34

BAB IV

METODE PENELITIAN

1.1 Jenis penelitian

Jenis penelitian yang digunakan adalah true experimental dengan

rancangan post test only with control group design. Metode yang

digunakan adalah difusi sumuran untuk mengetahui Kadar Hambat

Minimaldan tube dilution untuk mengetahui Kadar Bunuh Minimal

ekstrak kulit nanas (Ananascomosus (L) merr.) sebagai antimikroba

dengan berbagai konsentrasi terhadap bakteri Salamonella typhi.

1.2 Waktu dan tempat penelitian

2

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biomedik Fakultas

Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang dengan estimasi waktu

selama 8 hari.

4.3 Populasi, sampel, estimasi dan jumlah pengulangan

4.3.1 Populasi

Populasi penelitian dalam penelitian ini adalah bakteri Salmonella

typhi yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran

Universitas Muhammadiyah Malang

4.3.2 Sampel

Sampel dalam penelitian ini adalah Salmonella typhi yang telah

dibiakkan dan telah diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37oC dan telah

35

dibuktikan bentuk dansifatnya menggunakan tes gram menunjuk

kanbakteri gram negatif, diambil dengan simple random sampling.

4.3.3 Estimasi dan Jumlah Pengulangan

Penelitian menggunakan 8 kelompok perlakuan ekstrak kulit nanas

dan 2 kelompok kontrol. Sehingga ada 10 kelompok. Berdasarkan rumus

Federal, P adalah jumlah perlakuan dan n adalah jumlah pengulangan,

maka:

(P - 1)(N - 1) ≥ 15

(10 - 1)(N - 1) ≥ 15

9(N - 1) ≥ 15

9N - 9 ≥ 15

9N ≥ 24

N ≥ 2,67 ≈ 3 (pembulatan)

Dari perhitungan diatas, maka diperlukan 3 kali pengulangan untuk

sampel.

4.4 Variabel Penelitian

4.4.1 Variabel Bebas

Variabel bebas pada penelitian ini adalah kadar ekstrak kulit nanas

dengan konsentrasi (100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,12%, 1,56%,

0,78%, 0, 39%, 0%).

4.4.2 Variabel Tergantung

36

Variabel tergantung dari penelitian ini adalah zona hambat yang

menyatakan KHM dan jumlah koloni Salmonella typhi yang menyatakan

KBM.

4.5 Definisi Oprasional

No. Variabel Definisi Operasional Cara

Pengukuran

Indikator

penilaian Skala

Variabel Bebas

1. Ekstrak kulit

nanas

(Ananas

comosus. L)

Ekstrak kulit nanas

adalah kulit nanas yang

dikeringkan kemudian

diekstraksi dan

dimaserasi dengan

larutan etanol 96 % dan

diambil filtratnya dengan

penyaring kemudian

diuapkan dalam rotary

evaporator sehingga

menghasilkan ekstrak

kulit nanas.

Ekstrak kulit

nanas diukur

menggunakan

mikro pipet

sesuai dengan

konsentrasi

pada pada

setiap tabung

Konsentrasi:

1. Kontrol +

2. 0,39 %

3. 0,78%,

4. 1,56%,

5. 3,125%,

6. 6,25%,

7. 12,5%,

8. 25%,

9. 50%,

ordinal

Variabel Tergantung

2. Pertumbuhan

S.typhi

Pertumbuhan bakteri

yang dilihat dengan

Penghitungan

dengan

Jumlah koloni

pada

Rasio

37

menghitung jumlah

koloni pada Salmonella-

Shigella Agar (SSA)

Colony

Counter

Salmonella-

Shigella Agar

(SSA)

3. KHM (Kadar

Hambat

Minimal)

1. kosentrasi

terendah dari

ekstrak etanol

kulit nanas yang

mampu

menghambat

pertumbuhan

bakteri

Salmonella typhi

yang ditandai

dengan

terbentuknya

zona hambat

disekitar lubang

sumuran yang

diberi ekstrak

kulit nanas

Pengukuran

dengan jangka

sorong

Zona hambat

pada

Salmonella-

Shigella Agar

(SSA)

Rasio

4. KBM (Kadar

Bunuh

Minimum)

