28

BAB 4

METODE PENELITIAN

4.1 Jenis penelitian

Jenis penelitian yang digunakan adalah true experimental dengan

rancangan post test only control group design. Metode yang digunakan

adalah uji dilusi tabung (tube dilution test) untuk mengetahui efek ekstrak

kulit pisang kepok (Musa paradisiaca L.) sebagai antibakteri dengan berbagai

konsentrasi terhadap pertumbuhan bakteri P.aeruginosa secara in vitro.

4.2 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biomedik Fakultas

Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang dengan estimasi waktu

selama 1 bulan.

4.3 Populasi dan Sampel Penelitian

4.3.1 Populasi

Populasi dalam penelitian ini adalah bakteri P. aeruginosa yang

diperoleh dari Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas

Muhammadiyah Malang.

4.3.2 Sampel

1 Sampel dalam penelitian ini adalah bakteri P. aeruginosa yang

diambil dengan menggunakan Simple Random Sampling.

28

26

29

4.3.2.1 Estimasi dan Jumlah Pengulangan

2 Penelitian menggunakan 8 kelompok perlakuan ekstrak kulit

pisang kepok, satu kelompok kontrol negatif dan satu kelompok kontrol

negatif, sehingga ada 10 kelompok. Jumlah sampel dari setiap kelompok

perlakuan dihitung dengan menggunakan rumus Federer, dengan p adalah

jumlah perlakuan dan n adalah jumlah pengulangan (Candrasari dkk, 2012).

3 ( p-1 ) ( n-1 ) ≥ 15

4

5 ( 10-1 ) ( n-1 ) ≥ 15

6 9 ( n-1) ≥ 15

7

8 9n – 9 ≥ 15

9

10 n ≥ 2,67 ≈ 3

11 Ket : p = jumlah perlakuan

12 n = jumlah ulangan yang diperlukan

13

Dari hasil perhitungan diatas, maka diperlukan tiga kali pengulangan

untuk sampel.

4.4 Variabel Penelitian

4.4.1 Variabel Bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah ekstrak kulit pisang kepok

dengan konsentrasi 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,12%, 1,56%, 0,78%, 0,39%

dan 2 kontrol yaitu kontrol negatif dan kontrol positif .

30

4.4.2 Variabel Tergantung

Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah jumlah koloni bakteri

P. aeruginosa dengan mengukur tingkat kekeruhan yang dihasilkan pada

media nutrient broth (KHM) dan jumlah koloni bakteri P. aeruginosa pada

Nutrient agar plate (KBM).

4.5 Definisi Operasional

1. Ekstrak kulit pisang kepok adalah kulit pisang kepok matang yang

diekstraksi menggunakan metode maserasi dengan pelarut metanol

kemudian dilakukan penyaringan untuk memisahkan filtrat dari ampas

selanjutnya diuapkan dengan rotatory evaporator sehingga dihasilkan

ektrak kulit pisang kepok yang bebas dari pelarut. Konsentrasi ekstrak

kulit pisang kepok yang digunakan pada penelitian ini yaitu 100%, 50%,

25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,56%, 0,78%, 0,39%. Skala variabel ini

adalah ordinal.

2. Pertumbuhan bakteri P. aeruginosa yaitu pertumbuhan bakteri yang

dilihat dengan menghitung jumlah koloni pada Nutrient Agar Plate

(NAP). Skala variabel ini adalah rasio.

3. Kadar Bunuh Minimal (KBM) adalah konsentrasi terendah ekstrak kulit

pisang kepok yang dapat membunuh bakteri P. aeruginosa, ditandai

dengan tidak terdapatnya pertumbuhan koloni P. aeruginosa pada NAP

atau pertumbuhan koloninya kurang dari 0,1% dari jumlah koloni

inokulum awal (original inoculum). Skala variabel untuk KBM adalah

rasio.

31

4. Kadar Hambat Minimal (KHM) adalah kadar atau konsentrasi minimal

ekstrak kulit pisang kepok yang mampu menghambat pertumbuhan

bakteri P. aeruginosa, ditentukan dengan cara membandingkan dengan

kontrol negatif sehingga bisa ditentukan ekstrak kulit pisang kepok yang

paling mendekati kontrol bahan. Skala variabel KHM adalah ordinal.

