BAB IIIMETODE PENELITIAN

3.1 Alat, Bahan, dan Hewan Percobaan3.1.1 AlatTimbangan analitik (Sartorius BL 210), timbangan tikus (Tanita, KD-160), mikrolab (Merck), mikropipet 100 L (Soccorex) dan 50-1000 L (Biohit), effendorf, alat sentrifus (Thermo Fisher), sonde oral tikus, spuit, mortir dan stamper, kandang retriksi, kandang tikus, botol minum tikus, alat gelas, pipet tetes, cawan penguap, bunsen dan kaki tiga, spatel logam, corong, oven (Memmert), tanur (Furnesh), rotary evaporator (Eyela), desikator, plat tetes, krus platina, maserator.

3.1.2 BahanDaun Mimba (Azadirachta indicaA.Juss), Cursil, CMC 0,5%, Parasetamol (asetaminofen), reagen GPT dan GOT (Dialab), air suling, Alkohol 70 %, kapas, kertas saring, asam asetat 1%, eter, kloroform, asam klorida 2 N, amil alkohol, alumunium foil, pereaksi Mayer, pereaksi Dragendroff, serbuk magnesium, natrium hidroksida 1 N, HCL 2N, asam anhidrat, toluen, natrium klorida, besi(III) klorida, etanol 95%, amonium hidroksida, gelatin 1%, vanilin 10%, asam sulfat pekat, kalium hidroksida, pereaksi Lieberman Burchard, makanan tikus, sekam, formalin.

3.1.3 Hewan PercobaanHewan percobaan yang akan digunakan adalah tikus Wistar betina dengan berat rata-rata 200 g dengan umur 2 bulan sebanyak 30 ekor, yang diperoleh dari Laboratorium Hewan Pusat Ilmu Hayati Institut Teknologi Bandung.

3.2Penyiapan SimplisiaPenyiapan simplisia meliputi pengumpulan bahan, determinasi tanaman dan pengolahan bahan menjadi simplisia.

3.2.1Pengumpulan BahanBahan penelitian yang digunakan adalah daun Mimba (Azadirachta indicaA.Juss) yang diperoleh dari Manoko, Lembang.

3.2.2Determinasi TumbuhanDeterminasi daun Mimba (Azadirachta indicaA.Juss) dilakukan di Herbarium Bandungense, Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati, Institut Teknologi Bandung.

3.2.3Pengolahan Bahan Menjadi simplisiaDaun Mimba, dicuci dengan air hingga bersih, dikeringkan dengan cara diangin-anginkan sampai kering. Proses pembuatan simplisia pada prinsipnya meliputi tahap-tahap pencucian, pengecilan ukuran, dan pengeringan.

3.3 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik, mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar abu, kadar sari larut air, kadar sari larut etanol, dan penetapan susut pengeringan.

3.3.1Pemeriksaan MakroskopikPemeriksaan makroskopik meliputi sifat morfologi dari simplisia, yaitu bentuk, ukuran, warna, karakteristik pernukaan, tekstur, dan retakan, bau dan rasa dari simplisia.

3.3.2Penetapan Kadar AirSerbuk simplisia ditimbang seksama sebanyak 2 gram, lalu dimasukkan ke dalam cawan penguap yang telah ditara. Kemudian dikeringkan pada suhu 1050C dalam oven selama 3 jam dan ditimbang. Setelah itu didinginkan ke dalam desikator selama 10 menit, lalu ditimbang sampai diperoleh bobot konstan, perbedaan antara dua kali penimbangan berturut-turut tidak lebih dari 0,05 mg. Penetapan kadar air dihitung dengan persamaan berikut :Kadar air (%) =

3.3.3Penetapan Kadar AbuSerbuk simplisisa ditimbang seksama sebanyak 2 gram, kemudian dimasukkan ke dalam krus yang telah dipijar dan ditara. Krus yang berisi serbuk simplisia dimasukkan dan dipijarkan dalam tanur perlahan-lahan pada suhu 5000C hingga menjadi abu, setelah itu didinginkan dalam desikator selama 10 menit dan ditimbang sampai didapat bobot konstan. Penetapan kadar abu dihitung dengan persamaan berikut :Kadar Abu Total (%) =

