2

TINJAUAN PUSTAKA

Biohidrogen

Hidrogen berasal dari bahasa Yunani,

hydro yang berarti air, dan genes yang berarti

pembentukan. Hidrogen merupakan unsur terbanyak dari semua unsur yang ada di alam

semesta. Unsur ini diperkirakan membentuk

komposisi lebih dari 90 % atom-atom di alam

semesta. Hidrogen merupakan unsur yang

bebas, gas paling ringan, dan dapat

berkombinasi dengan elemen lain. Keadaan

normal pada suhu ruang, gas hidrogen terdiri

dari 25 % para-hidrogen dan 75 % ortho-

hidrogen (Mohsin 2004).

Hidrogen dapat dihasilkan melalui:

elektrolisis air, reformasi termokatalitik terhadap senyawa organik yang kaya

kandungan H2, dan proses biologi. Reformasi

terhadap gas alam, gasifikasi batu bara, dan

elektrolisis air membutuhkan energi yang

sangat banyak dan tidak ramah lingkungan

(Mahyudin & Koesnandar 2006).

Biohidrogen adalah hidrogen yang

diproduksi melalui proses biologi dan

menggunakan bahan-bahan biologis. Proses

produksi hidrogen secara biologi

membutuhkan energi lebih sedikit daripada

cara kimia atau elektrokimia. Produksi biohidrogen dapat menggunakan mikrob dari

berbagai taksa dan tipe fisiologi. Mikrob

tersebut dapat memproduksi melalui proses

bioteknologi dengan dua cara yaitu proses

fermentasi secara anaerobik atau aerobik

(Mahyudin & Koesnandar 2006).

Gas hidrogen mempunyai kandungan

energi tertinggi di antara beberapa bahan

bakar, yaitu 143 Gjton-1 per unitnya (Boyles

1984, diacu dalam Mahyudin & Koesnandar

2006). Pembakaran hidrogen tidak menghasilkan emisi karbon yang memberikan

kontribusi pada polusi lingkungan dan

perubahan iklim, sehingga tidak menimbulkan

efek rumah kaca, penipisan lapisan ozon, atau

hujan asam. Hasil pembakaran hidrogen di

udara hanya menyisakan uap air dan energi

panas (Mahyudin & Koesnandar 2006).

Fermentasi

Fermentasi berasal dari bahasa Latin

fervere yang berarti merebus (to boil). Arti

kata dari bahasa Latin tersebut dapat dikaitkan dengan kondisi cairan bergelembung atau

mendidih. Keadaan ini disebabkan adanya

aktivitas ragi pada ekstraksi buah-buahan atau

biji-bijian. Gelembung-gelembung karbon-

dioksida merupakan hasil katabolisme

anaerobik terhadap gula yang terkandung

dalam ekstrak buah-buahan atau biji-bijian.

Berdasarkan historinya, fermentasi berasal

dari kata ferment, yang merupakan istilah

yang digunakan oleh Louis Pasteur untuk

menyebutkan senyawa yang berperan dalam

proses fermentasi. Ternyata senyawa tersebut

adalah enzim yang berperan dalam fermentasi

gula menjadi etanol dan karbondioksida

(Nelson & Cox 2004). Proses fermentasi

pada mulanya diartikan sebagai proses

pemecahan karbohidrat menjadi alkohol dan karbondioksida. Tetapi fermentasi tidak selalu

menggunakan karbohidrat sebagai susbtrat

(Winarno et al. 1980).

Fermentasi memiliki arti yang berbeda

bagi ahli biokimia dan mikrobiologi industri.

Arti fermentasi pada bidang biokimia

dihubungkan dengan pembangkitan energi

oleh penguraian senyawa organik. Pada

bidang mikrobiologi industri, fermentasi

memiliki arti yang lebih luas, yang

menggambarkan setiap proses untuk menghasilkan produk dari pembiakan

mikroorganisme (Sumarsih 2007). Pada

prinsipnya, fermentasi adalah proses

perubahan substrat organik yang kompleks

menjadi komponen yang lebih sederhana

dengan adanya aktivitas enzim dan mikrob

dalam keadaan yang terkontrol (Kim & Gadd

2008).

