12

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Bahan dan Alat

1. Bahan

a. Bahan Baku

Bahan baku yang digunakan yaitu kacang komak (Lablab purpureus (L.) Sweet) yang didapat dari petani di Probolinggo, Jawa Timur.

b. Tikus Percobaan Tikus percobaan yang digunakan merupakan tikus jantan jenis

spargue dawley umur 40 hari.

c. Bahan Makanan Tikus Bahan yang digunakan sebagai makanan tikus dalam penelitian

ini adalah pati jagung, kasein, sukrosa, minyak kedelai, CMC, mineral mix, vitamin mix, kolesterol, PTU (propiltiourasil), dan tepung tempe kacang komak.

d. Bahan Analisis Bahan-bahan untuk analisis proksimat antara lain K2SO4, HgO,

H2SO4 pekat, NaOH-Na2S2O3, H3BO3, indikator biru metilen, HCl, dan pelarut n-heksana. Bahan untuk analisis total kolesterol dan HDL yaitu reagen kit cholesterol FS dan HDL precipitant FS dengan metode CHOD-PAP. Bahan analisis trigliserida yaitu tryglyserides FS dengan metode GPO-PAP. Bahan-bahan untuk analisis malonaldehida yaitu larutan PBS, larutan TCA 15%, dan larutan TBA 0,37% dalam HCl 0,25 N.

2. Alat

a. Alat Pemeliharaan Tikus Alat yang digunakan untuk memelihara tikus dan membuat

makanan tikus adalah kandang metabolik, botol minum, timbangan, baskom plastik, varimixer, dan blender.

13

b. Alat Pembedah Tikus Alat yang digunakan dalam pembedahan tikus adalah gunting,

pinset, jarum suntik, papan pembedahan, dan alat-alat gelas. c. Alat Analisis

Alat yang digunakan untuk analisis proksimat antara lain oven, tanur, ekstraktor soxhlet, labu kjeldahl, alat-alat gelas, cawan aluminium, cawan porselen. Alat-alat yang digunakan untuk analisis kolesterol, trigliserida, HDL, LDL, dan malonaldehida meliputi spektrofotometer, sentrifuse, penangas air, tabung reaksi, tabung sentrifuse, pipet mikro, kuvet, dan kuvet mikro.

B. Metoda Penelitian Tahap pertama penelitian ini adalah persiapan sampel, yaitu tepung

tempe kacang komak. Tepung tempe dianalisis nilai gizinya yang terdiri dari kadar protein, lemak, karbohidrat, air, abu, dan serat kasar. Data tersebut digunakan untuk merancang komposisi ransum tikus. Setelah sampel disiapkan, tikus mulai dipelihara. Masa adaptasi tikus adalah 1 minggu. Masa perlakuan selama 36 hari. Selama masa perlakuan, secara berkala dilakukan penghitungan jumlah konsumsi ransum dan pengukuran berat badan. Pada akhir perlakuan, dilakukan pembedahan tikus. Serum darah tikus digunakan untuk menentukan total kolesterol, HDL, trigliserida, LDL, dan indeks aterogenik. Hati dan limpa digunakan untuk analisis MDA (malonaldehida). Organ tikus hati, ginjal, dan limpa ditimbang sebagai data pendukung. Secara garis besar, rancangan penelitian yang dilakukan beserta output yang diharapkan dapat dilihat pada Gambar 1.

1. Tahap 1 Persiapan Sampel a. Pembuatan Tempe Kacang Komak (Harnani 2009)

Kacang komak kering direbus dalam larutan abu 5% dari berat kacang selama 30 menit, kemudian direndam selama 48 jam. Setelah direndam, lendir dihilangkan dan dikupas kulitnya. Kacang komak tanpa kulit kemudian dikukus selama 15 menit dan ditiriskan lalu

14

Gambar 1. Kerangka Pemikiran Penelitian.

Tahapan Penelitian Luaran Tujuan

Mengetahui profil lipid darah tikus. Profil lipid tersebut mencakup total kolesterol, trigliserida, HDL, dan LDL.