4.6 Instrumen Penelitian

4.6.1 Alat dan Bahan Pembuatan Media Nutrient Broth (NB)

1. Alat

o Erlenmeyer (gelas berskala)

o Hot plate

o Stirrer

2. Bahan

o Nutrient broth

o Aquades

4.6.2 Alat dan Bahan Pembuatan Nutrient Agar Plate (NAP)

1. Alat

o Cawan Petri

o Erlenmeyer (gelas berskala)

o Hot plate

o Stirrer

2. Bahan

o Nutrient Agar

o Aquades

32

4.6.3 Alat dan Bahan Identifikasi P. aeruginosa

1. Alat

o Ose

o Kertas penghisap

o Minyak imersi

o Mikroskop

o Gelas obyek

o Cotton bud

o Pipet

o Lampu spiritus

2. Bahan

o Aquades

o Isolat bakteri P. aeruginosa

o Pewarna gram (kristal violet, lugol, alkohol 96%, safranin)

o Medium pembenihan Nutrient Agar Plate (NAP)

o Bahan uji katalase (H2O2.)

4.6.4 Alat dan Bahan Uji Kepekaan Ekstrak Kulit Pisang Kepok (Musa

paradisiaca L.)

1. Alat

o Tabung reaksi steril

o Ose

o Mikropipet 1 ml

o Inkubator

33

o Lampu spirtus

o Label

o Vortex

o Colony counter

2. Bahan

o Perbenihan cair bakteri P. aeruginosa

o Ekstrak kulit pisang kepok

o Nutrient broth

o Nutrient Agar Plate (NAP)

4.7 Prosedur Penelitian

4.7.1 Sterelisasi Alat

Sterelisasi alat dilakukan dengan cara:

1. Mencuci semua peralatan dengan sabun hingga bersih dan

membiarkannya hingga kering.

2. Alat-alat yang dapat disterilkan dalam autoklaf dibungkus dengan kertas

dan dimasukan dalam autoklaf pada suhu 121oC dengan tekanan 15 atm

selama 15 menit. Sedang alat yang tidak dapat disterilkan dengan

autoklaf disterilkan dengan alkohol 70%.

4.7.2 Pembuatan Medium Nutrient Agar Plate

Nutrient agar plate dibuat dengan cara :

1. Nutrient agar sebanyak 20 gram, dilarutkan dengan 1000mL aquadest

pada Erlenmeyer.

2. Media dicampur sampai merata dengan cara pengadukan dan

34

pemanasan menggunakan hot plate dan stirrer.

3. Campuran media disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121°C dengan

tekanan 1 atm selama 15 menit

4. Media dituangkan ke dalam cawan petri steril masing-masing 10 mL

dan dibiarkan hingga memadat.

4.7.3 Pembuatan Medium Nutrient Broth

Nutrient Broth dibuat dengan cara:

a) Nutrient broth sebanyak 8 gram, dilarutkan dengan 1000 mL

aquadest pada Erlenmeyer.

b) Media dicampur sampai merata dengan cara pengadukan dan

pemanasan menggunakan hot plate dan stirrer.

c) Campuran media disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121°C

dengan tekanan 1 atm selama 15 menit

d) Larutan nutrient broth yang telah disterilisasi disimpan ke dalam

kulkas.

4.7.4 Identifikasi Bakteri P. aeruginosa

a) Pewarnaan Gram

1. Menyiapkan gelas objek dan dibersihkan dengan kapas,kemudian

dilewatkan diatas api untuk menghilangkan lemak atau minyak dan

biarkan dingin.

2. Satu ose aquades steril diteteskan pada gelas objek, kemudian diambil

sedikit bakteri untuk disuspensikan dengan aquades yang telah

diletakkan diatas gelas objek. Kemudian dibiarkan kering.

35

3. Setelah kering suspensi bakteri difiksasi dengan cara melewatkannya

di atas api bunsen dua sampai tiga kali dan sediaan siap diwarnai.

4. Sediaan ditetesi dengan kristal violet dan didiamkan selama 1 menit.

Kemudian sisa kristal violet dibuang dan dibilas dengan air perlahan-

lahan.