3.3.4Penetapan Kadar Sari Larut EtanolDitimbang seksama serbuk simplisia sebanyak 5 gram, kemudian dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 95% dalam labu tertutup, sambil sesekali dikocok selama 6 jam pertama dan kemudian dibiarkan selama 18 jam. Hasil maserasi disaring dan filtrat diambil sebanyak 20 ml, kemudian diuapkan diatas penangas air hingga kering dalam cawan penguap yang telah ditara, lalu dimasukkan dan dipanaskan ke dalam oven dengan suhu 105oC hingga berat konstan. Penetapan kadar sari larut etanol dihitung dengan persamaan berikut :Kadar sari larut etanol (%) =

3.3.5Penetapan Susut PengeringanSebanyak 1-2 g dari serbuk simplisia dimasukkan ke dalam cawan dangkal bertutup yang sebelumnya telah dipanaskan pada suhu 105C selama 30 menit dan telah ditara. Sebelum ditimbang, simplisia diratakan dalam botol timbang, dengan menggoyangkan botol, hingga merupakan lapisan setebal lebih kurang 5-10 mm. Kemudian dimasukan ke dalam ruang pengering, buka tutupnya, keringkan pada suhu 105C hingga bobot tetap.

Susut pengeringan (%) =

3.4 Penapisan FitokimiaPenapisan fitokimia meliputi pemeriksaan terhadap senyawa flavonoid, saponin, alkaloid, polifenol, tanin, steroid dan triterpenoid, kuinon, monoterpenoid dan seskuiterpenoid.

3.4.1Pemeriksaan FlavonoidSebanyak 1 g simplisia ditambah 100 mL air panas kemudian didihkan selama 5 menit dan disaring. Sebanyak 5 mL filtrat ditambahkan serbuk magnesium dan 1 mL HCl 2 N. Campuran dipanaskan pada penangas air. Filtrat disaring dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 5 mL amil alkohol, kemudian dikocok kuat-kuat. Adanya senyawa flavonoid ditunjukkan dengan terbentuknya warna kuning hingga merah yang dapat ditarik oleh amil alkohol.

3.4.2Pemeriksaan SaponinSebanyak 1 g simplisia digerus dengan air, dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 mL air kemudian dipanaskan. Setelah dingin dilakukan pengocokan selama beberapa menit, kemudian diamati pembentukan busa. Adanya senyawa saponin dalam simplisia ditandai dengan terbentuknya busa setinggi 1 cm dan stabil selama 5 sampai 10 menit serta tidak hilang setelah ditambahkan larutan asam klorida 0,1 N.

3.4.5Pemeriksaan AlkaloidSejumlah 1 g simplisia dibasakan dengan 5 mL amonia, ditambahkan 20 mL kloroform, kemudian digerus kuat dengan mortar. Filtrat disaring, dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 5 mL asam klorida 2 N. Campuran dikocok kuat-kuat sampai terbentuk dua lapisan. Lapisan asam dipipet, kemudian dibagi menjadi tiga bagian dan masing-masing dimasukkan dalam tabung reaksi. Tabung 1: ditambahkan 2-3 tetes pereaksi Dragendorff. Diamatipengendapan dan kekeruhan, apabila terjadi kekeruhan danendapan berwarna jingga cokelat menunjukkan adanyasenyawa alkaloid dalam ekstrak. Tabung 2: ditambahkan 2-3 tetes pereaksi Mayer, diamati adanyaendapan atau kekeruhan, apabila terjadi kekeruhan danterbentuk endapan berwarna putih menunjukkan bahwaekstrak mengandung senyawa alkaloid. Tabung 3: Sebagai blanko.

3.4.6Pemeriksaan PolifenolSejumlah 1 g simplisia ditambahkan 20 mL air dalam tabung reaksi dipanaskan di atas penangas air sampai mendidih selama 5 menit. Filtrat disaring, kemudian ditambahkan 2-3 tetes pereaksi besi (III) klorida. Terjadinya warna hijau-biru hingga hitam menunjukkan bahwa simplisia mengandung senyawa fenolat.

3.4.7Pemeriksaan TaninSebanyak 1 g simplisia ditambahkan 20 ml air, dipanaskan di atas penangas air selama 5 menit kemudian disaring. Filtrat dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 2-3 tetes pereaksi besi (III) klorida dan 1 mL gelatin 1%. Adanya senyawa tanin ditandai dengan terbentuknya endapan putih.

