5

Bab II Tinjauan Pustaka

II.1 Gajah

Gajah adalah hewan mamalia, merupakan satu-satunya famili yang tersisa dari

ordo Proboscidea. Gajah merupakan hewan darat terbesar di dunia. Sepanjang 55

juta tahun terdapat 500 spesies gajah yang dikenal, tetapi saat ini di dunia hanya

terdapat 2 spesies gajah, yaitu gajah Afrika dan gajah Asia.

II.1.1 Gajah Afrika (Loxodonta africana).

Gajah-gajah dari genus Loxodonta, yang lebih dikenal dengan gajah Afrika,

sekarang ini ditemukan di 37 lokasi di Afrika. Gajah Afrika berbeda dengan gajah

Asia dalam beberapa hal, yang paling nyata terlihat adalah telinganya yang lebih

besar dan berbentuk konkaf terbalik. Gajah Afrika jantan dan betina keduanya

memiliki gading dan biasanya memiliki rambut yang lebih sedikit dibandingkan

dengan gajah Asia. Gajah Afrika diklasifikasikan menjadi dua subspesies, yaitu

gajah savanna (Loxodonta africana africana) dan gajah hutan (Loxodonta

africana cyclotis) [Eggert et al., 2002], analisis DNA terbaru menyatakan bahwa

keduanya merupakan species yang berbeda [Roca et al., 2001], namun pernyataan

ini belum sepenuhnya diterima secara univesal. Gajah savanna merupakan

binatang terbesar didunia, tingginya mencapai 4 m sampai batas bahu dan berat

rata-ratanya 7.000 kg (7.7 tons). Gajah savanna paling sering ditemukan di padang

rumput, rawa-rawa, dan tepi danau. Kebanyakan gajah savanna tinggal di bagian

selatan Sahara. Jenis lain dari gajah Afrika adalah gajah hutan (Loxodonta

cyclotis). Dibandingkan dengan gajah savanna, bentuk telinga biasanya lebih kecil

dan lebih bulat, dan gadingnya lebih kurus dan tidak terlalu banyak mengarah

keluar. Gajah hutan dapat mencapai berat 4.500 kg dan tingginya hingga 3 m.

Gajah hutan lebih sulit dipelajari karena lingkungan hidup mereka yang sulit

dijangkau. Secara normal mereka hidup di hutan hujan di pusat dan barat Afrika,

namun ada kalanya mereka menyisiri tepian hutan dan bersinggungan dengan

teritorial gajah savanna dan menghasilkan keturunan dengannya. Di tahun 1979,

Iain Douglas-Hamilton memperkirakan populasi Gajah Afrika sekitar 1.3 juta

ekor [Douglas et al., 1979]. Perkiraan ini kontroversial dan dan berlebihan [Parker

6

et al., 1983]. Namun telah disitasi secara luas dan menjadi fakta yang salah dalam

mengukur jumlah nyata polulasi dari species itu. Ditahun 1980, Loxodonta

menerima perhatian yang luas dari dunia luas berkaitan dengan jumlah

populasinya yang memprihatinkan di Afrika Timur. Menurut Laporan Status

gajah Afrika IUCN [Blanc et al., 2007] di Afrika ada kira-kira antara 470,000 dan

690,000 gajah Afrika di alam liar. Sejauh ini populasi terbesar ditemukan di

Afrika Selatan dan Timur. Akibatnya di Afrika Selatan membuat undang-undang

bahwa ilegal bila membunuh gajah.

Gambar II.1 Gajah Afrika (Loxodonta africana). Saat ini merupakan gajah

terbesar di dunia dengan tinggi mencapai 4 meter dan berat 7.000 kg.

Telinganya yang lebih besar dan berbentuk konkaf terbalik

II.1.2 Gajah Asia (Elephas maximus).