5. Meneteskan larutan lugol pada sediaan dan diamkan selama 1 menit,

buang sisa lugol dan bilas dengan air.

6. Kemudian dilakukan dekolorisasi (di beri larutan peluntur) dengan

alkohol 96% dan tunggu selama 5-10 detik.

7. Sediaan ditetesi dengan larutan safranin dan ditunggu selama 30 detik,

kemudian sisa safranin dibuang dan dibilas dengan air.

8. Mengeringkan sediaan dengan kertas penghisap kemudian siap untuk

dilihat di bawah mikroskop dengan perbesaran objektif 100x

menggunakan minyak immersi.

b) Uji Katalase

1. Meneteskan larutan H2O2 pada gelas objek dengan pipet

2. Mengambil kultur bakteri P.aeruginosa dengan ose dan meletakkan

ose pada gelas objek yang sudah ditetesi oleh larutan H2O2

3. Mengamati adanya gelembung-gelembung gas

4. Tes positif apabila terdapat gelembung gas, yang berarti bakteri yang

diamati merupakan bakteri gram negatif.

c) Penanaman pada Media Nutrient Agar Plate

36

Dilakukan inokulasi bakteri pada media Nutrient Agar Plate

yang kemudian diinkubasikan di dalam inkubator pada suhu 37℃ , selama

18-24 jam. Penanaman ini untuk melihat pertumbuhan koloni bakteri P.

aeruginosa dengan gambaran koloni besar dan low-convex, kasar, dan

biasanya berbentuk oval dengan tumbuh segaris dengan garis streaking.

Kultur berbau khas, terkadang mengeluarkan bau manis menyerupai bau

buah anggur atau seperti jagung. Koloni juga memberikan warna

fluoresensi hijau ketika mendapatkan cahaya.

4.7.5 Pembuatan Pembenihan Cair Bakteri 106 CFU/ml

Pembuatan pembenihan cair bakteri dengan kepadatan 106

CFU/ml

dibuat pada nutrient broth. Kemudian perbenihan bakteri P.aeruginosa ini akan

distandarisasi dengan spektrofotometer (pada panjang gelombang 600 nm

sampai mencapai optical density (OD) 0.1 yang setara dengan 108

CFU/ml)

dan diencerkan 100 kali sehingga didapatkan jumlah bakteri 106

CFU/ml.

4.7.6 Uji Efek Antibakteri Larutan Ekstrak Kulit Pisang Kepok terhadap P.

aeruginosa

Metode yang digunakan untuk tes ini adalah metode dilusi. Pada penelitian

ini diperlukan kadar beberapa macam konsentrasi ekstrak kulit pisang kepok

untuk dicampurkan atau diinokulasi dengan perbenihan cair kuman P.

aeruginosa. Proses selanjutnya ialah mengeramkan selama 24 jam pada suhu

37°C.

37

Dengan cara sebagai berikut:

1. Sediakan 10 tabung reaksi steril: tabung 1, tabung 2, tabung 3, tabung 4,

tabung 5, tabung 6, tabung 7, tabung 8, tabung 9, tabung10. Masing-masing

di beri perlakuan 8 konsentrasi ekstrak kulit pisang kepok dan 2 dari 10

tabung tersebut untuk kontrol negatif dan poasitif.

2. Masukkan 1 ml nutrient broth pada tabung 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 dan 2 ml ekstrak

kulit pisang kepok pada tabung 1 serta 2 ml bakteri pada tabung 10.

Kontrol negatif Nutrient broth Kontrol positif

3. Masukkan masing-masing 1 ml ekstrak kulit pisang kepok ke dalam tabung

2 dan 3.

1 m

l

Konsentrasi ekstrak kulit

pisang kepok

Tabung 2 1 ml (100%)

Tabung 3 2 ml (50%)

1 m

l

38

4. Campurlah hingga rata larutan Nutrient broth dan ekstrak kulit pisang kepok

pada tabung 3, kemudian pindahkan sebanyak 1 ml ke dalam tabung 4.