Mengetahui kadar produk peroksidasi lipid (malonaldehida) pada hati dan limpa tikus.

Tepung Tempe Kacang Komak

Data kadar air, protein, lemak, abu, karbohidrat, dan serat kasar sampel

Data berat badan dan jumlah konsumsi ransum

Data berat organ

Data kadar kolesterol, HDL, trigliserida, LDL, indeks aterogenik , dan malonaldehida

Pembuatan Tepung Tempe Kacang Komak

Analisis Proksimat dan serat kasar

Pengujian In Vivo Masa adaptasi Masa perlakuan

Pembedahan Tikus

ginjal Hati, limpa Darah

Ditimbang

Analisis malonaldehida

Analisis kadar total kolesterol, HDL, trigliserida, LDL, indeks

aterogenik

16

didinginkan pada suhu ruang. Kacang komak yang sudah dingin kemudian diinokulasi dengan ragi tempe RAPRIMA sebanyak 0,5% dari berat kacang kukus. Kacang komak yang telah diinokulasi tersebut kemudian dibungkus dalam plastik dan diberi lubang dengan jarak 2 cm. Kacang komak yang telah dikemas tersebut kemudian diinkubasi pada suhu kamar (25-30oC) selama 36 jam sehingga dihasilkan tempe kacang komak segar. Prosedur pembuatan tempe kacang komak disajikan pada Gambar 2.

Gambar 2. Prosedur Pembuatan Tempe Kacang Komak

b. Pembuatan Tepung Tempe Kacang Komak (Harnani 2009) Tempe segar dipotong dengan ketebalan sekitar 0,5 cm,

kemudian dikeringkan selama 5-6 jam pada suhu 75oC. Tempe kering ini kemudian digiling dengan pin disc mill dan diayak dengan ayakan berukuran 60 mesh sehingga dihasilkan tepung tempe. Prosedur pembuatan tempe kacang komak disajikan pada Gambar 3.

Kacang

Direbus (+abu 5% berat kacang, 30 menit)

Direndam (48

Dicuci dan dikupas

Dikukus 15 menit

Didinginkan dan diinokulasi dengan ragi (0,5% berat kacang kukus)

Dikemas plastik dan diberi lubang dengan

Diinkubasi (25-30oC, 36 jam)

Tempe kacang komak

17

Gambar 3. Prosedur Pembuatan Tepung Tempe Kacang Komak

c. Analisis Proksimat Tepung Tempe Kacang Komak 1) Analisis Kadar Air Metode Oven (AOAC 1995)

Kadar air diukur dengan metode oven biasa karena kandungan bahan volatil pada sampel rendah dan sampel tidak terdegradasi pada suhu 100oC. Cawan aluminium kosong dikeringkan dalam oven suhu 105oC selama 15 menit lalu didinginkan dalam desikator selama 5 menit atau sampai tidak panas lagi. Cawan ditimbang dan dicatat beratnya. Lalu ditimbang sampel sebanyak 5 g di dalam cawan tersebut. Sampel dikeringkan dalam oven sampai beratnya konstan (perubahan berat tidak lebih dari 0,003 g). Setelah itu cawan didinginkan di dalam desikator. Ditimbang berat akhirnya. Dihitung kadar air dengan persamaan berikut:

Kadar air (% b/b) = 100% Keterangan : x = berat cawan dan sampel sebelum dikeringkan (g) y = berat cawan dan sampel setelah dikeringkan (g) a = berat cawan kosong (g)

2) Analisis Kadar Abu (AOAC 1995) Cawan porselen dibakar dalam tanur selama 15 menit

kemudian didinginkan di dalam desikator. Setelah dingin ditimbang. Kemudian sampel sebanyak 5 g ditimbang di dalam cawan lalu

Dipotong (ketebalan 0,5

Dikeringkan (75oC, 5-6

Digiling dan diayak (60

Tempe kacang komak

Tepung tempe kacang komak

18

diabukan di dalam tanur hingga diperoleh abu berwarna putih dan beratnya tetap. Setelah itu, cawan didinginkan di dalam desikator lalu ditimbang.

