25

BAB 4

METODE PENELITIAN

4.1 Jenis Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian true experimental post test only control

group design.

4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran

Universitas Muhammadiyah Malang selama 1 bulan.

4.3 Populasi dan Sampel Penelitian

4.3.1 Populasi

Populasi dalam penelitian ini adalah jamur T.rubrum biakan murni yang

diperoleh dari Balai Besar Laboratorium Kesehatan Surabaya.

4.3.2 Sampel

Sampel dalam penelitian ini adalah jamur T.rubrum yang telah dibiakkan

dan diambil dengan menggunakan Simple Random Sampling

4.3.3 Besar Sampel

Penentuan pengulangan dihitung dengan rumus Federer

Keterangan :

t = jumlah perlakuan

n = banyak pengulangan tiap perlakuan

(t – 1) (n-1) ≥ 15

26

Penelitian ini menggunakan 8 kelompok perlakuan ekstrak kulit pisang

kepok dan 2 kelompok kontrol sehingga ada 10 kelompok, maka :

( t-1) (n-1) ≥ 15

( 10-1 ) ( n-1 ) ≥ 15

9 ( n-1) ≥ 15

9n – 9 ≥ 15

9n ≥ 24

n ≥ 2,67 ≈ 3

Dari hasil perhitungan di atas, maka diperlukan 3 kali pengulangan untuk

tiap sampel. Jadi diperlukan 30 perlakuan untuk penelitian ini.

4.4 Variabel Penelitian

4.4.1 Variabel Bebas

Variabel bebas pada penelitian ini adalah ekstrak kulit pisang kepok

dengan konsentrasi 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,12%, 1,56%, 0,78%, 0,39% dan

2 kontrol yaitu kontrol positif dan kontrol negatif.

4.4.2 Variabel Tergantung

Variabel tergantung pada penelitian ini adalah jumlah koloni jamur T.

rubrum yang dapat dilihat dari KHM dan KBM.

4.5 Definisi Operasional

1. Jumlah konsentrasi ekstrak kulit pisang kepok yang digunakan dalam

penelitian ini adalah 8 konsentrasi dengan konsentrasi 50%, 25%, 12,5%,

27

6,25%, 3,12%, 1,56%, 0,78%, 0,39% dan 2 kontrol yaitu kontrol bahan

sebagai kontrol negatif dan kontrol kuman sebagai kontrol positif. Skala

pengukuran yang digunakan adalah ordinal.

2. Jamur T.rubrum yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari biakan

murni yang diperoleh dari Balai Besar Laboratorium Kesehatan Surabaya.

Pertumbuhannya di liat dengan menghitung jumlah koloni pada SDA

menggunakan perhitungan Colony Counter. Skala pengukuran yang

digunakan adalah rasio.

3. KHM adalah konsentrasi larutan ekstrak kulit pisang kepok terendah yang

mampu menghambat pertumbuhan koloni T.rubrum menggunakan metode

dilusi tabung, yang ditandai dengan melihat ada atau tidaknya kekeruhan

pada media Sabouraud Dextrose Broth (SDB).. Skala pengukuran yang

digunakan adalah nominal.

4. KBM adalah konsentrasi larutan ekstrak kulit pisang kepok terendah yang

dapat membunuh T.rubrum, yang ditandai dengan penurunan pertumbuhan

koloni jamur sampai 99,9% dari inokulum asal pada media SDA. Skala

pengukuran yang digunakan adalah rasio.