1ml

5. Lakukan hal yang sama terhadap tabung 4, 5, 6, 7, 8, dan 9.

6. Pada tabung 9, setelah tercampur rata, larutan dibuang sebanyak 1 ml.

7. Dari pengenceran diatas, maka konsentrasi awal antibakteri dari masing-

masing tabung adalah :

8. Setelah itu tabung 2 sampai 9 ditambahkan perbenihan cair bakteri 1 ml

9. Dengan demikian, volume masing-masing tabung menjadi 2 ml sehingga

konsentrasi akhir antibakteri berubah seperti berikut :

Konsentrasi ekstrak kulit

pisang kepok

Tabung 3 1 ml (50%)

Tabung 4 2 ml (25%)

39

10. Kemudian diinkubasi pada suhu 37˚C selama 18-24 jam.

11. Pada hari ke 2 tabung dikeluarkan dari inkubator, akan di dapatkan KHM

dengan cara melihat kejernihan tabung. Kemudian dari masing-masing

tabung diambil 1 ose dan diinokulasikan pada NAP. Lalu diinkubasikan lagi

18-24 jam pada suhu 37˚C

12. Pada hari ke 3 NAP dikeluarkan dari inkubator, koloni yang timbul diamati

dan dihitung dengan metode colony counter untuk menententukan KBM

dari ekstrak kulit pisang kepok dengan cara membandingkan jumlah koloni

dengan original inoculum.

40

4.8 Skema Alur Penelitian

Penentuan KHM dan KBM:

Pembuatan pembenihan cair

Pseudomonas aeruginosa dengan

konsentrasi 106 CFU/ml

Identifikasi bakteri Pseudomonas aeruginosa

Pewarnaan Gram

Uji Katalase

Penanaman pada media NAP

Uji antibakteri dengan Tube Dilution Test

Inkubasi selama 18-24 jam dengan suhu 37ºC

Tingkat kekeruhan yang terjadi diamati dan

dibandingkan dengan kontrol bahan. KHM

Streaking pada media NAP

Inkubasi selama 18-24 jam dengan suhu 37ºC

Jumlah koloni yang tumbuh dihitung

dengan colony counter KBM

Analisis Data

Konsentrasi ekstrak kulit pisang kepok

50% 25% 12,5% 6,25% 3, 25% 1,56% 0,78% 0,39%

0,39

Kontrol

kuman (+)

0%

Kontrol

bahan (-)

100%

41

4.9 Analisis Data

Pada penelitian ini, data yang akan dianalisis yaitu jumlah koloni P.

aeruginosa yang tumbuh pada NAP berdasarkan tingkat konsentrasi ekstrak kulit

pisang kepok (Musa paradisiaca L.). Analisis yang digunakan adalah uji one way

ANOVA (Analysis Of Variance). Uji ini digunakan untuk membuktikan adanya

perbedaan yang bermakna antara kelompok perlakuan.

Syarat yang harus dipenuhi dalam melakukan uji one way ANOVA

(untuk > 2 kelompok) adalah:

1. Distribusi data harus normal (p > 0,05), pada penelitian ini dilakukan uji

normalitas menggunakan uji Shapiro-Wilk untuk mengetahui apakah

kelompok data penelitian berasal dari populasi berdistribusi normal atau

tidak normal. Jika distribusi data tidak normal, maka diupayakan untuk

melakukan transformasi data supaya distribusi data menjadi normal.

2. Varian data harus sama atau homogen (p > 0,05), yang dapat diketahui dari

uji homogenitas Levene. Jika varian data tidak sama atau homogen, maka

diupayakan untuk melakukan transformasi data supaya ragam data menjadi

sama atau homogen.

Apabila data berdistribusi normal dan varian sama maka dilanjutkan dengan

uji Post Hoc Bonferroni untuk mengetahui pada kelompok mana terdapat

perbedaan yang bermakna. Jika distribusi normal dan varian berbeda, maka

digunakan uji Post Hoc Tamhane’s

Jika data hasil transformasi tidak terdistribusi normal atau ragam data tetap

tidak sama, maka dipilih uji nonparametrik yaitu Kruskal-Wallis sebagai

42

alternatifnya dan dilanjutkan dengan uji Post Hoc Mann-Whitney untuk

menentukan pada konsentrasi mana yang memiliki hasil kebermaknaan.