengan dosis 100mg/kgBB, 200mg/kgBB dan 400mg/kgBB diukur menggunakan neraca digital dan diberikan ke tikus secara peroral setiap hari selama 14 hari.

Timbangan (Miligram Balance)

Ordinal

Gambaran histopatologi sel β pankreas

Gambaran histopatologi sel β pankreas adalah bentuk sel yang seragam dan ukuran sitoplasma terlihat proposional terhadap inti dan berwarna biru dengan pengecatan aldehid fuschin

Rerata jumlah sel sel β pankreas pada pulau Langerhans per 5 lapang pandang.

Pewarnaan organ pankreas dengan pewarnaan aldehid fuschin dan pembacaan preparat dengan mikroskop pembesaran 400x.

Mikroskop perbesaran 400x

Rasio

30

4.6 Alat dan Bahan Penelitian

4.6.1 Alat

a. Timbangan untuk menimbang berat badan tikus

b. Alat pemeliharaan tikus :

Bak tikus

Penutup kandang dari anyaman kawat

Botol air

Sekam

c. Alat pembedah tikus

Scalpel

Pinset

Gunting

Jarum

Meja lilin

d. Alat pembuatan preparat histologi

Pisau

Kantong kasa

Botol fiksasi dan dehidrasi

Alat dehidrasi otomatis

Blok kayu dan alat potong beku

Mikrotom

Lemari pemanas

Alat pewarna jaringan

Mikroskop binokuler

31

Object glass

Cover glass

e. Alat Lain

Sonde

Mikrometer square

Spuit injeksi 3 ml

Tabung reaksi

Tabung Evendorf

Label

Handscoen

4.6.2 Bahan

a. Bahan pemeliharaan tikus

Makanan buatan pellet comfeed BR-1

Aquadest

b. Ekstrak Kulit Kayu Manis (Cinnamomum burmannii) dalam

berbagai dosis terbagi.

c. Bahan induksi

Aloksan (C4H2N2O4)

d. Bahan anastesi

Kloroform

e. Bahan untuk membuat sediaan histologi pankreas tikus

dengan cara embedding :

Parafin

Alkohol 30%, 50%, 70%, 85%, 95%, 100%

32

Larutan aldehid fuschin

Formalin 10%

Aquadest

4.7 Prosedur Penelitian

4.7.1 Adaptasi Hewan Percobaan

Tikus diaklimatisasi dahulu dengan lingkungan dan pakan selama satu

minggu di laboratorium sebelum injeksi aloksan sambil diamati

kesehatannya. Memberi makanan pada tikus 2 kali sehari. Makanan tikus

adalah broiler 1, sedangkan untuk minum diberikan aquades.

4.7.2 Pembuatan Larutan Aloksan

a. Menyiapkan larutan Aloksan 1,6% dengan cara melarutkan

1,6 g bubuk Aloksan dalam NaCl fisiologis hingga

mencapai 100 ml.

b. Menghitung kebutuhan Aloksan perhari sesuai berat badan

tikus. Berat badan tikus pada penelitian ini rata-rata 200

gram.

Kebutuhan Aloksan adalah sebagai berikut :

Berat badan tikus (gr) Kebutuhan Aloksan

200 160

1000 × 200 = 32 𝑚𝑔

Karena diberikan secara intraperitonial, maka dosis kebutuhan

Aloksan diberikan 2 kali dari dosis semula (kebutuhan larutan Aloksan yang

semula 2 ml menjadi 4 ml). Hal ini disesuaikan dengan dasar teori

33

(Szkudelski, 2001) yang mengatakan apabila Aloksan diberikan secara

intraperitonial atau sub cutan, maka dosis efektif Aloksan harus dinaikkan 2

– 3 kali lebih tinggi.