4.6 Instrumen Penelitian

4.6.1 Alat dan Bahan Pembuatan Ekstrak Kulit Pisang Kepok

1. Alat

a. Blender

b. Kertas saring

c. Tabung ekstraktor

d. Labu destilasi

28

e. Pendingin spiral

f. Water pump

g. Evaporator

h. Vakum pump

i. Neraca analitik

j. Corong gelas

k. Cawan porselem

l. Beaker glass

2. Bahan

a. Kulit pisang kepok kering

b. Etanol 70%

c. Aquades

4.6.2 Alat dan Bahan Uji Antimikroba

1. Alat

a. Tabung reaksi steril

b. Ose lengkung

c. Mikropipet 1 ml

d. Inkubator

e. Lampu spirtus

f. Label

g. Vortex

h. Colony counter

2. Bahan

a. Perbenihan cair jamur T.rumbrum

29

b. Ekstrak kulit pisang kapok

c. Aquades

d. SDB

e. SDA

4.7 Prosedur Penelitian

4.7.1 Sterilisasi Alat

Sterilisasi alat dilakukan dengan:

a. Mencuci semua alat dengan sabun hingga bersih dan membiarkannya

hingga kering.

b. Alat-alat yang bisa disterilisasi dalam autoklaf dibungkus dengan kertas

dan dimasukkan dalam autoklaf pada suhu 121°C dengan tekanan 15

atm, selama 15 menit, sedangkan alat-alat yang tidak bisa disterilisasi

dengan autoklaf disterilkan dengan alkohol 70% selama 20 menit.

4.7.2 Pembuatan Medium SDA

a. Menimbang Sabouraud Dextrose Agar Base sebanyak kebutuhan, lalu

tambahkan aquades sesuai kebutuhan.

b. SDA direbus lalu disterilisasi dalamautoklaf pada tekanan 15 atm pada

suhu 121°C selama 15 menit.

c. SDA yang telah disterilisasi dituangkan kedalam masing-masing cawan

petri sebanyak 20 ml.

4.7.3 Pembuatan Medium SDB

a. Timbang bahan sebanyak kebutuhan, lalu tambahkan aquades sesuai

kebutuhan dan diaduk secara merata.

b. SDB direbus sampai tercampur rata.

30

c. SDB yang sudah direbus disterilisasidalam autoklaf pada tekanan 15

atm pada suhu 121°C selama 15 menit.

d. SDB yang telah disterilisasi dituangkan kedalam masing-masing

tabung.

4.7.4 Pembuatan ekstrak kulit pisang kepok

a) Proses pengolahan kulit pisang kepok

1. Mencuci bersih kulit pisang kepok dengan air mengalir

2. Kulit pisang kepok yang sudah bersih kemudian ditiriskan, dan

dipotong kecil-kecil dengan ketebalan ± <5mm.

3. Kulit pisang yang sudah dipotong dikeringkan di bawah sinar

matahari secara tidak langsung selama ± 2 hari, dilanjutkan dengan

oven selama 2 hari pada suhu 400 C sampai sampel tanaman pisang

kepok benar-benar kering.

4. Setelah kering, sampel dihaluskan dengan blender

5. Bubuk kulit pisang kepok ditimbang dengan menggunakan timbangan

sebanyak 100 gram kemudian dimasukkan dalam gelas Erlenmeyer

ukuran 1 liter.

6. Kemudian direndam di dalam larutan etanol 70% sampai volume 900

ml dan dikocok sampai benar-benar tercampur (± 30 menit).

7. Bahan direndam dan ditutup selama 24 jam sampai mengendap.

b) Proses Evaporasi

1. Mengambil lapisan atas campuran etanol dengan zat aktif yang

sudah terambil kemudian dimasukkan dalam labu evaporasi 1 liter

2. Setelah 24 jam, dilakukan penyaringan bahan dengan kertas saring

31

dan corong gelas sampai tidak ada cairan yang menetes dari bahan.

3. Memindahkan cairan hasil penyaringan pada labu evaporasi 1 liter.

4. Memasang labu evaporasi pada evaporator

5. Evaporator dipasang pada tiang permanen agar dapat

tergantungdengan kemiringan 30-40o

terhadap meja percobaan,

dengan susunan dari atas: alat pemanas air, labu penampung, hasil

evaporasi, rotary evaporator, dan tabung pendingin spiral.

6. Hasil ekstrasi di pindahkan dalam labu pemisahekstraksi.

7. Labu pemisah ekstraksi dihubungkan dengan bagian bawah

evaporator.