Perhitungan :

Kadar abu (%b/b) = W2W1

100%

Keterangan : W1 = berat sampel (g) W2 = berat abu (g)

3) Analisis Kadar Protein (AOAC 1995) Sampel sebanyak 0,1-0,2 g dimasukkan ke dalam labu

kjedahl 100 ml, lalu ditambahkan 2 g K2SO4, 40 mg HgO, dan 2,5 ml H2SO4 pekat. Setelah itu, didestruksi selama 30 menit sampai cairan berwarna jernih dan dibiarkan sampai dingin. Selanjutnya ditambahkan air suling secukupnya dan 10 ml NaOH pekat sampai berwarna coklat kehitaman dan didestilasi. Hasil destilasi ditampung dalam erlenmeyer 125 ml yang berisi H2BO3 dan indikator, kemudian dititrasi dengan HCl 0,02 N. Larutan blanko juga dianalisis seperti sampel. Kadar nitrogen dihitung berdasarkan rumus

% Nitrogen = V HCl V blankomlN HCl14,007faktor konversimg contoh

100%

4) Analisis Kadar Lemak Metode Soxhlet (AOAC 1995) Labu lemak yang telah bebas lemak dikeringkan di dalam

oven kemudian ditimbang setelah dingin. Sampel sebanyak 5 g dibungkus dalam kertas saring kemudian ditutup kapas yang bebas lemak. Sampel dimasukkan ke dalam alat ekstraksi soxhlet, kemudian kondensor dan labu dipasang pada ujung-ujungnya. Pelarut heksana dimasukkan ke dalam alat lalu sampel direfluks selama 5 jam. Setelah itu pelarut didestilasi dan ditampung pada wadah lain. Labu lemak dikeringkan di dalam oven pada suhu 105oC sampai diperoleh berat tetap. Kemudian Labu lemak dipindahkan ke desikator, lalu didinginkan dan ditimbang.

19

Perhitungan :

Kadar lemak (%b/b) = W2W1

100%

Keterangan : W2 = Berat sampel (g) W1 = Berat lemak (g)

5) Analisis Kadar Karbohidrat By Difference (AOAC 1995) Pengukuran kadar karbohidrat menggunakan metode by

difference dengan rumus : Kadar karbohidrat (%b/b) = 100% - (k.air + k.protein + k.lemak + k.abu) (%)

6) Analisis Serat Kasar (Apriyantono et al. 1989) Sebanyak 2 g sampel bebas lemak dimasukkan ke dalam

erlenmeyer dan ditambahkan 0,5 g asbes yang telah dipijarkan dan 2 tetes zat anti buih. Setelah itu 200 ml H2SO4 mendidih ditambahkan ke dalam erlenmeyer. Erlenmeyer kemudian diletakkan di dalam pendingin balik. Sampel di dalam erlenmeyer didihkan selama 30 menit dengan sesekali digoyang. Setelah selesai, suspensi disaring dengan kertas saring. Residu dicuci dengan air mendidih hingga air cucian tidak bersifat asam (diuji dengan kertas lakmus). Residu dipindahkan secara kuantitatif ke dalam erlenmeyer dengan cara mencuci residu dengan 200 ml NaOH mendidih. Larutan tersebut kemudian didihkan kembali selama 30 menit dengan pendingin balik. Setelah itu larutan disaring dengan kertas saring yang diketahui beratnya sambil dicuci dengan K2SO4 10%, air mendidih, kemudian dengan alkohol 95%. Kertas saring dikeringkan di dalam oven hingga berat konstan. Setelah didinginkan di desikator, residu ditimbang. Serat kasar didapat dari rumus

Kadar serat kasar g100g contoh W W

W 100 Keterangan : W2 = Berat residu dan kertas saring kering (g) W1 = Berat kertas saring (g) W = Berat sampel yang dianalisis (g)