Fermentasi terjadi sebagai hasil

metabolisme tipe anaerobik, yang mana

mikrob dapat mencerna glukosa sebagai bahan baku energinya tanpa adanya oksigen,

dan sebagai hasilnya hanya sebagian glukosa

yang dipecah dan menghasilkan sejumlah

kecil energi, karbon-dioksida, air, dan produk

akhir metabolisme lainnya (Nelson & Cox

2004). Fermentasi dalam proses bioteknologi

merupakan bagian penting dari pemanfaatan

mikrob untuk mengubah substrat menjadi

produk yang diinginkan dengan

pengkondisian sistem, seperti temperatur, pH,

oksigen terlarut, dan lain-lain (Suwandi

2009). Tiga jenis sistem fermentasi dalam proses

bioteknologi, yaitu sistem diskontinyu

(batch), kontinyu, dan semikontinyu (fed-

batch). Sistem fermentasi diskontinyu

dilakukan pemberian medium, nutrisi, dan

bakteri pada awal fermentasi.

Mikroorganisme dan sintesis produk

berlangsung dalam media, kemudian setelah

sintesis produk maksimum, semua substrat

diambil bersamaan dan dilakukan proses

isolasi produk. Pada sistem kontinyu, pemberian medium, nutrisi, serta pengeluaran

sejumlah fraksi dari volume kultur terjadi

3

secara terus-menerus. Sistem semikontinyu

adalah sistem fermentasi yang substratnya

ditambahkan secara kontinyu selama

fermentasi berlangsung tanpa mengeluarkan

sesuatu dari sistem (Suwandi 2009).

Mikroorganisme Penghasil Gas Hidrogen

Mikroorganisme yang dapat menghasilkan

hidrogen terdiri atas tiga jenis, yaitu:

sianobakteria, bakteri anaerob, dan bakteri

fotosintetik. Sianobakteria merupakan mikroorganisme yang memproduksi hidrogen

dengan cara fotosintesis, yaitu memecah air

menjadi hidrogen dan oksigen. Sianobakteria

dapat mengkonversi langsung energi cahaya

menjadi energi kimia sehingga tidak

membutuhkan akumulasi radiasi bahan bakar

atau substansi organik dalam media bakteri

(Sirait 2007). Kelemahan organisme ini dalam

memproduksi hidrogen adalah proses

produksi hidrogen lambat, sistem reaksinya

membutuhkan energi yang besar, dan membutuhkan penanganan khusus untuk

memisahkan gas hidrogen dan oksigen

(Zaborsky et al. 1998).

Bakteri anaerob menggunakan substansi

organik sebagai sumber elektron dan energi

tunggal, serta mengkonversinya menjadi

hidrogen. Reaksinya cepat dan prosesnya

tidak memerlukan bahan bakar sehingga

membuat bakteri ini berguna bagi skala besar

limbah cair. Namun, bakteri ini memiliki

kelemahan dalam memproduksi gas hidrogen, yaitu hasil dekomposisi atau penguraian

senyawa organik menghasilkan asam-asam

organik (asam asetat, asam butirat, dan lain-

lain). Asam organik tersebut menimbulkan

masalah baru bila tujuan dari produksi adalah

untuk menanggulangi limbah (Zaborsky et al.

1998).

Bakteri fotosintetik memiliki sistem di

antara bakteri anaerob dengan sianobakteria

untuk menghasilkan hidrogen. Bakteri ini

memiliki kemampuan dalam mengkonversi

substansi organik menjadi hidrogen dengan laju yang cukup tinggi, namun juga

menggunakan cahaya dalam membantu reaksi

pembentukan hidrogen. Energi cahaya yang

dibutuhkan untuk memproduksi hidrogen

lebih kecil karena peran senyawa organik.

Senyawa organik yang dapat digunakan oleh

bakteri ini adalah gula, laktat, asam lemak,

tepung, selulosa, limbah organik dan lain-lain.

Bakteri fotosintetik yang dapat memproduksi

hidrogen antara lain Rhodopseudomonas,

Rhodobacter, Anabaena, Chlamydomonas, Chromatium, dan Thiochapsa (Zaborsky et al.

1998).

Rhodobium marinum (ATCC 35675)

merupakan salah satu bakteri fotosintetik

yang dapat memproduksi hidrogen.