Diperkirakan populasi gajah Asia sekitar 60,000 ekor, atau sekitar sepersepuluh

dari jumlah gajah Afrika. Lebih rinci diperkirakan gajah liar antara 38.000 ekor

hingga 53.000 ekor dan gajah yang domestikasi sekitar 14.500 hingga 15.300

yang tersebar di kebun binatang dan pusat perlindungan hewan di Asia [Asian

Elephant distribution, 2007] Asian elephants mengungkapkan bahwa

kemungkinan penyebab utamanya adalah perburuan liar dan pengrusakan habitat

hidupnya akibat ulah manusia. Gajah Asia berbeda daripada gajah Afrika. Gajah

Asia memiliki telinga lebih kecil sedikit daripada gajah Afrika, mempunyai dahi

yang rata, dan dua bonggol di kepalanya merupakan puncak tertinggi gajah,

dibandingkan dengan gajah Afrika yang mempunyai hanya satu bonggol di atas

7

kepala. Selain itu, ujung belalai gajah Asia hanya mempunyai 1 bibir, sementara

gajah Afrika mempunyai 2 bibir di ujung belalai. Kedua jenis kelamin gajah

Afrika mempunyai gading sementara hanya gajah Asia jantan yang mempunyai

gading yang jelas kelihatan. Beberapa subspecies Elephas maximus, yaitu gajah

Sri Lanka, gajah India, gajah Sumatera dan gajah Borneo.

II.1.2.1 Gajah Sri Lanka

Subspesies yang pertama adalah gajah Sri Lanka (Elephas maximus maximus).

Ditemukan hanya di pulau Sri Lanka, hewan ini merupakan yang terbesar di Asia.

Populasinya diperkirakan 3,000–4,500 ekor hingga hari ini di alam liar. Gajah

jantan dewasa memiliki bobot badan hingga 5,400 kg dan tinggi mencapai 3,4 m.

Gajah Sri Lanka jantan mempunyai cranial besar yang menonjol, kedua jenis

kelamin dari gajah ini mempunyai daerah depigmentasi lebih dibanding gajah

Asia lainnya. Secara khas, permukaan kulit telinga, muka, belalai dan perut

mereka dipenuhi bintik bintik merah muda.Untuk mencegah kepunahan dibangun

tempat penangkaran gajah di Pinnawala Sri Lanka.

II.1.2.2 Gajah India

Gajah India (Elephas maximus indicus), jumlah populasinya sekitar 36,000 ekor,

gajah ini berwarna abu-abu, dengan depigmentasi hanya pada bagian telinga dan

belalainya. Gajah jantan dewasa memiliki bobot sekitar 5,000 kg dengan rata-rata

tingginya sama dengan gajah Sri Lanka. Gajah ini tersebar di India, Laos, Burma,

Kamboja, Thailand, Malaysia dan China.

II.1.2.3 Gajah Sumatera

Gajah dengan postur kecil dibanding gajah yang dibahas sebelumnya adalah gajah

Sumatera (Elephas maximus sumatrensis). Populasi gajah ini diperkirakan dari

2,100 hingga 3,000 ekor. Kulitnya berwarna abu-abu terang dan depigmentation

yang paling sedikit dibanding gajah Asia lainnya, dengan bintik merah muda

hanya pada bagian telinga. Gajah Sumatera dewasa biasanya hanya memiliki

tinggi 1.7–2.6 m sampai batas bahu dan bobot badan kurang dari 3,000 kg. Gajah

ini hanya berada di pulau Sumatera biasanya di kawasan hutan.

8

Berikut merupakan klasifikasi gajah Sumatera:

Kingdom

Phylum

Subphylum

Class

Order

Superfamily

Family

Subfamilia

Tribe

Subtribe/Supergenus

Genus

Species

Subspecies

: Animalia

: Chordata

: Vertebrata

: Mammalia

: Proboscidea

: Elephantoidea

: Elephantidae

: Elephantinae

: Elephantini

: Elephantina/Elephadon

: Elephas

: Elephas maximus

: Elephas maximus sumatrensis

II.1.2.4 Gajah Borneo

Ditahun 2003 telah diidentifikasikan subspesies baru didaerah Borneo, yaitu

Gajah Kerdil Borneo, ini adalah gajah terkecil dibandingkan gajah Asia lainnya

selain itu gajah ini juga paling jinak. Gajah Borneo memiliki telinga yang relatif

besar, ekor yang panjang dan gading yang lurus.