20

2. Tahap 2 Pengujian In Vivo Penelitian tahap 2 dilakukan untuk melihat pengaruh pemberian

tepung tempe kacang komak terhadap profil lipid darah dan peroksidasi lipid tikus dengan melakukan pengukuran kandungan total kolesterol, trigliserida, LDL, dan HDL dalam serum darah. Tikus yang digunakan sebanyak 15 ekor jenis spargue dawley jantan. Tikus tersebut dibagi ke dalam tiga kelompok. Kelompok pertama adalah kontrol positif, kelompok kedua kontrol negatif, dan kelompok ketiga adalah kelompok tempe (diberi tepung tempe kacang komak). Rancangan penelitian utama dapat dilihat pada Gambar 1.

a. Persiapan dan Pembuatan Ransum Ransum yang diberikan kepada tikus percobaan mengacu pada

AIN (American Institute of Nutrition) (Reeves et al. 1993). Komposisi ransum tikus setiap perlakuan dapat dilihat pada Tabel 5, perhitungan komposisi ransum kelompok tempe dapat dilihat pada Lampiran 1. Ransum standar terdiri atas pati jagung, kasein, sukrosa, minyak kedelai, CMC, vitamin mix merek Fitkom (Tabel 6), dan mineral mix (Tabel 7). Kelompok kontrol positif diberi ransum standar dengan penambahan kolesterol 1% dan PTU (propiltiourasil). Kelompok kontrol negatif hanya diberi ransum standar. Kelompok tempe diberi ransum standar dengan penambahan kolesterol dan PTU serta mengganti kasein ransum standar dengan sampel (tepung tempe kacang komak).

b. Masa Adaptasi Tikus (Arafah 1994) Lama masa adaptasi adalah tujuh hari dengan pemberian ransum

standar (komposisi sama dengan kontrol negatif). Air diberikan secara ad libitum. Tikus ditempatkan secara individual dalam kandang pada ruangan dengan sirkulasi gelap terang masing-masing 12 jam dengan suhu berkisar 22-24oC.

21

Tabel 5. Komposisi Ransum Tikus (Reeves et al. 1993)

Bahan

Komposisi Ransum Dalam %

Kontrol Negatif (ransum standar)

Kontrol Positif (ransum standar + kolesterol + PTU)

Tempe (sumber protein

kasein diganti tepung tempe kacang komak + kolesterol + PTU)

Pati Jagung 61,4 62,5 33,9 Tepung Tempe - - 45,6 Kasein 14,0 14,0 - Sukrosa 10,0 10,0 10,0 Minyak Kedelai 4,0 4,0 3,3 Selulosa 5,0 5,0 1,6 Mineral Mix 3,5 3,5 2,3 Vitamin Mix 1,0 1,0 1,0 Kolesterol - 1,0 1,0 PTU - 0,1 0,1

Tabel 6. Komposisi Vitamin Fitkom Jenis Jumlah % AKG

Vitamin A 1000 IU 333,33 Vitamin B1 1,4 mg 116,67 Vitamin B2 1,6 mg 123,08 Vitamin B6 2 mg 153,85 Vitamin B12 3 mcg 125,00 Vitamin C 60 mg 100,00 Vitamin D3 100 IU 20,00 Vitamin E 5 mg 50,00 Nicotinadium 9 mg 56,25 Kalsium pantotenat 5 mg 0,06

Tabel 7. Komposisi Campuran Mineral Jenis Vitamin Jumlah (g/500g)

NaCl 69,99 KH2PO4 194,53 MgSO4 28,65 CaCO3 190,73 FeSO4.7H2O 13,50 MnSO4.H2O 2,01 KI 0,40 ZnSO4.7H2O 0,27 CuSO4.5H2O 0,24 CuCl2.6H2 0,01

22

c. Massa Perlakuan

Masa perlakuan adalah 36 hari. Selama masa perlakuan, tikus diberi ransum sesuai dengan kelompok perlakuannya (Tabel 5) dan pemberian air minum diberikan secara ad libitum. Pengamatan yang dilakukan yaitu jumlah konsumsi ransum dan berat badan tikus percobaan. Banyaknya ransum yang dikonsumsi dihitung setiap hari dengan menimbang sisa ransum yang tidak dikonsumsi oleh tikus. Pengamatan berat badan masing-masing tikus dalam tiga kelompok perlakuan dilakukan tiga hari sekali selama perlakuan. Hasil yang diperoleh kemudian dibandingkan antar kelompok.

d. Persiapan Sampel Darah dan Organ Pengambilan sampel darah dan organ dilakukan pada hari ke-37.

