bab iv hasil dan pembahasan - repository.unair.ac.idrepository.unair.ac.id/25635/16/16. bab...

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian tentang skrining dan uji aktivitas enzim protease bakteri hasil

isolasi dari limbah Rumah Pemotongan Hewan (RPH) Pacar Keling Surabaya

menghasilkan data-data sebagai berikut :

1. Isolat bakteri penghasil enzim protease yang berasal dari limbah rumah

pemotongan hewan Pacar Keling, Surabaya

2. Kemampuan aktivitas kualitatif proteolitik isolat bakteri penghasil enzim

protease

3. Kurva pertumbuhan bakteri selama 3 hari dari isolat yang terpilih, dengan

waktu pengamatan setiap 4 jam

4. Nilai aktivitas proteolitik dari isolat bakteri yang terpilih, selama 3 hari

dengan waktu pengamatan setiap 4 jam

Uraian tentang hasil data-data penelitian tersebut disajikan dan dibahas

berturut-turut sebagai berikut.

4.1 Isolasi dan Karakterisasi Isolat Bakteri Penghasil Enzim Protease

Bakteri di isolasi dari limbah cair rumah pemotongan hewan Pacar Keling

Surabaya. Dilakukan pengujian dengan metode pour plate (sebar) pada media

Nutrien Agar plate. Kemudian dilakukan pengujian karakter secara makroskopis.

Dari uji karakteristik secara makroskopis, didapatkan 12 isolat mikroba (5 bakteri,

7 yeast) dengan karakteristik koloni yang berbeda. Karakter makroskopis dapat

diketahui dari bentuk koloni, warna koloni, tepi dan elevasi dari koloni. Dari 12

ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga

Skripsi Skrining dan Uji Aktivitas Enzim Protease Bakteri dari Limbah Rumah Pemotongan Hewan Putri, Yunita S.

isolat yang didapat, dilakukan pengujian aktivitas proteolitik secara kualitatif

dengan menumbuhkan satu loopfull isolat pada permukaan media selektif susu

skim agar. Karakter makroskopis dari 12 isolat tersebut disajikan pada Tabel 4.1

di bawah ini.

Tabel 4.1 Karakter makroskopis dua belas isolat bakteri proteolitik dari limbah rumah pemotongan hewan Pacar Keling Surabaya

No Kode

Isolat

Karakter Makroskopis

Bentuk

Koloni Warna Koloni Tepi Elevasi

1 RPH 1.1 Bulat Putih kusam Rata Cembung

2 RPH 2.1 Bulat Putih kusam Tidak rata Cembung




6 RPH 1.2 Bulat

Pink

keoranyean Rata Rata

7 RPH 1.3 Bulat kecil Putih susu Rata Cembung

8 RPH 2.2 Bulat Putih susu Rata Rata

9 RPH 2.6 Bulat

Orange

kemerahan Rata Rata

10 RPH 2.7 Bulat Putih Rata -

11 RPH 2.8 Bulat Putih Tidak rata -

12 RPH 2.9 Bulat Putih Rata Rata

Dari ciri-ciri karakter makroskopis tersebut, hanya lima isolat yang

diambil untuk dilakukan pengujian aktivitas proteolitik. Hal ini disebabkan tujuh

isolat yang lain diduga kelompok yeast, sementara penelitian ini difokuskan untuk



mencari bakteri-bakteri yang berpotensi dalam menghasilkan enzim protease.

Setelah dipilih lima isolat bakteri, selanjutnya dilakukan pengamatan karakter

mikroskopis yaitu dengan pewarnaan gram dan pengamatan bentuk sel. Karakter

mikroskopis dari kelima isolat tersebut dapat dilihat pada Tabel 4.2 dan diperjelas

pada Gambar 4.1.