4.7.3 Pembuatan Ekstrak Etanol Kulit Kayu Manis

Timbang serbuk kulit kayu manis sebanyak 380 g. Lakukan

pembasahan dengan pelarut etanol 96% sebanyak 300 ml. Masukkan serbuk

yang telah dibasahi dengan pelarut ke dalam toples, diratakan dan

ditambahkan pelarut etanol 96% sampai terendam (pelarut digunakan

minimal dua kali berat atau lebih). Pelarut ditambahkan sebanyak 1,5 L.

Tutup toples dengan rapat selama 24 jam. Dan di shaker diatas shaker

digital dengan kecepatam 50 rpm.saring ekstrak cair dengan penyaring kain.

Tampung ekstrak dalam Erlenmeyer. Ampas dimasukkan lagi dalam toples

dan tambahkan pelarut sampai terendam (minimal pelarut 5 cm diatas

permukaan), dalam hal ini digunakan 1 L. Biarkan semalam atau 24 jam

diatas shaker dengan kecepatan 50 rpm. Remaserasi dilakukan sampai

infiltrat atau ekstrak lebih jernih, menggunakan 1 L pelarut. Hasil ekstrak

cair pertama sampai dengan terakhir dijadikan satu dan diuapkan dengan

menggunakan rotary evaporator. Diperlukan waktu 4 jam untuk evaporasi.

Ekstrak yang dihasilkan di evaporasi atau diuapkan diatas water bath selama

2 jam. Pengekstrakan dilakukan oleh Balai Materia Medica Kota Batu.

34

4.7.4 Penentuan Dosis

4.7.4.1 Dosis Aloksan

Larutan Aloksan diberikan pada kelompok II, III dan IV

dengan dosis tunggal 160 mg/kgBB secara intraperitoneal (Ashok

et al., 2007).

4.7.4.2 Dosis Ekstrak Kulit Kayu Manis

Dosis Ekstrak kayu manis (Cinnamomum burmannii) yang

digunakan dalam penelitian ini mengacu pada penelitian

sebelumnya yang dilakukan oleh (Longe, Momoh & Adepoju,

2015). Pada penelitian tersebut telah dibuktikan ekstrak kayu

manis dengan dosis 200 mg/kgBB dapat menurunkan glukosa

darah, profil lipid, dan mengurangi kerusakan hepar akibat

induksi aloksan. Sehingga dosis perlakuan I, II, dan III pada

penelitian ini sebagai berikut :

D1 = ½ x D2 = ½ x 200 mg/ kgBB = 100 mg/ kgBB/hari

D2 = 200 mg/ kgBB/hari

D3 = 2 x D2 = 2 x 200 mg/ kgBB/hari = 400 mg/ kgBB/hari

4.7.5 Percobaan

a. Tahap persiapan tikus putih (Rattus norvegicus) jantan

strain wistar.

Mengambil tikus yang telah dikelompokkan berdsarkan

perlakuan secara satu persatu. Pengambilan tikus dilakukan

dengan hati – hatidan perlahan, sehingga tikus tidak takut

dan stres. Tikus yang ketakutan dan stres akan

35

mempengaruhi kerja hormonnya, sehinggaakan

berpengaruh pada absobrsi ekstrak kulit kayu manis di

dalam tubuh tikus. Setelah itu tikus dipegang dengan cara

memegang badan tikus dan menaruh bagian ekor serta

menjepitnya pada jari antara kelingking dengan jari manis,

lalu menyilangkan kaki depan tikus danmenjepitnya pada

jari antara jari telunjuk dengan jari tengah, sehinggaposisi

tikus siap untuk diberi ekstrak kulit kayu manis.

b. Pemberian ekstrak kulit kayu manis

Kelompok I sebagai kelompok kontrol positif diberi

pakan standar dan perlakuan injeksi Aloksan, sedangkan

pada kelompok II, III, dan IV selain pemberian ekstak kulit

kayu manis dan pakan standar juga diberiperlakuan injeksi

larutan Aloksan intraperitonial pada hari ke 8. Ekstrak kulit

kayu manis diberikan secara peroral dengan sonde masing-

masingdengan dosis 100mg/kgBB/hari untuk kelompok II,

200 mg/kgBB/hari untuk kelompok III dan

400mg/kgBB/hari untuk kelompok IV. Untuk keseragaman

maka pemberian ekstrak kulit kayu manis dilakukan setiap

hari selama 14 hari.