Rhodopseudomonas marina atau lebih dikenal

dengan nama Rhodobium marinum

merupakan bakteri fotosintetik ungu

nonsulfur, yaitu bakteri yang dapat

menggunakan sulfida sebagai donor elektron,

tetapi tidak bisa tumbuh pada konsentrasi

sulfida yang tinggi. Selnya berbentuk batang,

gram negatif, bergerak, memproduksi warna pink ke merah, fotoheterotrof fakultatif

anaerob dan dapat melakukan reproduksi

melalui budding (kuncup). Bakteri ini

diisolasi dari air laut pada tahun 1995

(Hiraishi 1995).

Produksi Biohidrogen

Produksi biohidrogen oleh mikrob dapat

dilakukan dengan dua cara, yaitu perubahan

secara fotobiologis dan teknik fermentasi.

Teknik yang pertama hanya dapat dilakukan pada siang hari yaitu ketika adanya matahari.

Hal ini dikarenakan mikrob fotosintetik

menggunakan energi dari sinar matahari

sebagai sumber energi mereka. Teknik yang

kedua dapat berlangsung pada siang maupun

malam hari (dalam keadaan gelap). Produksi

hidrogen yang dilakukan dalam penelitian ini

menggunakan teknik fotofermentasi untuk

menghasilkan hidrogen yang optimal.

Produksi hidrogen dengan fotofermentasi

oleh bakteri fotosintetik membutuhkan energi cahaya dan senyawa organik. Energi cahaya

oleh bakteri fotosintetik akan dikonversi

menjadi energi potensial elektron kemudian

membentuk ATP. Dalam proses berikutnya,

elektron dinaikkan atau ditransfer untuk

mereduksi feredoksin yang merupakan

pembawa elektron ke nitrogenase (enzim

yang dapat memproduksi hidrogen). Produk

ATP disuplai ke enzim tersebut bersamaan

dengan pembawa elektron. Nitrogenase

memerlukan ATP dan 2 Fdred untuk

menghasilkan hidrogen. Foton mengaktifkan fotosistem di pusat reaksi untuk memompa

proton. Proton ditransfer bersamaan dengan

penghasilan ATP. Dua sampai tiga proton

digunakan untuk memberikan ATP (Zaborsky

et al. 1998).

Produksi biohidrogen oleh R. marinum

melibatkan enzim nitrogenase. Reaksi yang

terjadi pada enzim nitrogenase adalah sebagai

berikut:

2H+ + 2 Fdred + 4 ATP H2 + 2 Fdoks +

4ADP + 4 Pi. Reaksi tersebut berlangsung jika terdapat

cahaya, tetapi tidak terdapat oksigen, dan

4

dalam kondisi nitrogen terbatas. R. marinum

memperoleh elektron dari senyawa organik

untuk mereduksi proton menjadi molekul

hidrogen. Jika molekul nitrogen tidak ada,

enzim nitrogenase akan mereduksi proton

menjadi gas hidrogen yang dibantu dengan

energi dalam bentuk ATP dan elektron yang

diperoleh dari feredoksin. Dalam proses

fotosistem bakteri ini, tidak terbentuk oksigen

sehingga tidak menghambat kerja enzim

nitrogenase mengingat enzim nitrogenase sensitif terhadap oksigen (Akkerman 2002).

Enzim Penghasil Hidrogen

Proses produksi hidrogen secara biologi

bergantung pada keberadaan enzim penghasil

hidrogen. Bakteri fotosintetik ungu nonsulfur,

memiliki enzim yang dapat memproduksi

hidrogen yaitu nitrogenase dan hidrogenase.

Enzim hidrogenase memiliki kemampuan

memproduksi sekaligus dapat mengkonsumsi

hidrogen yang telah dihasilkan. Secara umum sifat hidrogenase dapat dikatakan sebagai

metabolik antagonis dari nitrogenase

(Tamagnini et al. 2002).

Nitrogenase merupakan kompleks

enzimatik yang dapat memfiksasi nitrogen di

udara. Kompleks nitrogenase berada bebas di

dalam organisme yang memfiksasi nitrogen

dan juga berada di dalam bakteri yang

memfiksasi nitrogen. Berikut persamaan

reaksi pembentukan amonia dari fiksasi

nitrogen : N2 + 8H

+ + 8e- + 16 ATP 2NH3 + H2 +

16 ADP + 16 Pi.

Reduksi nitrogen menjadi amonia merupakan

reaksi endergonik yang memerlukan energi

metabolisme tinggi dalam bentuk ATP.