Tabel 4.2 Karakter mikroskopis lima isolat bakteri proteolitik dari limbah rumah pemotongan hewan Pacar Keling Surabaya

No Kode Isolat Bentuk Gram

1 RPH 1.1 Kokus Negatif


3 RPH 2.3 Basil berantai Positif

4 RPH 2.4 Kokus Positif




Gambar 4.1 Karakter mikroskopis lima isolat bakteri proteolitik hasil isolasi dari

limbah rumah pemotongan hewan Pacar Keling Surabaya dengan menggunakan pewarnaan Gram pada perbesaran 1000x (Keterangan gambar : A. Isolat RPH 1.1; B. Isolat RPH 2.1; C. Isolat RPH 2.3; D. Isolat RPH 2.4; E. Isolat RPH 2.5)

4.2 Uji Karakteristik Isolat Bakteri Penghasil Protease

4.2.1 Uji kualitatif aktivitas proteolitik isolat bakteri penghasil protease

Media yang digunakan untuk uji secara kualitatif pada penelitian ini

adalah susu skim yang disuspensikan dalam medium. Isolat bakteri dari agar



miring diambil satu loopfull dan ditotolkan pada media susu skim agar plate.

Setelah inokulasi dan inkubasi kultur plate agar, bakteri mensekresikan protease.

Hal ini diperlihatkan dengan adanya daerah bening di sekeliling pertumbuhan

bakteri.

Susu skim mengandung kasein yang berfungsi sebagai substrat enzim.

Kasein merupakan protein susu yang terdiri dari fosfoprotein yang berikatan

dengan kalsium membentuk garam kalsium yang disebut kalsium kalseinat

(Pakpahan, 2009). Hidrolisis kasein digunakan untuk memperlihatkan aktivitas

hidrolitik protease. Protease mengkatalisis degradasi kasein yaitu dengan

memutuskan ikatan peptida CO-NH dengan masuknya air ke dalam molekul.

Reaksi tersebut melepaskan asam amino.

Dari lima isolat yang diuji secara kualitatif, didapatkan bahwa semua isolat

menunjukkan adanya aktivitas proteolitik. Aktivitas proteolitik suatu bakteri dapat

ditunjukkan dari indeks hidrolisis, dimana dapat dihitung dengan cara

membandingkan diameter lingkaran jernih dengan diameter koloni. Dari

pengujian tersebut, dipilih satu isolat bakteri yang menunjukkan indeks hidrolisis

tertinggi. Hasil uji indeks hidrolisis terhadap lima isolat uji dapat dilihat pada

Tabel 4.3 serta hasil indeks hidrolisis terbesar dapat dilihat pada Gambar 4.2.

Tabel 4.3 Hasil uji indeks hidrolisis pada lima isolat bakteri.

Kode Isolat Indeks Hidrolisis

RPH 1.1 0,23 ± 0,025

RPH 2.1 0,98 ± 0,025

RPH 2.3 1,77 ± 0,025



RPH 2.4 1,14 ± 0,025

RPH 2.5 1,55 ± 0,025

a

b

c

Gambar 4.2 Zona jernih sebagai indikator adanya aktivitas hidrolisis dari isolat terpilih RPH 2.3 (Keterangan gambar : a. Koloni bakteri, b. zona hidrolisis, c. media skim milk agar)

Zona jernih yang terbentuk ini dikarenakan bakteri mensekresikan enzim

protease yang digunakan untuk menghidrolisis kasein menjadi asam amino.

Menurut Lehninger (2005), aktivitas suatu enzim dipengaruhi oleh beberapa

faktor, yaitu pH, konsentrasi substrat dan enzim, suhu dan adanya aktivator atau

inhibitor.

Adanya perbedaan diameter zona jernih ini disebabkan perbedaan

kemampuan tiap mikroba dalam memproduksi enzim protease, sehingga aktivitas

yang dihasilkan juga berbeda. Untuk itu, kandungan protease dalam bakteri

tersebut perlu ditentukan secara kuantitatif (Susanti, 2003).



Untuk memperoleh hasil kandungan protease bakteri secara kuantitatif,

dilakukan produksi enzim protease terlebih dahulu dan diiringi dengan pembuatan

kurva pertumbuhan bakteri terpilih.

4.2.2 Uji karakteristik mikroskopis dan fisiologis isolat bakteri penghasil protease

Dari data di atas, isolat bakteri terpilih yang memiliki indeks hidrolisis

terbesar adalah isolat berkode RPH 2.3 yaitu sebesar 1,77 mm. Dari hasil

pengamatan mikroskopis pewarnaan Gram, beberapa hasil uji fisiologis

menggunakan kit Microbact 12A dan 12B, pewarnaan endospora, dan uji amilase,

dengan menggunakan perhitungan persentase indeks kesamaan menggunakan

koefisien sebanding (Barrow, et al.,1993) menunjukkan bahwa isolat RPH 2.3

memiliki persentase indeks kesamaan sebesar 71% terhadap genus Bacillus gram

positif, berbentuk basil berantai, membentuk endospora, dan bersifat katalase

positif. Hasil pewarnaan gram dan pewarnaan endospora isolat RPH 2.3 dapat

dilihat pada Gambar 4.3 dan 4.4, serta hasil uji fisiologis menggunakan kit

Microbact 12A dan 12B dapat dilihat pada lampiran.