Kadar terkecil ekstrak

kulit nanas (Ananas

comosus. L) yang mampu

Penghitungan

dengan

Colony

Tidak ada

pertumbuhan

bakteri pada

Rasio

38

4.6 Instrumen penelitian

4.6.1 Alat dan Bahan Identifikasi Salmonella typhi

1. Alat

a. Ose lurus, ose lengkung

b. kertas penghisap

c. Minyak imersi

d. Mikroskop

e. Gelas obyek

f. Tabung reaksi

g. Lampu spirtus

2. Bahan

a. isolate bakteri Salmonella typhi

b. pewarna gram (Kristal violet, lugol, alkohol 96%, safranin)

c. medium pembenihan Salmonella-Shigella Agar (SSA)

d. Bahan tes katalase

membunuh pertumbuhan

bakteri ditandai dengan

ada atau tidaknya

pertumbuhan bakteri dari

goresan hasil dilusi cair

pada SSA

Counter

Salmonella-

Shigella Agar

(SSA)

39

4.6.2. Alat dan Bahan Pembuatan Ekstrak Kulit Nanas (Ananas comosus

(L)Merr)

1. Alat

a. Blender

b. Kertas saring

c. Tabung ekstraktor

d. Tabung destilasi

e. pendingin spiral

f. Water pump

g. Evaporator

h. Vacum pump

i. neraca analitik

j. Corong gelas

k. Cawan porselen

l. Beaker glass

2. Bahan

a. Kulit nanas kering

b. Etanol 96%

c. Aquades

40

4.6.3. Alat dan Bahan Uji Kepekaan Ekstrak Kulit Nanas (Ananas

comosus (L)Merr.)

1. Alat

a. Tabung reaksi steril

b. ose lengkung

c. Spuit 1 ml

d. Inkubator

e. Lampu spirtus

f. Label

g. Vortex

h. Colony counter

i. Petri disk

2. Bahan

a. Perbenihan bakteri Salmonella typhi

b. Ekstrak kulit nanas (Anana scomosus (L)merr.)

.c. SS broth

d. Salmonella-Shigella Agar (SSA)

4.7 Prosedur Penelitian

4.7.1 Sterilisasi Alat

Sterilisasi alat dilakukan dengan cara

1. Mencuci semua peralatan dengan sabun hingga bersih dan

membiarkannya kering

2. Alat-alat yang disterilkan dalam autoklaf dibungkus dalam kertas

sampul dan dimasukkan kedalam autoklaf pada suhu 121oC

41

dengan tekanan 15 atm selama 15 menit. Sedangkan alat yang

tidak dapat disterilkan dengan autoklaf disetrilkan dengan

alkohol 70%.

4.7.2 Pembuat BahanUji

a) Proses Pengeringan

1. Mencuci bersih kulit nanas

2. memotongkecil-kecil

3. Kulit nanas yang telah dipotong kecil-kecil lalu dioven dengan

suhu 80oC atau dengan panas matahari sampai kering (bebas

kandungan air)

b) Proses Ekstraksi

1. Setelah kering sampel dihaluskan dengan blender

2. Bubuk kulit nanas ditimbang dengan menggunakan

timbangan sebanyak 100 gram kemudian dimasukkan ke

dalam gelas Erlenmeyer ukuran 1 liter

3. Kemudian direndam di dalam larutan etanol 96% sampai

volume 900ml dan dikocok sampai benar-benar tercampur

(±30 menit)

4. Didiamkan selama 1 malam sampai mengendap

c) Proses Evaporasi

1. mengambil lapisan atas campuran etanol dengan zat aktif

yang sudah terambil kemudian dimasukkan dalam labu

evaporasi 1 liter

2. Memasang labu evaporasi pada evaporator

42

3. Mengisi water bath dengan air sampai penuh

4. Memasang semua rangkaian alat, termasuk rotator

evaporator, pemanas water bath (diatursampai 90℃),

menyambungkan dengan aliran listrik

5. Membiarkan larutan etanol memisah dengan zat aktif yang

sudah ada dalam labu

6. Ditunggu sampai aliran etanol berhenti menetes pada labu

penampung (± 1,5 sampai 2 jam untuk 1 labu)