Amonia dibentuk pada proses ini ditambatkan

ke dalam asam amino glutamat dan glutamin

serta asam nukleat (Tamagnini et al. 2002).

Kompleks nitrogenase mengandung 2 tipe

protein, yaitu dinitrogenase (protein MoFe

atau protein 1 atau protein pertama), dan

dinitrogenase reduktase (protein Fe atau protein kedua). Protein MoFe memiliki berat

molekul (BM) 220-240 kDa. Protein ini

merupakan heterotetramer 22 yang

mengandung 28 ion Molibdenum sebagai

kofaktor, (Tamagnini et al. 2002). Protein

MoFe mengandung dua set kelompok logam

unik : kelas P ([8Fe-7S]) yang menjembatani

antara masing-masing pasangan subunit ,

dan kofaktor FeMo (FeMoco) yang berlokasi

di dalam subunit (Hu et al. 2006).

Protein Fe memiliki BM 60-70 kDa, dibentuk dari 2 subunit yang mengandung 8

atom Fe sebagai kofaktor, dan berperan

spesifik dalam mediasi transfer elektron dari

donor elektron luar (feredoksin atau

flavodoksin) ke dinitrogenase (Tamagnini et

al. 2002). Homodimer protein Fe yang

dienkodekan oleh nifH mengandung dua situs

penempelan nukleotida (satu per subunit) dan

satu kelas [4Fe-4S] pada antarmuka dimer.

Bersamaan dengan hidrolisis ATP oleh

protein Fe, elektron ditransfer berturut-turut

dari kelas [4Fe-4S] di dalam protein Fe

melalui kelas P di dalam protein MoFe ke FeMoco, yang mana terjadi reduksi substrat.

Protein Fe juga penting untuk perakitan dari

komplek kelas di dalam protein MoFe. Delesi

gen nifH yang mengenkodekan protein Fe

menghasilkan pembentukan protein MoFe

dengan kelas P terganggu atau prekursor

fragmen yang terdiri atas [4Fe-4S] seperti

kelas P akan terganggu, mengindikasikan

bahwa protein Fe mungkin memfasilitasi

penggabungan fragmen-fragmen ini menjadi

bentuk rakitan penuh [8Fe-7S] kelas P (Hu et al. 2006). Kofaktor logam baik Fe maupun

Mo meletakkan nitrogen di dalam posisi yang

mudah untuk dikonversi menjadi amonia.

Kedua protein tersebut bersama-sama

memfiksasi nitrogen di udara. Nitrogenase

sangat sensitif terhadap oksigen. Oksigen

dapat menginaktivasi aktivitas nitrogenase

(Tamagnini et al. 2002).

Hidrogenase merupakan enzim yang

mengkatalisis oksidasi reversibel dari H2

menjadi proton. Beberapa mikroorganisme menggunakan enzim ini dengan tujuan yang

berbeda-beda. Banyak bakteri dan arkaea

dapat menggunakan hidrogen sebagai sumber

elektronnya dengan bantuan hidrogenase.

Beberapa bakteri fermentatif dan alga hijau

menggunakan hidrogenase untuk melepas

kelebihan power reduksi dengan mereduksi

proton menjadi hidrogen, dan bakteri

pemfiksasi nitrogen menggunakan

hidrogenase untuk menangkap kembali

hidrogen yang telah diproduksi oleh

nitrogenase (Lindberg 2003). Hidrogenase dibagi menjadi tiga kelas

berdasarkan filogenetik, yaitu [Fe]-

hidrogenase, [NiFe]-hidrogenase, dan logam

bebas-hidrogenase (Linberg 2003).

Berdasarkan komponen logam dari sisi aktif

yang menempel atau membebaskan H2,

hidrogenase terbagi atas 3 kelas yaitu [NiFe]-,

[FeFe]-, dan [Fe] hidrogenase (Stripp et al.

2009).