c. Pembuatan tikus hiperglikemia

Dua puluh lima ekor tikus kemudian dibagi dalam 5

kelompok secara random, masing-masing sebanyak 4 ekor

ditambah 1 ekor tikus cadangan dalam masing-masing

36

kelompok. Kelompok I (kontrol positif), II, III dan IV

diberi perlakuan pemberian injeksi larutan Aloksan dengan

dosis tunggal 160 mg secara intaperitoneal pada hari ke 8

untuk mendapatkan tikus hiperglikemia. Menurut penelitian

sebelumnya (Ashok et al., 2007), Kondisi hiperglikemia

pada tikus tersebut akan bertahan selama 1 bulan.

d. Pengambilan pankreas tikus

Setelah semua perlakuan diberikan, semua hewan

percobaan dikorbankan dengan cara cervical dislocation.

Kemudian organ pankreas bagian caput diambil untuk

selanjutnya dibuat preparat histologi dengan metode blok

parafin dan pengecatan aldehid fuschin. Irisan dilakukan

pada bagian medial dari caput pankreas dengan ketebalan

irisan 4-5 mikron. Pengambilan irisan pada bagian medial

caput pankreas ini hanya untuk homogenitas saja.

e. Pewarnaan dengan aldehid fuschin (Bancroft dan Gamble,

2008)

a. Pembuatan larutan aldehid fuschin dikombinasikan

dengan alcian blue. Larutkan pewarna dasar fuschin

ke dalam alkohol dan tambahkan pareldehid serta

HCl. Biarkan pada suhu ruangan selama 2-3 hari,

saring lalu dinginkan di dalam mesin pendingin.

Larutan ini harus ibuat setiap 3-6 bulan dengan pH

larutan 1,7.

37

b. Pembuatan larutan alcian blue (dalam 3% asam

asetat). Larutkan alcian blue 8GX sebanyak 1 gram

dilarutkan dalm 3% asam asetat.

c. Langkah-langkah pewarnaan :

1. Masukkan sediaan yang telah diberi parafin ke

dalam xylene dan keringkan pada larutan

ethanol 70%.

2. Masukkan ke dalam pewarna aldehid fuschin

selama 20 menit.

3. Bilas sediaan dengan larutan ethanol 70%.

4. Bilas dengan cepat dengan air mengalir/air

keran.

5. Masukkan ke dalam pewarna alcian blue (pH

3,5) selama 30 menit.

6. Bilas dengan air mengalir/air keran selama 20

menit.

7. Keringkan dengan ethanol dan bersihkan

dengan xylene.

8. Tutup dengan cover glass.

f. Perlakuan terhadap hewan coba setelah dibedah

Tikus yang telah diambil organ yang akan diteliti

dipastikan mati, bangkai tikus diletakkan dalam wadah

baskom. Bangkai tikus percobaan dikubur di tanah dengan

kedalaman minimal 50 cm dan luas lubang 0,25 m2. Setiap

38

lubang hanya digunakan untuk mengubur 10 tikus secara

bersama, hal ini untuk mencegah bangkai tikus digali oleh

hewan lain seperti kucing. Lubang ditutup kembal dengan

tanah lalu lubang dipadatkan agar tidak tercium bau dari

bangkai tikus tersebut (Sylvestris et al, 2012 dalam Rusda,

2016).