7. Hasil yang diperoleh merupakan ekstrakmurni dengan

konsentrasi 100%

4.7.3 Identifikasi Bakteri S. typhi

a) pewarnaan Gram

1.Siapkan gelas objek dan lewatkan diatas api kemudian biarkan

dingin

2. Satu ose aquades steril diteteskan pada gelas objek, kemudian

diambil sedikit bakteri untuk disuspensikan dengan aquades

yang telah diletakkan diatas gelas objek. Kemudian biarkan

kering

3. Suspensi bakteri yang telah kering difiksasi dengan cara

melewatkannya di atas api beberapa kali dan sediaan siap

diwarnai

4. Sedimen ditetesi dengan kristal violet dan ditunggu selama 1

menit. Kemudian kristal violet dibuang dan dibilas dengan air

perlahan-lahan

43

5. Tuangi sediaan dengan lugol selama 1 menit, buang sisa

lugol dan bilas dengan air

6. Sediaan ditetesi dengan alkohol 96% dan ditunggu 5-10

detik, kemudian alkohol dibuang dan dibilas dengan air

7. Sediaan ditetesi dengan safranin dan ditunggu selama menit,

kemudian safranin dibuang dan dibilas dengan air

8. Sediaan dikeringkan dengan kertas penghisap, tetesi dengan

minyak emersi dan siap untuk dilihat di bawah mikroskop

dengan pembesaran objektif 100x

b) Test Katalase

1. Ambil pembenihan cair bakteri (0,1 ml) dan masukkan

dalam tabung reaksi kosong

2. Tetesi dengan larutan H2O2 3%

Tampak adanya gelembung-gelembung udara pada tabung.

c) Penanaman pada Media Salmonella Shigella Agar

Dilakukan inokulasi bakteri pada media SSA yang kemudian

diinkubasikan di dalam incubator pada suhu 37℃ ,selama 18-24

jam. Penanaman ini untuk melihat pertumbuhan koloni bakteri

Salmonella typhi dengan gambaran koloni besar dan low-

convex, kasar, dan biasanya berbentuk oval dengan tumbuh

segaris dengan garis streaking. Kultur berbau khas yang disebut

“grape like odor” atau ”corn taco like odor”. Koloni juga

memberika warna fluoresensi hijau ketika mendapatkan cahaya

44

4.7.4 Pembuatan Pembenihan Cair Bakteri 108 sel/ml

Setelah dipastikan bakteri tersebut merupakan Salmonella

typhi , maka selanjutnya bakteri tersebut dipindahkan dalam tabung

yang berisi nutrient broth dan diinkubasi sealam 18-24 jam pada

suhu 37oC.

Kemudian perbenihan cair bakteri dinilai absorbansinya

dengan spektrofotometer pada gelombang cahaya 540 nm. Dari

nilai absorbansi dapat diperkirakan jumlah kuman perbenihan cair

dengan kalibrasi yang sudah diketahui yaitu 0,1 ekuivalen dengan

jumlah bakteri sebesar 108 CFU/ml. misalnya didapatkan

absorbansi 0,5 maka untukmendapatkan suspensi dengan jumlah

bakteri 108 CFU/ml sebanyak 10 ml dapat dihitung dengan rumus

sebagai berikut:

N1X V1 = N2 X V2

0,5XV1 = 0,1 X 10

V1= 1/0,5

V1 = 2

N1 sama dengan nilai absorbansi yang didapat sedangkan

N2 adalah absorbansi 0,1 yang ekuivalen dengan jumlah kuman

108 CFU/ml. V adalah suspensi dengan kepadatan 108 CFU/ml

sebanyak 10 ml dibutuhkan 2 ml suspensi awal untuk dicampur

dengan 8 ml SS broth sebagai pengencer.

45

Setelah didapatkan perbenihan cair dengan jumlah kuman

108 CFU/ml, dilakukan pengenceran dengan SS broth sampai

didapatkan perbenihan cair dengan jumlah kuman 106 CFU/ml.

4.7.5 Uji efektifitas kepekaan larutan ekstrak kulit nanas terhadap

Salmonella typhi

Metode yang digunakan untuk tes ini adalah metode difusi

sumuran. Pada penelitian ini diperlukan kadar beberapa macam

konsentrasi ekstrak kulit nanas untuk di letakkan pada lubang-

lubang yang telah dibentuk. Proses selanjutnya ialah mengeramkan

selama 24 jam pada suhu 37°C.

Dengan cara sebagai berikut:

Hari ke-1 KBM:

a. Sediakan 10 tabung reaksi steril; tabung 1, tabung 2, tabung 3,

tabung 4, tabung 5, tabung 6, tabung 7, tabung 8, tabung 9,

tabung10. Masing-masing di beri perlakuan konsentrasi ekstrak

kulit nanas 8 konsentrasi dan 2 tabung kontrol.

b. Masukkan 1 ml SS broth pada tabung 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 dan 2 ml

ekstrak kulit nanas pada tabung 1 serta 2 ml bakteri pada

tabung 10.

46

Masukkan masing-masing 1 ml ekstrak kulit nanas ke dalam tabung

2 dan 3

Konsentrasi ekstrak kulit nanas

Tabung 2 1 ml (100%)

Tabung 3 2 ml (50%)

Campurlah hingga rata larutan Nutrient broth dan ekstrak kulit

nanas pada tabung 3, kemudian pindahkan sebanyak 1 ml ke dalam

tabung.