Hidrogenase berpotensi sebagai katalis

dalam menghasilkan bahan bakar sel, menyediakan potensial elektron rendah untuk

digunakan dalam reaksi reduksi, dan

5

fotogenerasi H2 secara enzimatik. Reaksi

terjadi pada sisi aktif bimetalik yang terdiri

atas atom Fe ([FeFe]-hidrogenase) atau Ni

dan Fe ([NiFe]-hidrogenase), dikoordinasikan

oleh ligan CO dan CN- (Stripp et al. 2009).

[NiFe]-hidrogenase merupakan heterodimer

dengan sisi aktif mengandung 2 subunit besar

dan sistem penyaluran elektron kelas [FeS]

yang melalui subunit kecil. Ukuran subunit

besar dan kecil cenderung konsisten, masing-

masing 60 kDa dan 30 kDa. Kelas [FeS] menyediakan sistem penyaluran transfer

elektron yang mengizinkan loncatan elektron

melewati matriks protein. Saluran uap

menyediakan jalur untuk H2 dalam melintasi

antara sisi aktif dan bagian eksterior protein,

dan sejumlah residu yang mudah

dideprotonasi pada jalur transfer proton

(Linberg 2003).

Pengaruh Cahaya pada Produksi Hidrogen

Cahaya merupakan salah satu parameter penting yang dibutuhkan dalam produksi

hidrogen oleh bakteri fotosintetik.

Penggunaan cahaya secara optimal oleh

bakteri sangat penting dalam menghasilkan

hidrogen yang maksimal. Berbagai jenis

cahaya memiliki intensitas dan panjang

gelombang yang berbeda-beda. Efektivitas

spektrum warna yang berbeda-beda dari

cahaya tampak akan menaikkan hasil

fotosintesis. Bila spektrum sesuai dengan

pigmen fotosintesis maka serapan terhadap cahaya akan meningkatkan hasil fotosintesis

(Nelson & Coxx 2004). Pada kondisi

anaerobik di bawah pencahayaan, aparatus

fotosintetik bakteri akan mengkonversi energi

cahaya menjadi ATP. Jumlah cahaya yang

diterima oleh pigmen antena bakteri akan

menentukan tahap eksitasi dan transfer

elektron pada proses fotofermentasi

(Akkerman 2002).

Produksi hidrogen yang dikatalisis oleh

nitrogenase juga bergantung pada proporsi

intensitas cahaya (Koku et al. 2002). Berdasarkan hasil penelitian Roh et al.

(2004), pada Rhodobacter sphaeroides

intensitas cahaya menentukan level dan

jumlah seluler Intacytoplsmic Membrane

(ICM). Sistem ICM ini merupakan sistem

yang mendirikan aparatus fotosintetik dan

memiliki komponen penting, seperti:

penangkap energi cahaya, transfer elektron,

serta transduksi energi.

Menurut Koku et al. (2002), pengaruh

cahaya pada bakteri fotosintetik akan mengendalikan sintesis aparatus fotosintetik.

Dalam keadaan anaerobik, sejumlah vesikel

membran fotosintetik dihasilkan bervariasi

berlawanan dengan intensitas cahaya.

Konversi energi cahaya juga berhubungan

dengan kesesuaian pigmen yang ada. Bila

cahaya tertentu diserap oleh pigmen yang

sesuai mungkin akan meningkatkan efisiensi

penggunaan cahaya oleh bakteri. Perbedaan

intensitas cahaya dan pergantian periode

terang dan gelap akan mempengaruhi

aktivitas nitrogenase dalam memproduksi

hidrogen. Intensitas cahaya juga berperan penting

dalam pertumbuhan bakteri fotosintetik. Pada

R. sphaeroides, intensitas cahaya yang tinggi

akan meningkatkan pertumbuhan dan

sebaliknya intensitas cahaya menurun, maka

pertumbuhan menurun. Pertumbuhan tertinggi

tidak selalu terdapat pada pemberian

intensitas cahaya yang tertinggi (Akose 2008).

Pertumbuhan Mikrob

Pertumbuhan adalah penambahan mikrob secara teratur semua komponen sel suatu

jasad. Pertumbuhan dapat diamati dari

meningkatnya jumlah sel atau massa sel (berat

kering sel). Pada umumnya bakteri dapat

memperbanyak diri dengan pembelahan

binner, yaitu satu sel membelah menjadi 2 sel

baru. Waktu yang diperlukan untuk membelah

diri dari satu sel menjadi dua sel sempurna

disebut waktu generasi. Kecepatan

pertumbuhan merupakan perubahan jumlah

atau massa sel per unit waktu. Pertumbuhan dapat diukur dari perubahan jumlah sel atau

berat kering massa sel. Jumlah total sel

mikrob dapat ditetapkan langsung dengan

pengamatan mikroskopis dan diamati dengan

menggunakan metode ruang hitung (counting

chamber). Jumlah sel hidup dapat ditetapkan

dengan metode plate count.