Gambar II.2 Gajah Asia (Elephas maximus indicus). Warna kulit cenderung abu-

abu dengan depigmentasi pada bagian telinga dan belalainya. Bobot

badan mencapai 5.000 kg dengan tinggi 3-3,5 meter.

Sumber: IUCN, 2006

9

II.1.2 Peta Penyebaran Populasi Gajah

Gajah yang masih ada sekarang tersebar di Afrika dan Asia.

Gambar II.3 Gambar Peta Penyebaran Populasi Gajah. (A) Gambar penyebaran

populasi gajah Asia yang menyebar di Indonesia, Malaysia,

Kamboja, Thailand, Sri Lanka, India, Burma, China, dll dan (B)

gambar penyebaran populasi gajah Afrika yang menyebar di Zambia,

Zimbabwe, Republik Congo, Kenya, dll.

A.

B.

Sumber : www.scionline.org

Sumber : www.elephanttag.org

10

II.1.3 Pola Hidup Gajah

Gajah hidup di dalam urutan sosial yang terstruktur. Kehidupan sosial dari jantan

dan betina sungguh berbeda. Betina menghabiskan hampir seluruh hidupnya di

dalam satu grup keluarga yang terdiri atas ibu, anak perempuan, saudara

perempuan, dan bibi. Grup ini dipimpin oleh perempuan tertua. Sedangkan jantan

dewasa menghabiskan waktunya dalam kehidupan sendiri (tidak berkelompok).

Sebagai anggota dari kelas Mamalia, gajah berkembangbiak dengan cara beranak.

Gajah betina hanya mampu melahirkan satu anak gajah dan akan menjaga

anaknya sampai mampu berdiri dalam jangka waktu 5 tahun. Periode kehamilan

gajah adalah 22 bulan, terlama dibandingkan hewan darat lainnya. Berat anak

gajah pada umumnya 120 kilogram. Seekor gajah bisa hidup selama 70 tahun,

bahkan lebih lama.

Gajah adalah hewan herbivora. Ia menghabiskan 16 jam sehari untuk

mengumpulkan makanan tanaman. Makanannya terdiri atas sedikitnya 50%

rumput, ditambah dengan dedaunan, ranting, akar, dan sedikit buah, benih dan

bunga. Karena gajah hanya mencerna 40% dari yang dimakannya, mereka harus

mengonsumsi makanan dalam jumlah besar. Gajah dewasa dapat mengonsumsi

300 hingga 600 pon (140-270 kg) makanan per hari. Enam puluh persen dari

makanan tersebut tertinggal dalam tubuh gajah tidak tercerna.

II.2 Mitokondria

Mitokondria merupakan organel yang berperan dalam metabolisme energi dalam

sel eukariot. Mereka bertanggung jawab hampir pada semua penggunaan energi

yang berasal dari pemecahan karbohidrat dan asam lemak, dimana dikonversi

dalam bentuk ATP melalui proses fosporilasi oksidatif. Mitokondria sangat unik

karena memiliki DNA sendiri, dimana mengkode tRNA, rRNA, dan beberapa

protein dalam mitokondria [Cooper, 2000]