47

Konsentrasi ekstrak kulit nanas

Tabung 3 1 ml (50%)

Tabung 4 2 ml (25%)

c. Lakukan hal yang sama terhadap tabung 4, 5, 6, 7, 8, dan 9

d. Pada tabung 9, setelah tercampur rata, larutan dibuang

sebanyak 1 ml

e. Dari pengenceran diatas, maka konsentrasi awal antimikroba

dari masing-masing tabung adalah

f. Setelah itu tabung 2 sampai 9 ditambahkan perbenihan cair

bakteri 1 ml

48

g. Dengan demikian, volume masing-masing tabung menjadi 2 ml

sehingga konsentrasi akhir antimikroba berubah seperti berikut.

Kemudian diinkubasi pada suhu 37˚C selama 18-24 jam

Hari ke-1 KHM

a. Buat perbenihan cair 108 sel/ml

b. Ambil 2cc dan diletakkan dimasing-masing petridisk

sebanyak 1 cc

c. Campur dengan SSA sebanyak 20 cc pada tiap petridisk,

kemudian campur

d. Diamkan hingga mengeras

e. Lubangi menjadi 5 bagian pada tiap petri disk

f. Kemudian tiap lubang diberi ekstrak kulit nanas dengan

konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%,

1,56%, 0,78% dan 0,39%

Hari ke-2:

Pada hari ke-2 tabung dikeluarkan dari inkubator.

Kemudian digunakan untuk membuat KBM. Dan SSA di keluarkan

juga dari inkubator , kemudian dihitung zona hambatnya untuk

mengetahui KHM nya.

49

Hari ke-3:

SSA dikeluarkan dari inkubator kemudian dilakukan pengamatan

kuantitatif pada masing-masing konsentrasi dengan caramenghitung

jumlah koloni bakteri dengan colony counter sehingga didapatkan

data KBM.

4.8 Skema Alur Penelitian

Penentuan KHM

5

Penggoresan pada SSA untuk mendapatkan original inoculum

Pembuatan ekstrak kulit nanas (Ananas comosus)

Identifikasi Salmonella typhi

Pewarnaan Gram, Katalase Test

Penanaman Salmonella

typhipada media SS broth

Uji antimikroba dengan metode difusi sumuran

Inkubasi selama 18-24 jam dengansuhu 37ºC

Amati zona hambat untuk menentukan KHM

Pembuatan perbenihan cair 108 sel/ml

Analis Data

50

Penentuan KBM

Penggoresan pada NAP untuk mendapatkan original inoculum

Pembuatan ekstrak kulit nanas (Ananas comosus)

Identifikasi Salmonella typhi

Pewarnaan Gram, Katalase Test

Penanaman Salmonella

typhipada media SS broth

Pembuatan perbenihan cair 108 sel/ml

Tube dilution test, diinkubasi 18-24 jam dengan

suhu 37oC

Inkubasi selama 18-24 jam dengan suhu 37ºC

Hitung jumlah koloni yang tumbuh untuk menentukan KBM

Striking di SSA

Diencerkan sampai 106 sel/ml

Analis Data

51

4.9 Analisis Data

Analisis data KHM dimulai dengan uji parametrik, yaitu uji

normalitas menggunakan uji Saphiro-wilkkarena jumlah sampel

yangdigunakan kurang dari 50 . Jika data hasil data atu transformasi tidak

terdistribusi normal atau ragam data tetap tidak sama, maka dipilih uji

nonparametrik yaitu Kruskal-Wallis sebagai alternatifnya dan dilanjutkan

dengan uji Post HocMann-Whitney untuk menentukan pada konsentrasi

mana yang memiliki hasil kebermaknaan.

Analisis data KBM dimulai dengan uji parametrik, yaitu uji

normalitas menggunakan uji Shapiro-wilk karena jumlah sampel yang

digunakan kurang dari 50 dan uji homogenitas menggunakan uji Levene.

Karena data terdistribusi normal dan varian data sama, maka dilanjutkan

dengan uji one way ANOVA. Uji ini digunakan untuk membuktikan

adanya perbedaan yang bermakna antara kelompok perlakuan. Untuk

mengetahui konsentrasi minimal yang memberikan perbedaan yang

bermakna antara masing-masing kelompok dilakukan uji Post-Hoc

Bonferroni apabila sampel homogen dan dilanjutkan dengan regresi linier

untuk mengetahui prosentasi yang memberikan efek maksimal.