8. Tabung pendingin spiral di hubungakan dengan bagian atas

evaporator.

9. Labu penampung hasil bevaporasi dihubungkan dengan bagian atas

evaporator.

10. Tabung pendingin spiral dan pompa vakum dihubungkan dengan

selang plastik.

11. Tabung pendingin dan pompa sirkulasi air dingin dihubungkan

dengan selang plastik.

12. Pompa sirkulasi air dingin ditempatkan dalam bak yang berisi

aquabides.

13. Letakan satu set alat evaporasi sehingga labu pemisah ekstraksi

terendam aquabides pada pompa sirkulasi air dingin.

14. Rotary evaporator, pompa sirkulasi air dingin, dan pompa vakum

dijalankan.

32

15. Alat pemanas air dinyalakan dan diatur suhu sekitar 70-80o

C

(sesuaititik didih etanol) sehingga hasil ekstraksi dalam labu pemisah

ekstraksi mendidih dan pelarut etanol menguap.

16. Hasil penguapan etanol dikondensasi menuju labu penampung

etanol sehingga tidak tercampur dengan hasil evaporasi, sedangkan

uap air tersedot oleh pompa vakum.

17. Proses evaporasi dilakukan hingga volume kecil hasil ekstraksi

berkurang dan menjadi kental.

18. Setelah kental proses evaporasi dihentikan dan hasil evaporasi

diambil.

19. Hasil evaporasi ditampung dalam cawan penguap kemudian dioven

selama ± 2 jam pada suhu 80o

C untuk menguapkan pelarut yang

tersisa, sehingga didapatkan hasil ektrak kulit pisang kepok100%.

Ekstrak tersebut kemudian ditimbang dengan neraca analitik.

4.7.5 Identifikasi T.rubrum

Untuk memastikan bahwa koloni yang tumbuh adalah T.rubrum,

dilakukan pemeriksaan makroskopis dan mikroskopis.

1. Pemeriksaan secara makroskopis

Pemeriksaan ini dilakukan dengan mengamati koloni T.rubrum yang

berupa koloni halus berwarna putih kekuningan dan berbau ragi.

2. Pemeriksaan secara mikroskopis

Pada pemeriksaan ini dilakukan pewarnaan KOH, yaitu dengan cara:

33

Teteskan 1-2 tetes larutan KOH 10% pada kaca objek..

Letakkan bahan yang diperiksa pada tetesan tersebut dengan

menggunakan pinset yang sebelumnya dibasahi dulu dengan

larutan KOH, kemudian tutup dengan kaca penutup.

Biarkan 15 menit atau dihangatkan diatas nyala api selama

beberapa detik untuk mempercepat proses lisis. Periksa dibawah

mikroskop dengan perbesaran dari 10x - 40x.

Carilah bentukan khas T.rubrum.

4.7.6 Pembuatan Perbenihan Cair Jamur

Ambil 1 ose koloni jamur dari media subculture, kemudian suspensikan

kedalam SDB didalam tabung. Tabung kemudian divortex dan disesuaikan

dengan standart McFarland 1x108 CFU/ml.

4.7.7 Uji Kepekaan Ekstrak Kulit Pisang Kepok Terhadap T.rubrum

Metode yang digunakan untuk tes ini adalah metode dilusi tabung dan

difusi cakram. Pada penelitian ini diperlukan kadar beberapa macam konsentrasi

ekstrak kulit pisang kepok untuk dicampurkan atau diinokulasi dengan perbenihan

cair jamur T.rubrum. Dengan cara sebagai berikut:

Hari ke-1 :

a. Sediakan 10 tabung reaksi steril; tabung 1, tabung 2, tabung 3, tabung 4,

tabung 5, tabung 6, tabung 7 dan tabung 8, tabung 9, tabung 10. Masing-

masing di beri perlakuan konsentrasi ekstrak kulit pisang kepok 8

konsentrasi dan 2 tabung kontrol.