Gambar 4.3 Hasil pewarnaan gram isolat RPH 2.3 dan diamati dengan perbesaran 1000x

Gambar 4.4 Hasil pewarnaan endospora isolat RPH 2.3 dan diamati dengan

perbesaran 1000x

Sel bakteri

Endospora



4.3 Kurva Pertumbuhan Bakteri dan Produksi Enzim Protease dari Bakteri Terpilih

Istilah pertumbuhan yang umum digunakan untuk bakteri dan

mikroorganisme lain, yang biasanya mengacu pada perubahan di dalam hasil

panen sel (pertambahan total sel) dan bukan perubahan individu organisme.

Bakteri memiliki ciri khas bereproduksi yaitu dengan pembelahan biner

melintang, di mana satu sel bakteri membelah diri, dan menghasilkan dua sel.

Selang waktu yang dibutuhkan bagi sel untuk membelah diri atau untuk populasi

menjadi dua kali lipat dikenal sebagai waktu generasi. Tidak semua spesies

bakteri mempunyai waktu generasi yang sama. Waktu generasi untuk suatu

spesies bakteri tertentu juga tidak sama pada segala kondisi. Waktu generasi

sangat bergantung pada kecukupan nutrien di dalam medium, serta pada

kesesuaian kondisi fisik (Pelczar dan Chan, 2005).

Pada penelitian ini, pembuatan kurva pertumbuhan bakteri dan pengukuran

produksi enzim dari bakteri terpilih dilakukan menurut metode Enggel et al.

(2004), pada selang waktu inkubasi 4 jam sekali selama 3 hari. Kekeruhan

medium pada selang waktu tertentu mengindikasikan bahwa bakteri

memperbanyak sel dalam medium. Kekeruhan terjadi karena sel bakteri tumbuh,

berkembang, memperbanyak diri dan mensekresikan enzim ke medium kultur

(Susanti, 2003).

Starter berupa kultur bakteri dalam media Nutrien Broth dengan Optical

Density 0,5 pada panjang gelombang 660 nm, sebanyak 1% kultur bakteri

dimasukkan ke dalam medium produksi protease. Kemudian dilakukan



penghitungan jumlah sel untuk pembuatan kurva pertumbuhan bakteri dengan

metode Total Plate Count selama inkubasi 3 hari, dan diiringi dengan produksi

enzim protease.

Hasil perhitungan dengan cara hitungan cawan yang menggunakan Total

Plate Count (TPC) diperoleh grafik yang menghubungkan antara waktu inkubasi

dan jumlah sel yang dapat dilihat pada Gambar 4.5.

Gambar 4.5. Kurva pertumbuhan Bacillus sp. RPH 2.3 yang ditumbuhkan pada media skim milk selama 72 jam

Dari data di atas jika dihubungkan garis lurus pada waktu inkubasi 4 jam

hingga 32 jam bakteri mengalami fase log. Fase log yaitu fase dimana setelah

mikroba menyesuaikan diri dengan lingkungan, maka sel mikroba membelah

dengan cepat. Pada fase ini kecepatan pertumbuhan sangat dipengaruhi oleh

medium tempat tumbuhnya, seperti pH, kandungan nutrien, suhu dan kelembaban



udara. Pada fase ini sel membutuhkan energi lebih banyak dibandingkan dengan

fase lainnya, selain itu sel paling sensitif terhadap keadaan lingkungan.

Pada waktu inkubasi setelah 32 jam, bakteri mengalami fase eksponensial

diperlambat. Pada fase ini pertumbuhan bakteri diperlambat, karena beberapa

sebab, diantaranya berkurangnya nutrisi di dalam medium, dan adanya zat hasil

metabolisme yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri. Pada fase ini

kecepatan pertumbuhan sel konstan, tetapi jumlah populasi masih naik. Hal ini

karena jumlah sel yang tumbuh lebih banyak daripada jumlah sel yang mati.