Sebelum dibedah, selama 12 jam tikus dipuasakan agar data yang dihasilkan tidak dipengaruhi oleh konsumsi terakhir.

Tikus yang akan dibedah harus dalam keadaan hidup. Eutanasia dilakukan dengan cara menarik ekor tikus sehingga tulang belakangnya lepas. Cara ini dapat menghilangkan rasa sakit tikus, namun jantung masih tetap berdetak selama beberapa menit. Tikus kemudian dipindahkan ke papan pembedahan yang dialasi aluminium foil. Kemudian tikus ditelentangkan dan digunting bagian perutnya secara vertikal ke arah leher sampai jantung tikus terlihat.

Alat suntik ditusukkan ke jantung tikus dan secara perlahan-lahan ditarik ke atas. Darah yang diperoleh dimasukkan ke dalam tabung sentrifuse dan diletakkan dalam posisi miring selama satu jam pada suhu kamar sampai terbentuk dua lapisan, lapisan bening di bagian atas dan lapisan berwarna merah di bagian bawah. Darah kemudian disentrifuse pada 894 x g selama 10 menit. Lapisan atas yang bening diambil dengan menggunakan pipet dan untuk selanjutnya dianalisis. Organ tikus (hati, ginjal, dan limpa) diambil dengan gunting bedah dan pinset, kemudian ditimbang dengan neraca analitik. Hati dan limpa kemudian disimpan untuk analisis (Nugroho 2007).

23

e. Analisis Serum Darah dan Organ Tikus 1) Analisis Total Kolesterol (Metode CHOD-PAP)

Prinsip pengujian ini adalah mereaksikan kolesterol secara hidrolisis enzimatis dan oksidasi. Hasil reaksi tersebut menghasilkan senyawa quinine yang berwarna merah, sehingga dapat dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 500 nm. Prosedur analisis disajikan pada Gambar 2. Komposisi reagen kolesterol terdapat di Tabel 8. Nilai kadar kolesterol didapat dari persamaan berikut :

Kadar kolesterol !mgdl # A sampelA standar 200

mgdl

Gambar 4. Prosedur Analisis Total Kolesterol. Tabel 8. Komposisi Reagen Kolesterol

Komposisi Jumlah Goods buffer pH 6,7 50 mmol/l Phenol 5 mmol/l 4-aminoantipyrine 0,3 mmol/l Kolesterol esterase >_ 200 U/I Kolesterol oksidase >_50 U/I Poroksidase >_ 3 kU/I Standar 200 mg/dl (5,2 mmol/l)

2) Analisis High Density Lipoprotein (HDL) (Metode CHOD-PAP) Prinsip penentuan HDL yaitu mengendapkan kilomikron,

VLDL, dan LDL dengan menambahkan asam fosfotungstat dan ion Mg. Proses sentrifugasi akan menghasilkan hanya HDL dalam supernatan yang kemudian ditentukan secara enzimatis menggunakan DSI cholesterol FS. Prosedur analisis disajikan pada Gambar 3 dan Gambar 4. Komposisi reagen presepitasi terdapat di Tabel 9. Nilai kadar HDL didapat dari persamaan berikut :

0,01 ml serum/standar ditambah 1 ml reagen kolesterol

Dicampur

Diinkubasi pada suhu 37 oC, 5 menit

Dibaca absorbansi (A) pada 500 nm

24

Kadar HDL !*+,- # . /*01-. /23,4 200

*+,-

Gambar 5. Prosedur Persiapan Sampel Analisis Kadar HDL.

Gambar 6. Prosedur Analisis Total HDL. Tabel 9. Komposisi Reagen Presepitasi

Komposisi Jumlah Asam fosfotungstat 1,4 mmol/l Magnesium klorida 8,6 mmol/l Standar kolesterol 0,3 mmol/l Standar kolesterol 200 mg/dl (5,2 mmol/l)

3) Analisis Trigliserida (Metode GPO-PAP) Analisis kandungan trigliserida dapat dilihat pada Gambar 5.