4.7.6 Pengamatan hasil

Sediaan diamati menggunakan mikroskop cahaya dengan pembesaran

400x. Hasil pengamatan akan diperoleh rerata jumlah sel endokrin pada

pulau Langerhans pada tikus kelompok I (kontrol positif), II, III dan IV

39

4.8 Alur Penelitian

Tabel 4.2 Alur Penelitian

Pengamatan dengan mikroskop

Rerata jumlah sel β pankreas

Hasil penelitian

Analisis data

Pengumpulan 24 ekor tikus putih (Rattus novregicus) jantan strain wistar

Kelompok IV 5 ekor tikus

Kelompok III 5 ekor tikus

Kelompok II 5 ekor tikus

Kelompok I 5 ekor tikus

Adaptasi tikus baik pakan maupun lingkungan (hari ke 1-7)

Injeksi Aloksan dengan dosis 160 mg/KgBB/hari pada hari ke-8

Kelompok I

(kontrol

positif) Pemberian

pakan BR-1 + dan minuman aquadest tanpa

pemberian ekstrak kulit kayu manis

(Cinnamomum

burmannii) setiap hari

selama 14 hari (hari 12-25)

Kelompok IV Pemberian

pakan BR-1 + ekstrak kulit kayu manis

(Cinnamomum

burmannii) dosis

400mg/kgBB 1 kali sehari per

sonde dan minuman

aquadest setiap hari selama 14 hari (hari 12-

25)

Kelompok III Pemberian

pakan BR-1 + ekstrak kulit kayu manis

(Cinnamomum

burmannii) dosis

200mg/kgBB 1 kali sehari per

sonde dan minuman

aquadest setiap hari selama 14

hari (hari 12-25)

Kelompok II Pemberian

pakan BR-1 + ekstrak kulit kayu manis

(Cinnamomum

burmannii) dosis

100mg/kgBB 1 kali sehari per

sonde dan minuman

aquadest setiap hari selama 14

hari (hari 12-25)

Setiap tikus dianestesi dengan kloroform secara inhalasi pada hari ke-26

Cek glukosa darah (hari ke-11)

40

4.9 Metode Analisis Data

Data yang diperoleh dalam penelitian ini dianalisis menggunakan uji

normalitas, uji homogenitas, uji ANOVA, uji tukey, uji korelasi, dan uji

regresi yang pengolahannya menggunakan SPSS 23.

a. Uji normalitas bertujuan untuk mengetahui sebaran data normal atau

tidak dengan menggunakan uji Saphiro-Wilk karena besar sampel yang

digunakan ≤ 50. Sebaran data dikatakan normal apabila p > 0,05.

Apabila sebaran data tidak normal, maka dilakukan transformasi data

terlebih dahulu. Apabila hasil transformasi data normal, dilanjutkan

dengan uji One Way Anova dan uji Post-Hoc Bonferroni. Apabila

sebaran data tetap tidak normal, maka menggunakan uji Kruskal-

Wallis dan uji Post-Hoc Mann-Whitney.

b. Uji homogenitas bertujuan untuk mengetahui varian atau

kehomogenan data yang diperoleh dengan menggunakan uji Levene

Test. Data dikatakan homogen apabila p > 0,05.

c. Uji One Way Anova digunakan untuk membuktikan adanya perbedaan

yang bermakna antara kontrol dengan perlakuan. Apabila sebaran data

normal dan data homogen, maka dilanjutkan dengan uji One Way

Anova. Apabila diperoleh sebaran data tidak normal dan data tidak

homogen, maka dilanjutkan dengan uji non parametrik yaitu uji

Kruskal-Wallis.

d. Uji Post-Hoc dilakukan untuk mengetahui dosis minimal ekstrak kulit

kayu manis yang memberikan efek di antara dosis yang digunakan. Uji

Post-Hoc Bonferroni digunakan apabila varian data homogen dan sama

41

sedangkan Post-Hoc Games-Howell atau Tamhane digunakan apabila

varian data tidak homogen.

e. Uji regresi linier untuk mengetahui seberapa kuat hubungan yang

diperoleh dari analisa korelasi, untuk mengetahui seberapa kuat

pengaruh dosis ekstrak kulit kayu manis (Cinnamomum burmannii)

terhadap rerata jumlah sel β pankreas dan untuk memprediksi pengaruh

ekstrak kulit kayu manis (Cinnamomum burmannii) terhadap rerata

jumlah sel sel β pankreas.