bab iv acc 22072013 (revisi 5)

34

BAB IV

METODE PENELITIAN

4.1 Jenis Penelitian

Penelitian dilaksanakan secara eksperimental laboratorium menggunakan

desain penelitian control group post test only.

4.2 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan dengan rincian tempat dan waktu penelitian

sebagai berikut :

Tabel 4.1: Tempat, tahapan dan waktu penelitian

Waktu Tahapan Tempat

15-21Mei 2013 - Aklimatisasi tikus Lab. Malang Murin Farm Singosari

20-24 Mei 2013 - Pengenceran metanil yellow- Pengenceran minyak atsiri

Lab. Biokimia FK UNISMA

22-26 Mei 2013 - Induksi metanil yellow dan pemberian minyak atsiri daun nilam

Lab. Malang Murin Farm Singosari

6-7 juni 2013 - Pembedahan hewan coba - Pengambilan hepar tikus

Lab. Malang Murin Farm Sigosari

13-14 juni 2013- Pemeriksaan kadar IL-1 beta Lab faal FK

Univ.Brawijaya

4.3 Sampel Penelitian

Untuk sampel penelitian digunakan rumus Faderer yaitu non probability

sampling sebagai berikut (Federe,1963 sastrosupadi, 1997)

n = jumlah kelompok

p = jumlah populasi tikus dalam satu kelompok

(n-1) (p-1) ≤ 15

35

Tabel 4.2: Sampel Penelitian

Penelitian Σ kelompok Σ populasi tiap kelompok

Σ populasi tiap kelompok yang digunakan

Total populasi

Tahap

eksplorasi

dosis

5 5(n – 1) ≤ 15

5n ≤ 19

n ≤ 4,75

(4,75 dibulatkan 5),

jadi n ≤ 5

5 25

4.4 Bahan dan Alat Penelitian

4.4.1 Hewan Coba

Hewan yang di gunakan pada penelitian ini adalah tikus wistar yang dibeli

di laboratorium Murin Farm Malang, yang sudah dipilih sesuai kriteria inklusi dan

kriteria ekslusi sebagai berikut

Tabel 4.3 : Kriteria inklusi dan eksklusi

Kriteria inklusi Kriteria eksklusi

a. Jenis kelamin jantan

b. Umur tikus antara 2-3 bulan

c. Keadaan tikus sehat atau normal,

ditandai dengan berbulu halus, mata

berwarna merah jernih, gerakan-

gerakan tikus seperti makan, minum,

tidak terdapat luka atau cacat tubuh.

d. Berat badan tikus 150-200 gram

a. Tikus sakit

b. Tikus mati

36

4.4.2 Alat dan Bahan Untuk Pemeliharaan Hewan Coba

Tabel 4.4: Alat dan Bahan Pemeliharaan Tikus

Alat dan bahan pemeliharaan tikus

Keterangan

Kandang tikus Penelitian ini terdiri dari 5 kelompok perlakuan dengan 5 kali

pengulangan sehingga diperlukan 5 kandang tikus.

Makanan tikus Meliputi komposisi BR (makanan standar untuk tikus yang

mengandung protein) dan polar (makanan standar untuk tikus

yang mengandung karbohidrat) pada perbandingan 1:2.

Diberikan dengan cara pakan tersebut dicampur dengan air

hangat secukupnya kemudian dibentuk bulat-bulat dan

diletakkan di dalam kandang.. Berat pakan yang diberikan per

tikus 50 gram/hari, Makanan diberikan pada saat sore dan

diganti ketika pagi.