Komposisi reagen trigliserida yang digunakan tertera pada Tabel 10. Kadar trigliserida didapat dari hasil perhitungan berikut :

Kadar TG !*+,- # . /*01-. /23,4 200

*+,-

4) Analisis Low Density Lipoprotein (LDL) (Friedward et al. 1972) Kadar LDL dihitung secara langsung menggunakan rumus :

200 l serum ditambah 500 l reagen presipitasi

Dicampur

Diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit

Disentrifuse 3578 x g, 10 menit

Supernatan siap dianalisis

100 l supernatan/standar ditambahkan 1 ml pereaksi kolesterol

Dicampur

Diinkubasi pada suhu 37 oC, 5 menit

Dibaca absorbansi (A) pada 500 nm

25

Kadar LDL !*+,- # total kolesterol !HDL 789: #

Asumsi: TG/5 merupakan VLDL.

Gambar 7. Prosedur Analisis Total Trigliserida Standar.

Tabel 10. Komposisi Reagen Trigliserida Komposisi Jumlah

Goods buffer pH 7,2 50 mmol/l 4-klorofenol 4 mmol/l ATP 2 mmol/l Mg 2+ 15 mmol/l glycerokinase 0,4 kU/I peroksidase 2 kU/I Lipoprotein lipase 2 kU/I 4-Aminoantipyrine 0,5 mmol/l Glycerol-3-phosphate-oxidase 0,5 kU/I Standar 200 mg/dl (2,3 mmol/l)

5) Indeks Aterogenik (Balsinska 1998) Indeks Aterogenik (IA) dihitung dengan rumus :

IA total kolesterol HDLHDL

6) Analisis Malonaldehida (MDA) (Conti et al. 1999) Analisis MDA ini dilakukan pada organ hati dan limpa tikus.

Prinsip analisis MDA yaitu bahwa pemanasan akan menghidrolisis peroksida lipid sehingga MDA yang terikat akan dibebaskan dan akan bereaksi dengan TBA dalam suasana asam membentuk kompleks MDA-TBA yang berwarna merah. Intensitas warna merah tersebut dapat diukur pada panjang gelombang 532 nm. Prosedur analisis MDA pada hati dan limpa dapat dilihat pada Gambar 6.

0,01 ml Serum/standar trigliserida ditambah 1 ml reagen trigliserida

Dicampur

Diinkubasi pada suhu 37 oC, 5 menit

Dibaca absorbansi (A) pada 500 nm

26

Gambar 8. Prosedur Analisis MDA pada Organ Hati dan Limpa.

Sebagai standar MDA digunakan 1,1,3,3 tetraetoksipropana (TEP). Pada suasana asam, TEP terhidrolisis dan menghasilkan hemiasetal dan etanol. Hemiasetal yang terbentuk kemudian terdekomposisi menjadi etanol dan malonaldehida. Penentuan kurva standar dilakukan sama dengan penentuan sampel. Perhitungan kadar MDA sampel berdasarkan hasil ploting nilai absorbansi pada kurva standar. Konsentrasi TEP yang digunakan yaitu 0,0; 1,2; 2,4; 3,6; 4,8; 6,0; 7,2; 15,0; dan 24,0 x10-3 pmol/ml.

Organ hati ditimbang sebanyak 1 g

Ditambah larutan PBS dingin sebanyak 9 ml

Dihancurkan dengan cara digerus

Disentrifuse pada 2012 x g selama 15 menit

Diambil supernatan 4 ml

Ditambah 1 ml larutan TCA 15%

Ditambah 1 ml TBA 0,37% dalam HCL 0,25 N

Dipanaskan di dalam penangas air pada suhu 80 oC selama 15 menit

Didinginkan sampai suhu ruang

Disentrifuse pada 2012 x g selama 15 menit

Diukur absorbansi supernatan pada 532 nm

Organ limpa ditimbang dan dicatat beratnya