Pada waktu inkubasi setelah 68 jam, bakteri mengalami fase stasioner.

Pada fase ini jumlah populasi sel relatif tetap karena jumlah sel yang tumbuh sama

dengan jumlah sel yang mati. Pada fase stasioner ini sel kehabisan nutrien untuk

tumbuh dan membelah sehingga jumlah pertumbuhan sel cenderung mendatar

atau terjadi akumulasi produk toksik akibat metabolisme sehingga mengganggu

pembelahan sel.

Faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan mikroba adalah

tersedianya nutrien, air, suhu, pH, oksigen, potensial oksidasi reduksi, adanya zat-

zat penghambat, dan adanya jasad renik lain. Mikroba membutuhkan nutrien

untuk kehidupan dan pertumbuhannya sebagai sumber karbon, sumber nitrogen,

sumber energi dan faktor pertumbuhan lain seperti vitamin dan mineral. Nutrien

tersebut dibutuhkan untuk membentuk energi dan menyusun komponen-

komponen sel (Waluyo, 2004).

Nutrien yang dibutuhkan bakteri pada penelitian ini tersedia dari media

pertumbuhannya, yaitu susu skim yang di kombinasi dengan media Bushnell



Hass. Susu merupakan media yang sesuai untuk pertumbuhan mikroba karena

kaya akan nutrien. Komposisi susu yaitu air, lemak, protein, laktosa, mineral,

vitamin dan enzim. Sedangkan susu skim merupakan susu dengan kadar lemak

yang rendah. Jadi susu skim masih memiliki semua bahan yang dibutuhkan

mikroba untuk kehidupan dan pertumbuhannya.

Setelah membuat kurva pertumbuhan bakteri, dilanjutkan dengan

pengujian aktivitas proteolitik secara kuantitatif. Hal ini bertujuan untuk

mengetahui aktivitas proteolitik berdasarkan jumlah asam amino yang dihasilkan

dari hidrolisis kasein.

4.4 Uji kuantitatif aktivitas proteolitik dari isolat bakteri terpilih

Protease adalah enzim yang mengkatalisis pemecahan ikatan peptida

dalam peptida, polipeptida, dan protein menjadi molekul-molekul yang lebih

sederhana seperti peptida rantai pendek dan asam amino (Naiola dan Widyastuti,

2002). Proses pemecahan ikatan peptida menjadi molekul-molekul yang lebih

sederhana oleh enzim protease disebut aktivitas proteolitik.

Aktivitas proteolitik ditentukan dengan metode Enggel, (2004). Pada

metode ini kasein digunakan sebagai substrat. Enzim protease yang disekresi oleh

sel bakteri akan menghidrolisis kasein untuk menghasilkan asam amino. Besarnya

aktivitas proteolitik ditentukan berdasarkan jumlah tirosin yang dihasilkan dari

hidrolisis kasein, dan dilakukan dengan mengukur serapan pada panjang

gelombang 660 nm.



Pada tahap pengukuran aktivitas proteolitik tersebut juga digunakan asam

trikhloroasetat (TCA) yang berfungsi untuk menghentikan reaksi enzimatis. Selain

itu juga digunakan natrium karbonat (Na2CO3) yang dapat mengikat air di dalam

larutan. Sebagai reagen pewarna digunakan Folin Ciocalteau yang akan bereaksi

dengan protein dan memberikan warna biru gelap. Intensitas warna yang

terbentuk tergantung pada jumlah asam amino aromatik yang ada di dalam larutan

tersebut.

Satu unit aktivitas proteolitik dinyatakan sebagai jumlah enzim yang dapat

menghasilkan 1 µg tirosin setiap ml setiap menit dalam kondisi pengukuran. Hasil

pengujian aktivitas proteolitik dari isolat bakteri yang terpilih dengan waktu

inkubasi yang berbeda dapat dilihat pada Gambar 4.6.