Botol air Air minum yang digunakan adalah air ledeng yang diisi setiap 2

kali sehari

Sekam Penggantian Sekam sebagai alas tempat tikus setiap 2 hari

sekali

4.4.3 Alat dan Bahan Untuk Pengenceran Metanil Yellow

Tabel 4.5: Alat dan Bahan Pengenceran Metanil Yellow

Alat Keterangan

1. Timbangan Digital Pro OHAUS Digunakan untuk penimbangan metanil yellow

2. Tabung Erlenmeyer 1 buah Digunakan untuk menyimpan larutan Aquades dan

Metanil Yellow

3. Tabung Reaksi 1 buah Digunakan untuk mencampur Metanil Yellow dan

lauran aquades

4. Kertas Aluminium foil Digunakan sebagai pembungkus tabung

erlenmenyer selama penyimpanan

Bahan Keterangan

1. Metanil Yellow Bahan yang diinduksikan kepada tikus kelompok

kontrol positif dan semua kelompok perlakuan.

Berbentuk bubuk yang berwarna kuning

2. Aquades Larutan yang digunakan untuk mengencerkan

bubuk Metanil Yellow

37

4.4.4 Alat dan Bahan untuk Pengenceran Minyak Atsiri Daun Nilam

Tabel 4.6: Alat dan Bahan Pengenceram Minyak Atsiri Daun Nilam

Alat Keterangan

1. Tabung Erlenmeyer 3 buah Digunakan untuk menyimpan larutan Aquades dan

Minyak Nilam, masing-masing untuk dosis 3%,

6% dan 12%

2. Tabung Reaksi 3 buah Digunakan untuk mencampur Minyak Nilam dan

larutan CMC 5%

3. Pipet tetes 2 buah 1 buah untuk mengambil larutan minyak nilam, 1

buah untuk mengambil larutan CMC

4. Aluminium Foil Digunakan sebagai pembungkus tabung

erlenmenyer selama penyimpanan

5. Handscone Digunakan untuk menghindari kontak langsung

tangan dengan alat dan bahan yang digunakan

6. Gelas Ukur 2 buah 1 buah digunakan untuk mengukur volume minyak

nilam yang dibutuhkan, 1 buah untuk mengukur

volume larutan CMC yang dibutuhkan

Bahan Keterangan

I. Minyak atsiri daun nilam

(Pogostemon cablin Benth)

Bahan yang disondekan kepada tikus pada semua

kelompok perlakuan

II. Larutan CMC 0,5% Larutan standar yang digunakan untuk

mengencerkan minyak atsiri daun nilam.

4.4.5 Alat dan Bahan Untuk Induksi Metanil Yellow

Tabel 4.7: Alat dan Bahan Pemberian Metanil Yellow

Alat Keterangan

1. Spuit 3cc 25 buah Digunakan untuk injeksi intra peritoneal Metanil

Yellow, setiap pengulangan masing-masing 1 buah

untuk 25 ekor tikus

2. Kapas Alkohol Untuk desinfeksi pada daerah injeksi

3. Membran filter Untuk menyaring larutan Metanil Yellow sebelum

diinjeksikan

Bahan Keterangan

I. Larutan Metanil Yellow Larutan Metanil Yellow yang dihasilkan dari

proses pengenceran dengan aquades

38

4.4.6 Alat dan Bahan untuk Pemberian Minyak Atsiri Daun Nilam


Tabel 4.7: Alat dan Bahan Pemberian Minyak Atsiri

Alat dan Bahan

Keterangan

Sonde oral dan spuit Alat ini digunakan untuk memberikan Minyak Atsiri Daun

Nilam (Pogostemon cablin Benth) peroral kepada tikus.