II.2.1 Struktur Mitokondria

Mitokondria berbentuk elips dengan diameter ~0,5 �m dan panjang 0,5 – 1,0 �m,

serta berfungsi sebagai penghasil energi. Mitokondria terdiri dari 4 bagian

11

penting, yaitu: (1) membran luar, (2) membran dalam, (3) ruang antarmembran,

dan (4) matriks. Membran luar adalah tempat berlangsungnya reaksi fosforilasi

oksidatif, membran dalam adalah tempat berlangsungnya sintesis fosfolipid, ruang

antarmembran adalah tempat dihasilkannya nukleotida kinase, dan matriks adalah

tempat terjadinya oksidasi piruvat dan siklus asam sitrat (siklus Krebs). Struktur

mitokondria dapat dilihat pada Gambar II.4. Mitokondria didukung oleh hipotesis

endosimbiosis yang mengatakan bahwa pada tahap awal evolusi sel eukariot

bersimbiosis dengan prokariot (bakteri) (Margullis, 1981). Kemudian keduanya

mengembangkan hubungan simbiosis dan membentuk organel sel yang pertama.

Adanya DNA pada mitokondria menunjukkan bahwa dahulu mitokondria

merupakan entitas yang terpisah dari sel inangnya. Hipotesis ini ditunjang oleh

beberapa kemiripan antara mitokondria dan bakteri. Ukuran mitokondria

menyerupai ukuran bakteri, dan keduanya bereproduksi dengan cara membelah

diri menjadi dua. Hal yang utama adalah keduanya memiliki DNA berbentuk

lingkar. Oleh karena itu, mitokondria memiliki sistem genetik sendiri yang

berbeda dengan sistem genetik inti. Selain itu, ribosom dan rRNA mitokondria

lebih mirip dengan yang dimiliki bakteri dibandingkan dengan yang dikode oleh

inti sel eukariot (Cooper, 2000).

Gambar II.4. Struktur Mitokondria. Mitokondria berbentuk lonjong atau bulat,

dibalut oleh sistem membran ganda, yang terdiri dari membran

luar dan membran dalam. Lipatan membran dalam (krista)

meluas kebagian dalam matrik.

Sumber: en.wikipedia.org

12

II.2.2 Fungsi Mitokondria

Fungsi utama mitokondria adalah memproduksi energi kimia dalam bentuk ATP

yang akan dipergunakan untuk aktivitas seluruh sel-sel tubuh manusia. Secara

garis besar, reaksi pembentukan ATP yang berlangsung di mitokondria dapat

dibagi menjadi 3 tahap yaitu (1). Reaksi oksidasi piruvat (atau asam lemak)

menjadi CO2. Reaksi ini terkait dengan reduksi NAD

+

dan FAD menjadi NADH

dan FADH2

yang berlangsung dalam ruang matriks mitokondria. (2). Transfer

elektron dari NADH dan FADH2

ke O yang berlangsung pada membran dalam

dan terkait dengan pembentukan proton motive force atau gradien elektrokimia

lintas membran dalam mitokondria. (3). Pemanfaatan energi yang tersimpan

dalam bentuk gradien elektrokimia untuk memproduksi ATP. Reaksi ini

dikatalisis oleh kompleks enzim F0-F

1 ATP sintetase yang berlokasi pada

membran dalam (Gambar II.5).

Gambar II.5 Jalur metabolik dalam mitokondria. Spiral menunjukkan reaksi

oksidasi yang menghasilkan pelepasan acetyl-coenzim A dan

penurunan flavoprotein. ANT adenine nucleotide translocator, CACT

carnitine-acyl carnitine translocase, CPT carnitine

palmitcyltransferase, DIC dicarboxylate carrier, ETF electron-

transfer flavoprotein. ETH-DH electron transfer dehydrogenase,

PDHC pyruvate dehydrogenase complex.

13

II.2.3 DNA Mitokondria

Mitokondria memiliki genomnya sendiri yang dikenal sebagai DNA mitokondria

(mtDNA) dan berbeda dengan genom inti. Struktur mtDNA dapat dilihat pada

Gambar II.6. DNA gajah berbentuk sirkuler dan memiliki untai ganda yang terdiri

atas untai Heavy (H) dan untai Light (L). Penamaan ini didasarkan pada perbedaan

densitas tiap untai dalam gradien denaturan cesium klorida (CsCl), dimana untai

H memiliki berat molekul yang lebih besar dibandingkan dengan untai L karena

untai H memiliki lebih banyak basa-basa purin yang memiliki dua buah cincin

pada strukturnya. Untai L memiliki komposisi basa sebagai berikut T 24,7%, C

31,2%, A 30,9%, dan G 13,2%. Dapat dilihat bahwa komposisi basa purin (A+G)

lebih kecil (44,1%) dibandingkan dengan basa pirimidin (T+C), yaitu 55,9%.