Pertumbuhan sel dapat diukur dari massa

sel dan secara tidak langsung dengan

mengukur turbiditas cairan medium tumbuh.

Turbiditas dapat diukur menggunakan alat

fotometer, semakin pekat atau semakin banyak populasi mikrob maka cahaya yang

diteruskan semakin sedikit. Turbiditas juga

dapat diukur menggunakan spektrofotometer

dengan nilai yang diketahui berupa Optical

Density (OD). Unit fotometer atau optical

density proporsional dengan massa sel dan

juga jumlah sel.

Suatu bakteri yang dimasukkan ke dalam

medium baru yang sesuai akan tumbuh

memperbanyak diri. Jika pada waktu-waktu

tertentu jumlah bakteri dihitung atau diukur dan dibuat grafik hubungan antara jumlah

bakteri dengan waktu , maka akan diperoleh

6

suatu grafik atau kurva pertumbuhan.

Pertumbuhan populasi mikrob dibedakan

menjadi dua, yaitu biakan sistem tertutup

(batch culture) dan biakan sistem terbuka

(continous culture).

Biakan sistem tertutup memerlukan

pengamatan jumlah sel dalam waktu yang

cukup lama untuk memberikan gambaran

berdasarkan kurva pertumbuhan bahwa

terdapat fase-fase pertumbuhan. Fase

pertumbuhan dimulai pada fase permulaan, fase pertumbuhan yang dipercepat, fase

pertumbuhan logaritma (eksponensial), fase

pertumbuhan yang mulai dihambat, fase

stasioner maksimum, fase kematian yang

dipercepat, dan fase kematian logaritma.

Fase permulaan ditandai dengan bakteri

baru menyesuaikan diri dengan lingkungan

yang baru, sehingga sel belum membelah diri.

Sel mikrob mulai membelah diri pada fase

pertumbuhan yang dipercepat, tetapi waktu

generasinya masih panjang. Fase permulaan sampai fase pertumbuhan dipercepat disebut

lag phase. Sel membelah diri paling cepat

terdapat pada fase pertumbuhan logaritma

atau pertumbuhan eksponensial, dengan

waktu generasi yang pendek dan konstan.

Selama fase logaritma, metabolisme sel paling

aktif, sintesis bahan sel sangat cepat dengan

jumlah konstan sampai nutrien habis atau

terjadinya penimbunan hasil metabolisme

yang menyebabkan terhambatnya

pertumbuhan. Fase pertumbuhan yang mulai terhambat

ditandai dengan berkurangnya kecepatan

pembelahan sel dan jumlah sel yang mati

mulai bertambah. Pada fase stasioner,

maksimum jumlah sel yang mati semakin

meningkat sampai terjadi jumlah sel hidup

hasil pembelahan sama dengan jumlah sel

yang mati, sehingga jumlah sel hidup

konstan, seolah-olah tidak terjadi

pertumbuhan. Pada fase kematian yang

dipercepat, kecepatan kematian sel terus

meningkat, sedangkan kecepatan pembelahan sel nol, sampai pada fase kematian logaritma

maka kecepatan kematian sel mencapai

maksimal, sehingga jumlah sel hidup

menurun dengan cepat seperti deret ukur.

Namun, penurunan jumlah sel hidup tidak

mencapai nol, dalam jumlah minimum

tertentu sel mikrob akan tetap bertahan sangat

lama dalam medium (Sumarsih 2007).

Kromatografi Gas

Kromatografi gas merupakan metode

separasi sampel yang dapat memisahkan

komponen-komponen sampel di antara dua

fase, yaitu fase diam dengan luas area yang

besar, dan fase gerak berupa gas yang

mengalir melewati fase diam. Pada proses

elusi, sampel diuapkan dan dibawa oleh gas

pembawa (fase gerak gas) melewati kolom.