Minyak Atsiri Daun Nilam


Pengenceran Minyak Atsiri dilakukan di Laboratorium

Biokimia FK UNISMA dengan konsentrasi 3%, 6%, dan 12%

Handscoon -

4.4.7 Alat dan Bahan Untuk Eliminasi Hewan Coba

Tabel 4.8: Alat dan Bahan Eliminasi Hewan Coba

Alat Keterangan

1. Spuit 1 cc Untuk menginjeksikan ketamin

2. Heating set Untuk membedah tikus

3. Papan tempat pembedahan tikus

4. Paku payung untuk fiksasi tikus

5. Tabung tempat penyimpanan darah

6. Tempat sampah 2 buah Masing-masing untuk sampah medis dan

sampah non medis

7. Handscoon Digunakan untuk menghindari kontak

langsung tangan dengan alat dan bahan

yang digunakan

Bahan Keterangan

I. Ketamin Bahan yang digunakan untuk pembiusan

hewan coba dengan dosis 5mg/KgBB intra

muskular

39

4.4.8 Alat dan Bahan Untuk Pemeriksaan IL-1 Beta

Tabel 4.9: Alat dan Bahan Pemeriksaan IL-1 beta

ALAT BAHAN

1. Microtiter Maxi Binding2. Multi channel pipet3. Mikropipet4. Blue tip5. Yellow tip6. Vortek7. Tube8. Sentrifuge9. ELISA reader (spektrofotometer) untuk

pengukuran kuantitatif10. Awareness11. Coating Buffer12. PbS13. PbS Tween14. Antibodi primer (human anti IL- 1β)15. Antibodi sekunder (IgG Biotin)16. TMB17. HCL 1N

1. Jaringan Hepar 5 mg

4.5 Prosedur Penelitian

4.5.1 Pengelompokan Hewan Coba

Sampel dibagi menjadi 5 kelompok, setiap kelompok terdiri dari 5 ekor

tikus.

Tabel 4.10: Kelompok Kontrol dan Perlakuan

Kontrol 1. Kelompok 1Kontrol negatif K0Ʃsampel = 4 ekor

- Induksi aquades /intra peritoneal @1ml

- Aquades @2ml personde lambung

2. Kelompok 2Kontrol positif K1Ʃsampel = 4 ekor

- Induksi Metanil yellow 80 mg/KgBB /intra peritoneal @1 ml

- Aquades @2ml personde Perlakuan 3. Kelompok 3

Ʃsampel = 4 ekor- Induksi Metanil yellow 80

mg/KgBB /intra peritoneal @1ml- Minyak Nilam 3% = @2ml personde

4. Kelompok 4 Ʃsampel = 4 ekor

- Induksi Metanil yellow 80 mg/KgBB /intra peritoneal @1ml

- Minyak Nilam 6% = @2ml personde5. Kelompok 5

Ʃsampel = 4 ekor- Induksi Metanil yellow80

mg/KgBB /intra peritoneal @1ml- Minyak Nilam 12% = @2ml personde

40

4.5.2 Pemeliharaan dan Adaptasi Hewan Coba

Adaptasi hewan coba dilakukan selama tujuah hari sebelum perlakuan.

Selama tujuh hari ini tikus diberi makan dan minum sesuai standar laboratorium

dan dilakukan penimbangan berat badan setiap hari. Selama perlakuan tikus juga

dipelihara dan diberi makan dan minum standar laboratorium. Kandang tikus

dibersihkan dua kali dalam seminggu. Tikus dipelihara dalam ruangan yang

berventilsi cukup, dikandangkan secara individual. Suhu ruangan berkisar 28 – 32

derajat Celcius, dengan kelembaban 56 ± 5%. Tikus diberi makan dan minum

sesuai standar laboratorium, dengan komposisi BR (makanan tikus yang

mengandung protein) dan Polar (makanan tikus yang mengandung karbohidrat)

dengan perbandingan 1:2.Setiap tiga hari dilakukan pembersihan kandang.. Untuk

mengantisipasi bila ada yang mati maka tiap-tiap kelompok perlakuan jumlah

sampel ditambah kurang lebih 10%.