Gambar II.6 DNA mitokondria Mammoth (Mammuthus primigenius)

MtDNA berbentuk sirkular, beruntai ganda (untai H untuk Heavy

dan untai L untuk Light), berukuran 16842 pb yang terdiri dari

daerah pengode (coding region) yang mengode 2 rRNA, 22 tRNA,

13 polipeptida dan daerah yang tidak mengode (non coding region)

atau daerah pengontrol yang mengandung D-loop. [Rogaev et al.,

2006, Krause et al., 2006]

14

DNA mitokondria Mammoth berukuran 16842 pb, mtDNA gajah Asia berukuran

16902 pb dan mtDNA gajah Afrika berukuran 16866. Urutan lengkap gajah

Afrika (Loxodonta africana) ditentukan pertama kali oleh Hauf et al. (2000).

Urutan lengkap nukleotida Mammoth (Mammuthus primigenius) pertama kali

ditentukan oleh Krause et al. (2005). Urutan lengkap gajah Asia (Elephas

maximus indicus) ditentukan oleh Rogaev et al. (2006). MtDNA gajah

mengandung 37 gen pengode untuk 2 rRNA, 22 tRNA, dan 13 polipeptida yang

merupakan subunit kompleks enzim yang terlibat dalam fosforilasi oksidatif, yaitu

subunit 1, 2, 3, 4, 4L, 5, dan 6 dari kompleks I (NADH dehidrogenase); subunit b

(sitokrom b) dari kompleks III (koenzim Q - sitokrom C reduktase); subunit I, II,

dan III dari kompleks IV (sitokrom oksidase); serta subunit 6 dan 8 dari kompleks

V (ATP sintase). Selain gen pengode tadi, DNA mitokondria memiliki daerah

yang tidak mengkode (noncoding region) sepanjang 1420 pb, mulai dari

nukleotida 15422 sampai 16842 dan terletak di antara gen tRNApro

dan tRNAphe

.

Daerah non coding ini mengandung daerah dengan variasi tinggi yang disebut

dengan displacement loop (D-loop). D-loop merupakan daerah beruntai tiga

(triple stranded), untai ketiga lebih dikenal sebagai 7S DNA. Selain D-loop,

daerah non coding juga mengandung origin of replication untuk untai H (OH) dan

promoter untuk untai H dan L (PL dan PH), oleh karena itu sering disebut daerah

pengontrol (control region).

II.2.4 Sifat DNA Mitokondria

II.2.4.1 Pola Pewarisan Secara Maternal

DNA mitokondria berbeda dengan DNA inti karena mtDNA diwariskan melalui

garis keturunan ibu (Browning et al., 1982, Giles et al.,1980). Sel telur memiliki

jumlah kopi mtDNA yang tinggi ( ≥ 100000) sementara sel sperma memiliki

jumlah kopi mtDNA yang rendah (100-1500) (Chen et al., 1995, Manfredi et al.,

1997) dan terdapat paling banyak pada bagian ekornya. Dalam sel sperma

mitokondria banyak terkandung dalam bagian ekor karena bagian ini yang sangat

aktif bergerak sehingga membutuhkan banyak ATP. Pada saat terjadi pembuahan

sel telur, bagian ekor sperma dilepaskan sehingga hanya sedikit atau hampir tidak

ada mtDNA yang masuk ke dalam sel telur. Karena tidak terjadi rekombinasi,

15

maka mtDNA bersifat haploid, diturunkan dari ibu ke seluruh keturunannya (Cann

et al., 1987, Giles et al., 1980, Wallace, 1997).