Sampel dibagi ke dalam fase diam cair

berdasarkan kelarutannya pada temperatur

yang diberikan. Komponen-komponen sampel

memisah dari yang lain berdasarkan tekanan

uap relatif dan afinitas terhadap fase diam

(Mcnair & Miller 1998). Berdasarkan fase diam yang digunakan,

kromatografi gas dibagi menjadi 2 jenis, yaitu

kromatografi gas-padat dan kromatografi gas-

cair. Metode separasi dengan kromatografi

gas memiliki beberapa keuntungan, di

antaranya adalah 1) Analisis cepat, dalam

beberapa menit. 2) Efisen karena

menghasilkan resolusi yang tinggi, 3) Sensitif

karena deteksi dalam ppm atau sering juga

ppb, 4) Tidak dekstruktif, sehingga bisa

digabung dengan spektroskopi massa (GCMS), 5) Keakuratan tinggi dalam analisis

kuantitatif, 6) Sampel yang digunakan sangat

sedikit (dalam mikro), 7) Dan murah. Namun,

kromatografi gas ini juga memiliki

keterbatasan, yaitu terbatas untuk sampel

volatil, tidak cocok untuk sampel yang tidak

tahan panas, sulit bagi sampel preparatif atau

sampel yang banyak, dan memerlukan

spektroskopi untuk mengidentifikasi puncak

hasil kromatografi gas. (Mcnair & Miller

1998) Bagian-bagian dasar gas kromatografi

secara sederhana di antaranya adalah gas

pembawa, kontrol laju alir, injektor, kolom,

detektor, dan sistem data. Bagian utama dari

kromatografi adalah kolom. Kolom

merupakan tabung yang berisi sokongan inert

untuk fase diam cair yang dilapiskan. Kolom

yang sering digunakan saat ini adalah yang

dibuat dari leburan silika dan tabung terbuka

dengan dimensi kapiler. Gas pembawa

berfungsi untuk membawa sampel melewati

kolom. Gas pembawa merupakan fase gerak yang inert dan terdiri dari berbagai jenis yang

memiliki kecocokan berbeda-beda untuk

berbagai detektor. Kolom kromatografi

dipaket secata kuat dengan fase diam pada

pendukung padat inert (Mcnair & Miller

1998).

Temperatur lubang injeksi hendaknya

cukup untuk menguapkan sampel dengan

cepat sehingga tidak mengurangi efisiensi

hasil. Pada injeksi penguapan cepat,

temperatur lubang injeksi sekitar 50C lebih panas dari titik leleh sampel. Temperatur

kolom sebaiknya cukup panas, biasanya tidak

7

lebih tinggi dari titik leleh sampel.

Temperatur untuk detektor diatur berdasarkan

detektor yang dipakai (Mcnair & Miller

1998).

Detektor sangat sensitif terhadap keluaran

dari kolom dan mencatat keluaran dalam

bentuk kromatogram. Sinyal detektor sesuai

terhadap jumlah analit sehingga data dapat

digunakan untuk analisis kuantitatif. Detektor

yang paling umum adalah flame ionization

detector (FID). FID merupakan detektor yang memiliki sensitivitas tinggi, linearitas, dan

murah. Beberapa detektor lain adalah thermal

conductivity detector (TCD), electron capture

detector (ECD) (Mcnair & Miller 1998).

Sistem data umumnya terdiri atas 2 jenis,

yaitu integrator dan komputer. Pada integrator

berbasis mikroprosesor, mikroprosesor

didedikasikan dengan konventer analog ke

digital untuk menghasilkan kromatrogram dan

data analisis kuantitatif. Algoritma dipakai

untuk mendukung fungsi tersebut. Komputer memiliki fleksibilitas paling besar dalam

mendapatkan data, mengontrol alat,

mereduksi data, menampilkan dan

mentransfer ke alat lain. Komputer lebih

sering digunakan karena memorinya besar,

pemrosesan cepat, dan fleksibel untuk

antarmuka pengguna (Mcnair & Miller 1998).

Cara kerja kromatografi secara

keseluruhan dan sederhana yaitu, gas

pembawa yang inert mengalir secara kontinyu

dari tabung silinder gas masuk ke lubang injeksi, kemudian ke kolom, dan detektor.