4.5.3 Pengenceran Metanil Yellow

Dosis Metanil yellow 80mg/KgBB diambil dari penelitian Ramchandani,

dkk tahun 1997. Dosis 80mg/KgBB disesuaikan dengan berat badan tikus yaitu

150gram sehingga didapatkan dosis 12mg/150gBB. Cara penghitungan

pengenceran berdasarkan pada tabel berikut :

Tabel 4.11: Cara Pengenceran Metanil Yellow

Dosis ketentuan Dosis per 150 g Cara pengenceran80 mg/1000 g

N=150 x801000

N=12

300 mg Metanil Yellow ditambahkan 25 ml

larutan aquades = 300 mg25 ml

= 12 mg/ml

41

4.5.4 Pembuatan dan Pemberian Minyak Atsiri Daun Nilam

Proses pembuatan minyak atsiri dilakukan di Pabrik Minyak Nilam,

Kesamben Blitar menggunakan proses destilasi menghasilkan minyak atsiri

dengan konsentrasi 20% dalam 80 ml. Minyak atsiri kemudian diencerkan dengan

menggunakan larutan CMC(Carboxyl Methyl Cellulose) 5% menjadi sediaan

dengan konsentrasi 3 %,6%, dan 12%. Cara penghitungan dosis minyak atsiri

pada masing konsentrasi sebagai berikut.

Keterangan:V1= Volume sebelum pengenceranK1= konsentrasi sebelum pengenceran dalam persenV2= volume setelah pengenceranK2= konsentrasi setelah pengenceran dalam persen

Tabel 4.12: Perhitungan Dosis Pengenceran Minyak Atsiri

Dosis Cara PengenceranDosis 3%

V1.K1=V2.K2

5 mL x 20% = V2 x 3 V2 = 5 mL x 20 %

3% = 100 3 = 33 mL

Volume CMC 5% yang ditambahkan = 33 mL - 5 mL = 28 mLMinyak atsiri 5 ml dengan kadar 20% diencerkan dengan CMC 5% sebanyak 28 ml untuk menghasilkan kadar minyak atsiri 3%.

Dosis 6%

V1.K1=V2.K2

10 mL x 20% = V2 x 6 M V2 = 1 0 mL x 20 %

1% = 200 6 = 33 mL

Volume CMC 5% yang ditambahkan = 33 mL - 10 mL = 23 mLMinyak atsiri 10 ml dengan kadar 20% diencerkan dengan CMC 5% sebanyak 23 ml untuk menghasilkan kadar minyak atsiri 6%.

Dosis 12%

V1.K1=V2.K2

20 mL x 20 = V2 x 12 M V2 =20 mL x 20 %

12% = 400 12 = 33 mL

Volume CMC 5% yang ditambahkan = 33 mL - 20 mL = 13 mL

V1K1=V2K2

42

Minyak atsiri 20 ml dengan kadar 20% diencerkan dengan CMC 5% sebanyak 13 ml untuk menghasilkan kadar minyak atsiri 12%.

4.5.5 Perlakuan Hewan Coba

Perlakuan dilakukan pada 5 kelompok hewan coba. Proses perlakuan

dilakukan pada hari ke 8 sampai hari ke 12 antara jam 18.00-20.00 WIB. Selama

perlakuan sediaan Metanil Yellow dan minyak atsiri disimpan ditempat yang

gelap dengan suhu ruangan.

Kelompok kontrol negatif (K0) diberikan larutan aquades secara intra

peritoneal sebanyak 1 ml, 2 jam kemudian diikuti pemberian larutan aquades

sebanyak 2 ml personde.

Kelompok kontrol positif (K1) diberikan larutan Metanil Yellow secara

intra peritoneal sebanyak 1 ml, 2 jam kemudian diikuti pemberian larutan aquades

sebanyak 2 ml personde.

Kelompok Perlakuan 1 (K2) diberikan larutan Metanil Yellow secara intra

peritoneal sebanyak 1 ml, 2 jam kemudian diikuti pemberian larutan minyak

nilam 3% sebanyak 2 ml personde.







4.5.6 Eliminasi Hewan Coba dan Pengambilan Hepar

43

Tikus diambil berdasarkan urutan kelompok perlakuan. Tikus dibius

intra muskuler pada femur menggunakan ketamine dengan dosis 5

mg/kgBB.Tikus dibedah secara vertikal mengikuti linea mediana dinding

abdomen lalu hepar diambil dan diletakkan di tempat organ.