Gambar II.7 Pola pewarisan mtDNA

Gambar ini menunjukkan bagaimana mtDNA (berwarna biru)

diwariskan dari ibu ke seluruh anaknya. Lelaki direpresentasikan

oleh kotak dan perempuan direpresentasikan oleh lingkaran. (Cann et

al., 1987, Giles et al., 1980, Wallace, 1997).

II.2.4.2 Laju Mutasi mtDNA

DNA mitokondria juga bersifat unik dan berbeda dengan DNA inti karena

memiliki laju mutasi yang tinggi, yaitu sekitar 10-17 kali DNA inti (Wallace, et

al., 1997). Hal ini disebabkan karena mtDNA tidak memiliki mekanisme reparasi

yang efisien [Bogenhagen, 1999], tidak memiliki protein pelindung seperti histon,

dan terletak berdekatan dengan membran dalam mitokondria tempat

berlangsungnya reaksi fosforilasi oksidatif yang menghasilkan radikal oksigen

sebagai produk samping (Richter, 1988). Tidak adanya aktivitas ini menyebabkan

mtDNA tidak memiliki sistem perbaikan yang dapat menghilangkan kesalahan

replikasi. Replikasi mtDNA yang tidak akurat ini akan menyebabkan mutasi

mudah terjadi. Dalam mitokondria sendiri, daerah D-loop memiliki laju mutasi

16

yang lebih tinggi dibandingkan dengan daerah pengode karena pada posisi inilah

awal replikasi dimulai (Howell et al., 1996).

II.2.4.3 Kode Genetik mtDNA

Salah satu bentuk keunikan lain dari mtDNA adalah kode genetik mitokondria

menunjukkan perbedaan dalam hal pengenalan kodon yang berbeda dengan kode

universal. Perbedaan ini ditunjukkan pada II.1

Tabel II.1 Perbedaan kodon mtDNA manusia dengan kodon universal.

Universal MtDNA Manusia

UGA STOP Triptofan

AUA Isoleusin Metionin

AUU Isoleusin Metionin

AGG Arginin STOP

AGA Arginin STOP

Ada tiga jenis mutasi yang dapat tejadi pada DNA mitokondria, yaitu substitusi,

delesi, dan inseri. Substitusi terjadi ketika ada perubahan basa pada nukleotida.

Substitusi terbagi menjadi dua jenis, yaitu (1) substitusi transisi, yaitu perubahan

nukleotida menjadi nukleotida lain yang jenis basanya sama, dari purin menjadi

purin atau dari pirimidin menjadi pirimidin, misalnya A � G, C � T, dan

sebaliknya, (2) substitusi transverse, yaitu perubahan nukleotida menjadi

nukleotida lain yang jenis basanya berbeda, dari purin menjadi pirimidin atau

sebaliknya, misalnya dari A � C dan C � G. Insersi terjadi akibat adanya

penyisipan nukleotida, sedangkan delesi terjadi akibat adanya pengurangan

nukleotida.

DNA polimerase untuk replikasi DNA mitokondria adalah DNA polimerase �

yang tidak mempunyai aktivitas proofreading (eksonuklease). Tidak adanya

aktivitas ini menyebabkan mtDNA tidak memiliki sistem perbaikan yang dapat

menghilangkan kesalahan replikasi. Replikasi mtDNA yang tidak selalu akurat ini

akan menyebabkan mutasi mudah terjadi. Mutasi ini akan diturunkan dari satu

generasi ke generasi selanjutnya sehingga semakin jauh hubungan kekerabatan

antara dua individu, makin besar pula jumlah perbedaan mutasi. Variasi basa atau

polimorfisme yang disebabkan oleh mutasi ini disebut dengan Single Nucleotide

17

Polymorphism (SNP). SNP, yang dapat terjadi pada daerah pengkode (coding

region) maupun daerah bukan pengkode (noncoding region), misalnya pada

daerah D-loop, dapat digunakan untuk membedakan satu individu dengan

individu lain.