Laju alir gas pembawa ini dikontrol untuk

menghasilkan waktu retensi yang tepat dan

meminimalkan gangguan. Selanjutnya,

sampel diinjeksi ke dalam lubang injeksi yang

panas, diuapkan dan dibawa ke dalam kolom.

Sampel terpartisi antara fase diam dan fase

gerak, kemudian pemisahan komponen

masing-masing berdasarkan kelarutan relatif

dalam fase diam cair dan tekanan uap relatif.

Setelah melewati kolom, gas pembawa dan

sampel melalui detektor sehingga dihasilkan sinyal-sinyal listrik yang kemudian

dikirimkan ke sistem data atau sistem pencatat

dan terakhir dihasilkan kromatogram. Sistem

pencatatan data secara otomatis melaporkan

luas puncak, kalkulasi bentuk, data kuantitatif,

dan waktu retensi (Mcnair & Miller 1998).

BAHAN DAN METODE

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian

ini adalah tabung ulir, botol Schott 1000 ml,

botol serum 100 ml, gelas kimia, pipet mikro,

pipet pasteur, syringe (5 ml dan 50 ml), rak

tabung, selang, shaker, inkubator bergoyang,

neraca analitik, neraca timbang, vortex,

mikrosentrifus dan sentrifus RC26 rotor

GSA. Alat yang digunakan untuk

pencahayaan, yaitu lampu berwarna merah,

kuning, biru, dan lampu ultraviolet (UV).

Selain itu, alat analisis yang digunakan adalah

alat pengukur panjang gelombang lampu

USB2000 Vis-NIR Spectrophotometer, pH

indikator universal, spektrofotometer UV-VIS pharmaspec 1700, sensor hidrogen H2 scan

model 2240 dan kromatografi gas (GC) HP

5890.

Bahan mikrob yang digunakan adalah

biakan bakteri fotosintetik Rhodobium

marinum NBRC No. 100434. Bahan yang

digunakan dalam pembuatan media bakteri

adalah akuades, dinatrium suksinat, D-

glukosa (Merck), ekstrak khamir, K2HPO4,

KH2PO4, EDTA.2Na, H3BO3, Na2MoO4.

2H2O, ZnSO4.7H2O, MnCl2, Cu(Mo3)2. 3H2O, FeSO4. 7H2O, CaCl2. 2H2O, Mg SO4. 7 H2O ,

larutan NaOH 1 N, larutan HCl 2 N, gas N2,

natrium hidrogen karbonat, dan vitamin B12.

Bahan kimia yang digunakan untuk analisis

kadar glukosa adalah glukosa kit merk

WAKO. Bahan yang digunakan untuk analisis

H2 dengan GC , yaitu gas N2.

Metode

Pembuatan Media Pembibitan R. marinum

(Media Modifikasi Fotosintetik) Media R. marinum dibuat dengan

komposisi sebagai berikut : 10 gram

dinatrium suksinat, 0.3 gram ekstrak khamir

ditimbang menggunakan neraca analitik

kemudian dimasukkan ke dalam botol Schott,

10 ml Bassal medium 100x (K2HPO4 = 750

mg, KH2PO4 = 850 mg, EDTA.2Na = 2 mg,

H3BO3 = 2,8 mg, Na2MoO4. 2H2O = 0,75 mg,

ZnSO4. 7 H2O = 0,24 mg, MnCl2 = 2,1 mg,

Cu(Mo3)2. 3H2O = 0,04 mg, FeSO4. 7H2O =

10 mg, CaCl2. 2H2O = 0,75 mg, Mg SO4. 7

H2O = 200 mg, dan 1 L akuades) dimasukkan ke dalam botol Schott lalu ditambahkan

akuades 1000 ml sambil diaduk.

Pengkondisian pH menjadi 6.8 dengan

menambahkan beberapa tetes NaOH 2 N atau

HCl 2 N. Untuk menghilangkan oksigen

dalam media, dilakukan penambahan gas

nitrogen selama 1 jam. Setelah itu,

ditambahkan 1.5 g NaHCO3. Media

disterilisasi di dalam autoklaf dengan suhu

121C selama 15 menit. Media didinginkan

kemudian ditambahkan 5 ml vitamin B12 0.01 %. Penambahan vitamin ke dalam media

dilakukan di dalam laminar.