Tabel 4.12: Alat Dan Bahan Eliminasi Hewan Coba

Pembedahan Hewan Coba

Alat:1. Spuit2. Gunting3. Tempat organ4. Pinset5. Pengait jaringan6. Handschoon

Bahan:1. Hewan coba (Tikus jantan strain

Wistar)

4.5.7 Pemeriksaan Kadar IL-1β Hepar Tikus

Pemeriksaan kadar IL-1β Hepar tikus dilakukan di Laboratorium faal

Universitas Brawijaya.Metode yang digunakan dalam pengukuran kadar IL-1β

adalah metode ELISA Indirect. Langkah-langkah pengukuran tersebut sebagai

berikut

1. Isolasi Protein

Hepar ditimbang kira-kira 1 gram dicuci dengan Pbs, dihancurkan sampai halus ditambah cairan PMSF 1ml:100 mg

a) Di Vortex, di inkubasi 30 menit 40C

b) Di sntrifuge 2000Rpm 20 menit

2. Coating antigen

Supernatan 5 μl dilarutkan dalam coating buffer dengan perbandingan 1:20

hingga 200 μl/well

a) Diinkubasi pada suhu 40C semalam

b) Dicuci dalam PBS-Tween 0,2% sebanyak dua kali, @ 5 menit

44

3. Diblok dengan Blocking buffer (BSA 1% dalam PBS) 50 μl/well

a) Diinkubasi selama 45 menit suhu ruang

b) Dicuci dalam PBS-Tween sebanyak dua kali, @ 5 menit

4. Coating Ab primer 50μl/well IL - 1β 1:1500 dalam PBS

a) Diinkubasi selama 1 jam suhu ruang


5. Coating Ab sekunder 1:1000 dalam PBS dimana Ab sekunder yang digunakan

adalah IgG Biotin Anti Mouse



6. Ditambahkan substrat SA-HRP 1:1000



7. Ditambahkan substrat Sureblue TMB

Diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang

8. Ditambahkan HCl 1N sebagai stop reaction

Diinkubasi selama 15 menit pada suhu ruang

9. Dibaca dengan ELISA reader pada λ = 450 nm

4.6 Teknik Analisa Data

Pada akhir minggu perlakuan, dilakukan pengamatan kadar IL-1β hepar

tikus meliputi cek kelengkapan data dan entry data ke software SPSS versi 12.00.

Kemudian dilakukan cek distribusi, normalitas, dan homogenitas data dengan

menggunakan uji Kolmogorov-Smirnov 1 sample dan uji Saphiro wilk karena data

yang didapatkan berupa data numerikal. Setelah itu dilakukan uji statistik one-way

ANOVA yang dilanjutkan dengan uji LSD (Least Significant Difference) untuk

45

mengetahui perbandingan antar perlakuan dan siginifikansinya. Hasil dikatakan

bermakna bila p≤0,05.

4.7 Diagram Alur Penelitian II

Kontrol Negatif (K0)

- aquades /intra peritoneal @1ml

- Aquades @2ml personde lambung

(Selama 5 hari)

Eliminasi Hewan Coba

Kontrol Positif (K1)

- Induksi Metanil yellow 80 mg/KgBB /intra peritoneal @1 ml

- Aquades @2ml personde

(Selama 5 hari)

K2


- Minyak Nilam 3% @2ml personde

(Selama 5 hari)

K4

- Induksi Metanil yellow80 mg/KgBB /intra peritoneal @1ml

- Minyak Nilam 12% = @2ml personde

(Selama 5 hari)

K3


- Minyak Nilam 6% @2ml personde

(Selama 5 hari)

Pengambilan organ hepar

Analisis Data

Kelompok Kontrol Kelompok Perlakuan

Adaptasi 7 hari

Tikus, strain Wistar, jantan, usia 2-3 bulan sebanyak 20 ekor, berat 120-150

gram

Pemeriksaan kadar IL-1β secara ELISA

Kesimpulan

bab iv acc 22072013 (revisi 5)

Documents