Gambar 4.6. Uji aktivitas proteolitik Bacillus sp. RPH 2.3 yang ditumbuhkan

pada media skim milk selama 72 jam (Keterangan gambar : Aktivitas proteolitik (U/ml) poly.(Aktivitas proteolitik (U/ml)))



Dari hasil pengujian aktivitas proteolitik menunjukkan Bacillus sp. RPH

2.3 aktif menghasilkan protease selama pertumbuhannya. Pada grafik dapat dilihat

Bacillus sp. RPH 2.3 memiliki aktivitas proteolitik secara kuantitatif yang

tertinggi sebesar 11,60 U/ml dengan waktu inkubasi 20 jam pada suhu 37°C dan

pada pH 6,5.

Pada pH 6,5 ini merupakan pH optimum, karena pada kondisi pH ini

enzim dapat bekerja dengan aktivitas tertinggi yang dapat dilakukannya. Tetapi,

pada waktu inkubasi setelah 20 jam dengan pH 7, aktivitas proteolitik semakin

menurun. Hal ini disebabkan, pada pH tertentu enzim sama sekali tidak aktif atau

bahkan rusak yang mengakibatkan menurunnya aktivitas enzim. Menurut

Poedjiadi (1994), dapat diketahui bahwa enzim merupakan molekul protein yang

kestabilannya dapat dipengaruhi oleh tingkat keasaman lingkungan, dimana pada

kondisi keasaman yang ekstrim molekul-molekul protein enzim akan rusak.

Pada penelitian Akhdiya (2003), menggunakan bakteri pembanding yaitu

Bacillus firmus NRRL B-1107 yang diperoleh dari Northern Utilization Research

and Development Division of the US Departement of Agriculture, Peoria, Illinois.

Bakteri tersebut memiliki aktivitas protease sebesar 11,259 U/ml dengan suhu

inkubasi 37°C. Jika dibandingkan dengan penelitian yang sudah ada, Bacillus sp.

RPH 2.3 ini dengan suhu inkubasi 37°C memiliki aktivitas yang lebih besar

daripada Bacillus firmus NRRL B-1107 yang merupakan bakteri mesofil.

Menurut penelitian Naiola dan Widhyastuti (2002), menyatakan bahwa

Bacillus sp. yang diisolasi dari makanan fermentasi, tanah dan air sungai memiliki

aktivitas protease tertinggi sebesar 1,14 U/ml dengan kondisi pH optimum



berkisar antara 5,0-6,0. Dari penelitian tersebut dapat terlihat kecenderungan

media yang sesuai untuk produksi protease adalah media dengan kondisi pH

sedikit asam sampai netral.

Jika dihubungkan antara kurva pertumbuhan bakteri dengan uji aktivitas

proteolitik dapat dilihat bahwa pada fase pertumbuhan cepat bakteri menghasilkan

aktivitas proteolitik tinggi yang dicapai pada waktu inkubasi 20 jam. Hal ini

disebabkan masih tersedianya nutrisi dalam jumlah besar yang diperlukan sel

bakteri untuk melakukan metabolisme sel, sehingga jumlah log sel bakteri juga

mengalami peningkatan, yaitu sebesar 14,14 CFU/ml.

Pada waktu inkubasi setelah 20 jam, aktivitas enzim protease yang

dihasilkan mengalami penurunan. Jika dihubungkan dengan kurva pertumbuhan

bakteri, pada waktu inkubasi setelah 20 jam ini bakteri menuju fase eksponensial

diperlambat. Hal ini disebabkan karena beberapa faktor, seperti zat nutrisi di

dalam medium sudah mulai berkurang yang mengakibatkan jumlah sel

mikroorganisme sedikit, sehingga enzim yang disekresikan juga semakin

menurun. Selain itu, adanya hasil metabolisme yang mungkin beracun sehingga

dapat menghambat pertumbuhan bakteri.

Pada 68 jam bakteri menghasilkan aktivitas enzim yang semakin menurun.

Hal ini disebabkan karena pertumbuhan bakteri pada saat tersebut mengalami fase

stasioner dimana zat nutrisi di dalam medium sangat sedikit, sehingga aktivitas

yang dihasilkan juga semakin menurun. Hubungan antara kurva pertumbuhan

bakteri dengan uji aktivitas proteolitik pada waktu inkubasi 4 hingga 20 jam dan

24 hingga 72 jam dapat dilihat pada Gambar 4.7 dan 4.8.