3.4.8Pemeriksaan Steroid dan TriterpenoidSebanyak 1 g simplisia digerus dengan 20 mL eter, kemudian disaring. Diuapkan filtrat pada cawan penguap hingga kering. Pada residu diteteskan pereaksi Liebermann-Burchardat sebanyak 2-3 tetes. Terbentuknya warna ungu menunjukkan adanya senyawa triterpenoid dan warna hijau-biru menunjukkan bahwa ekstrak mengandung senyawa steroid.

3.4.9Pemeriksaan KuinonSebanyak 1 g simplisia dalam tabung reaksi ditambahkan 20 mL air kemudian dipanaskan pada penangas air. Filtrat disaring dan ditambahkan 2-3 tetes larutan kalium hidroksida (KOH) 5 %. Terbentuknya warna kuning menunjukkan adanya senyawa kuinon dalam simplisia.

3.4.10Pemeriksaan Monoterpenoid dan SeskuiterpenoidSejumlah 1 g simplisia digerus dengan 20 mL eter, filtrat disaring kemudian diuapkan pada cawan penguap hingga kering. Ke dalam residu diteteskan 2-3 tetes larutan pereaksi anisaldehid-asam sulfat atau vanillin 10 % dalam asam sulfat pekat. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya warna-warni.

3.5 Pembuatan Ekstrak Air Daun Mimba Sebanyak 200 gram simplisia daun mimba ditimbang seksama dan dibungkus kain belacu kemudian ditambah 2 L air suling, dipanaskan diatas tangas air selama 15-20 menit terhitung mulai suhu mencapai 96-980C sambil sekalikali diaduk. Diserkai selagi panas melalui kain belacu, ditambahkan air panas secukupnya melalui ampas hingga diperoleh volume infus yang dikehendaki. Kemudian ekstrak cair dikumpulkan dan dipekatkan diatas tangas air sampai diperoleh ekstrak yang lebih pekat. Hasil pemekatan ekstrak dikeringkan dengan cara freeze drying. Kemudian ditimbang bobot ekstrak dan dihitung rendemen dari ekstrak air daun mimba.

3.6 Penyiapan larutan CMC 0,5 %Larutan CMC 0,5 % dibuat dengan cara melarutkan lebih kurang 0,5 gram CMC yang telah ditimbang seksama ke dalam air sampai volume 100 ml. larutan ini digunakan sebagai pembawa parasetamol dan ekstrak.

3.7 Penyiapan Suspensi dan Penetapan Dosis Parasetamol Suspensi parasetamol dalam CMC 0,5% dibuat dengan cara melarutkan sejumlah gram parasetamol yang telah ditimbang ke dalam CMC 0,5% hingga konsentrasi yang telah ditetapkan sebelumnya, yaitu dosis hepatotoksik. Dosis parasetamol dipilih berdasarkan dosis hepatotoksiknya terhadap tikus yaitu 1350 mg/kg BB.(19)

3.8 Penyiapan Bahan Uji ( Suspensi Ekstrak Air Daun Mimba)Dibuat tiga dosis uji, yaitu yang pertama dosis I sebesar 25 mg/kg BB, dosis yang kedua sebesar 45 mg/kg BB dan dosis yang ketiga sebesar 85 mg/kg BB. Ekstrak uji yang akan diberikan ke hewan percobaan disuspensikan dalam CMC 0,5% sesuai dengan dosisnya.

3.9 Penyiapan Pembanding (Suspensi Silymarin)Dosis Silymarin yang digunakan adalah 16,8 mg/kg BB tikus dan disuspensikan dalam 2 mL larutan CMC 0,5%.

3.10 Penyiapan Hewan Percobaan Hewan percobaan yang digunakan adalah tikus Wistar betina dengan umur 2 bulan dan bobot badan 200 gram. Sebelum dilakukan percobaan, hewan diadaptasikan selama 7 hari dengan cara diamati perilakunya dan setiap hari bobot ditimbang. Hanya hewan yang sehat dan normal yang tidak menunjukkan penurunan bobot badan lebih dari 5% dan lolos uji kepekaan saja yang dapat digunakan untuk percobaan.