II.3 Polymerase Chain Reaction

PCR merupakan teknik in vitro untuk DNA yang dibatasi oleh sepasang primer

(oligonukleotida pendek) menggunakan enzim 17 DNA polimerase dan dNTP

sebagai monomernya [Newton dan Graham, 1997; Innis dan Gelfand, 1990]. Pada

umumnya proses PCR berlangsung dalam tiga tahap yaitu: (1). Denaturasi, yaitu

pemisahan DNA untai ganda menjadi untai tunggal karena terjadi pemutusan

ikatan hidrogen basa-basanya pada suhu tinggi (94-96 °C). (2). Annealing, yaitu

tahap penempelan primer pada templat DNA. Suhu annealing dapat dihitung

berdasarkan nilai melting temperatur (Tm) dari primer-primer yang digunakan.

(3). Extension, yaitu tahap reaksi polimerisasi oleh enzim DNA polimerase

menggunakan dNTP sebagai monomernya dan dimulai dari ujung 3’ primer

sepanjang DNA templatnya hingga terbentuk untai DNA baru. Tahap ini

berlangsung pada temperatur saat enzim DNA polimerase bekerja optimal. Waktu

yang dibutuhkan pada tahap ekstensi tergantung pada panjang fragmen yang

diamplifikasi dan kecepatan reaksi (processity) dari enzim DNA polimerase yang

digunakan [Cheng dan Kolmodin, 1997]. Ketiga tahap tersebut merupakan siklus

yang berlangsung secara terus menerus. Untuk menghasilkan produk yang banyak

dibutuhkan sekitar 25-30 siklus. Secara teori jumlah fragmen DNA yang

dihasilkan selama n siklus PCR dirumuskan dengan (2n

– 2n)x, dimana n = jumlah

siklus, dan x = jumlah templat DNA [Newton dan Graham, 1997; Innis dan

Gelfand, 1990].

II.4 Direct Sequencing dengan Metode Dideoksi-Sanger

Direct sequencing adalah proses sekuensing menggunakan templat DNA hasil

PCR secara langsung tanpa melalui proses kloning. Dideoksi Sanger adalah

metode penentuan urutan nukleotida yang didasarkan pada terminasi basa spesifik

saat dilakukan sintesis DNA secara in vitro oleh enzim DNA polimerase

18

menggunakan satu primer. Basa spesifik yang digunakan adalah ddNTP yaitu

dideoksinukleosida trifosfat yang tidak memiliki gugus hidroksil pada karbon

3’nya. Hilangnya gugus hidroksil ini menyebabkan DNA polimerase tidak dapat

membentuk ikatan fosfodiester dengan dNTP atau ddNTP berikutnya, sehingga

terjadi proses terminasi sintesis rantai DNA setelah reaksi dengan ddNTP.

Terminasi berlangsung secara acak sehingga dihasilkan untai DNA yang

panjangnya berbeda [Newton dan Graham, 1997]. Elektroforesis gel

poliakrilamida berfungsi untuk memisahkan masing-masing fragmen berdasarkan

ukuran nukleotidanya. 18 Detektor akan mendeteksi masing-masing fragmen

berlabel dengan bantuan program komputer sehingga akhirnya bisa disusun urutan

nukleotidanya.

Beberapa faktor mempengaruhi kualitas hasil sekuensing yaitu jumlah templat

DNA, kemurnian DNA, kualitas primer, serta kontaminan seperti EDTA, fenol,

dan kadar garam yang tinggi. EDTA pada konsentrasi di atas 0,5 mM dapat

mengganggu ion Mg2+

sebagai kofaktor enzim DNA polimerase. Adanya fenol

dapat mengganggu dye fluorescent. Konsentrasi garam yang tinggi dapat

menginhibisi enzim [Robertson, 1996]. Direct sequencing telah banyak digunakan

dalam berbagai bidang penelitian misalnya bidang forensik, antropologi, dan

medis.