Gambar 4.7. Hubungan antara kurva pertumbuhan dengan uji aktivitas proteolitik Bacillus sp. RPH 2.3 pada waktu inkubasi 4 jam hingga 20 jam

Gambar 4.8. Hubungan antara kurva pertumbuhan dengan uji aktivitas proteolitik Bacillus sp. RPH 2.3 pada waktu inkubasi 24 jam hingga 72 jam



Dari grafik 4.7 dapat dilihat bahwa aktivitas proteolitik pada waktu

inkubasi 4 hingga 20 jam semakin meningkat serta diiringi dengan meningkatnya

kurva pertumbuhan bakteri. Telah dijelaskan sebelumnya, pada waktu inkubasi

hingga 20 jam bakteri mengalami fase log. Dimana pada fase ini bakteri

membutuhkan nutrisi yang banyak untuk pertumbuhan dan pembelahan sel. Pada

penelitian ini nutrisi atau substrat yang digunakan adalah kasein, dimana dapat

dihubungkan dengan salah satu ciri enzim yaitu kekhususan yang tinggi terhadap

substrat. Mekanisme reaksi enzimnya adalah enzim dan substrat akan bergabung

menjadi kompleks enzim substrat, yang kemudian terurai menjadi produk. Enzim

tersebut tidak terkonsumsi di dalam reaksinya tetapi dilepaskan kembali untuk

reaksi selanjutnya. Proses ini diulang-ulang sampai semua molekul substansi yang

tersedia habis terpakai.

Banyak bakteri dapat menghancurkan protein di luar tubuhnya dan

menggunakan produk-produk hasil proses tersebut sebagai sumber tenaga karbon

dan nitrogen. Karena molekul protein terlampau besar untuk dapat melewati

membran, bakteri mensekresikan protease yang menghidrolisis protein tersebut

menjadi peptide-peptide. Bakteri menghasilkan peptidase yang menguraikan

peptide menjadi asam-asam amino yang diperlukan untuk metabolisme (Pelczar

dan Chan, 2005).

Sedangkan pada grafik 4.8 dapat dilihat bahwa pada waktu inkubasi

setelah 20 jam aktivitas proteolitik cenderung menurun tetapi kurva pertumbuhan

bakteri masih meningkat. Hal ini dikarenakan adanya pengendalian aktivitas

enzim yang diatur oleh ligan (molekul yang dapat terikat oleh enzim) yang tidak



turut berperan dalam proses katalitik itu sendiri. Pengendalian aktivitas enzim

yang dimaksud adalah hambatan arus-balik (feedback inhibition). Pada hambatan

arus-balik, ligan pengaturnya adalah produk akhir suatu lintasan metabolik yang

dapat menghentikan sintesisnya sendiri dengan cara menghambat aktivitas enzim.

Produk akhir dari reaksi enzim disini adalah asam amino, dimana asam amino

akan menghambat aktivitas protease jika asam amino yang dihasilkan menumpuk.

Sehingga mengakibatkan aktivitas enzim protease yang dihasilkan menurun

(Pelczar dan Chan, 2005).

Penurunan aktivitas proteolitik ini juga dapat terjadi karena berkurangnya

jumlah substrat yang akan menghambat pembentukan kompleks enzim substrat

dan perubahan struktur enzim yang akan menyebabkan penurunan laju katalitik.

Akibat perubahan struktur enzim, sisi aktif enzim mengalami perubahan bentuk

sehingga tidak dapat digunakan secara baik dalam mengikat substrat (Pakpahan,

2009).

4.5 Menentukan Titik Maksimum Grafik Uji Aktivitas proteolitik

Dari grafik uji aktivitas enzim protease, didapatkan fungsi y = -0,025x2 +

1,060x + 0,826 dan R2 = 0,920. Dari fungsi tersebut, didapatkan titik maksimum

dengan x = 21,2 dan y = 12,062. Dari hasil yang diperoleh, dapat dijelaskan

bahwa titik maksimum dari grafik tersebut ada diantara 20 jam dan 24 jam. Pada

titik maksimum tersebut, merupakan fase log pertumbuhan dengan aktivitas enzim

yang tinggi. Hasil perhitungan dengan menggunakan program Mathematica 5

dapat dilihat pada lampiran 12.



bab iv hasil dan pembahasan - repository.unair.ac.idrepository.unair.ac.id/25635/16/16. bab...

Documents