3.11 Uji Efektivitas Hepatoprotektor Ekstrak Air Daun MimbaHewan dibagi menjadi 5 kelompok dan tiap kelompok masing-masing terdiri dari 6 ekor tikus betina yaitu kelompok kontrol, kelompok pembanding, kelompok ekstrak air daun mimba yang dibagi kedalam dosis I, II, dan III.1. Kelompok Kontrol: diberi larutan CMC 0,5% diinduksiParasetamol 2. Kelompok Pembanding : diberi suspensi Silymarin diinduksi parasetamol3. Kelompok Uji I : diberi suspensi ekstrak air daun Mimba dosis 1 (25 mg/kg bb) diinduksi parasetamol.4. Kelompok Uji II : diberi suspensi ekstrak air daun Mimba dosis 2 (45 mg/kg bb) diinduksi parasetamol.5. Kelompok Uji III : diberi suspensi ekstrak air daun Mimba dosis 3 (85 mg/kg bb) diinduksi parasetamol.

Penelitian ini dikerjakan mengikuti rancangan acak lengkap, menggunakan 30 ekor tikus Wistar betina yang dibagi menjadi 5 kelompok sama banyak dimana tiap kelompok adalah 6 ekor tikus. Tikus kelompok kontrol diberi CMC 0,5 % selama 7 hari dan diikuti dengan pemberian paracetamol dosis 1350 mg/kg bb pada hari ke-8. Tikus kelompok pembanding diberi Silymarin selama 7 hari dan diikuti dengan pemberian paracetamol dosis 1350 mg/kg bb pada hari ke-8. Dan tikus kelompok I, II, dan III diberi ekstrak air daun mimba berturut sampai hari ke-7 dan diikuti pemberian paracetamol dosis 1350 mg/kg bb pada hari ke-8. Sebelum diinduksi dengan Paracetamol tikus dipuasakan terlebih dahulu.

Pengambilan darah dilakukan 2 kali yaitu pada saat sebelum perlakuan, dan 24 jam setelah pemberian Paracetamol. Darah diambil dari vena ekor tikus dan kemudian disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm untuk mendapatkan serum. Serum sebanyak 100 L dimasukkan kedalam tabung reaksi, kemudian dicampur dengan pereaksi penentu SGPT dan SGOT sebanyak 0,5 mL. Diinkubasikan pada suhu kamar (20-25C) selama 1 menit, kemudian dibaca serapannya menggunakan mikrolab pada panjang gelombang 340 nm.

3.12 Pemeriksaan Makropatologi HatiPemeriksaan makropatologi hati dilakukan pada seluruh kelompok hewan percobaan yang telah diperiksa kadar SGPT, dan SGOT akhir. Semua hewan percobaan dikorbankan, dibedah dan dikeluarkan organ hatinya. Organ hati ditimbang, kemudian diamati warnanya, dihitung indeks organ hati terhadap bobot badan tikus setelah diinduksi parasetamol.

3.15 Pemeriksaan Histopatologi hatiSetelah dibedah, hati tikus dimasukkan dalam wadah yang berisi formalin. Kemudian, di-embedding di dalam paraffin panas dan dibiarkan membeku. Setelah membeku, preparat hati dibuat menjadi slide menggunakan mikrotom. Slide dikeringkan di oven pada suhu 600C selama 24 jam. Paraffin pada slide dihilangkan dengan merendam slide dalam cairan xilen sehingga siap untuk diwarnai dengan pewarnaan eosin-hematoxilin. Eosin akan memberikan warna merah pada membran sel, sedangkan hematoxylin akan memberikan warna biru-ungu pada inti sel. Pewarnaan ini akan memperjelas struktur berbagai jenis sel yang ada di dalam jaringan hepatosit hati. Pengamatan dan pengambilan gambar histologi dilakukan di bawah mikroskop.

3.14 Evaluasi DataPenurunan kadar enzim SGPT, dan SGOT dihitung untuk setiap tikus dan dihitung pula untuk masing-masing kelompok tikus nilai kadar kedua enzim ini secara statistik dengan menggunakan metode ANOVA dan Test Post Hoc dengan menggunakan uji Tukey dan juga dibandingkan kadar enzim SGPT dan SGOT antar kelompok dengan uji statistika Student-t.