34

b. Masukkan 1 ml SDB pada tabung 2,3,4,5,6,7,8,9 dan 2 ml ekstrak kulit

pisang kepok pada tabung 1 serta 2 ml Trichophyton sp. pada tabung 10.

sukkan 1ml ekstrak kulit nanas pada tabung 2 dan 3.

Konsentrasi ekstrak kulit pisang

kepok

Tabung 2 1 ml (100%)

Tabung 3 2 ml (50%)

c. Campurlah hingga rata larutan SDB dan ekstrak kulit pisang kepok pada

tabung 3, kemudian pindahkan sebanyak 1 ml ke dalam tabung 4.

Konsentrasi ekstrak kulit pisang

kepok

Tabung 3 1 ml (50%)

Tabung 4 2 ml (25%)

d. Ulangi hal yang sama terhadap tabung 4, 5, 6, 7, 8, dan 9

e. Pada tabung 9, setelah tercampur rata, larutan dibuang sebanyak 1 ml.

f. Dari pengenceran diatas, maka konsentrasi awal antifungi dari masing-

masing tabung adalah

35

g. Selanjutnya tabung 2 sampai 9 ditambahkan perbenihan cair jamur 1 ml

h. Dengan demikian, volume masing-masing tabung menjadi 2 ml sehingga

konsentrasi akhir antifungi berubah seperti berikut. Kemudian diinkubasi

pada suhu 37˚C selama 36-48 jam

Hari ke-3:

Tabung dikeluarkan dari inkubator, akan di dapatkan KHM dengan cara

melihat kejernihan tabung. Kemudian dari masing-masing tabung diambil 1 ose

dan diinokulasikan pada media SDA. Lalu diinkubasikan lagi 36-48 jam pada

suhu 37˚C

Hari ke-5:

Media SDA dikeluarkan dari inkubator kemudian dilakukan pengamatan

kuantitatif pada masing-masing konsentrasi dengan cara menghitung jumlah

koloni jamur dengan colony counter sehingga didapatkan data KBM.

36

4.8 Alur Penelitian

Identifikasi T.rubrum

secara makroskopis dan

mikroskopis

Pembuatan media cair

T.rubrum

Uji antifungi dengan

Tube Dilution Test

Pembuatan ekstrak kulit

pisang kepok

Inkubasi selama 36-48

jam dengan suhu 37ºC

Amati tingkat kekeruhan

untuk menentukan KHM

Penggoresan pada SDA

Inkubasi selama 36-48

jam dengan suhu 37ºC

Menghitung jumlah

koloni untuk

menentukan KBM

Analisis Data

Gambar 4.1 Alur penelitian

37

4.9. Analisis Data

Pada penelitian ini, data yang akan dianalisis yaitu jumlah koloni

T.rubrum yang tumbuh pada SDA berdasarkan tingkat konsentrasi ekstrak kulit

pisang kepok (Musa paradisiaca L.). Analisis yang digunakan adalah uji one way

ANOVA. Uji ini digunakan untuk membuktikan adanya perbedaan yang

bermakna antara kelompok perlakuan.

Syarat-syarat uji parametrik yang harus dipenuhi dalam menggunakan

uji one way ANOVA adalah (Dahlan,2015) :

1. Terdapat lebih dari dua kelompok yang tidak berpasangan dan skala

pengukuran variabel numerik

2. Sebaran data harus normal (p>0,05), pada penelitian ini dilakukan uji

normalitas menggunakan uji Saphiro Wilk untuk mengetahui apakah

kelompok data penelitian berasal dari populasi berdistribusi normal atau

tidak normal. Jika distribusi data tidak normal, maka diupayakan untuk

melakukan transformasi data supaya distribusi data menjadi normal.

3. Varian data harus sama atau homogen (p>0,05), yang dapat diketahui dari

uji homogenitas Levene. Jika varian data tidak sama atau homogen, maka

diupayakan untuk melakukan transformasi data supaya ragam data menjadi

sama atau homogen.

Apabila data berdistribusi normal dan varian sama maka dilanjutkan dengan

uji Post Hoc Bonferroni untuk mengetahui pada kelompok mana terdapat

perbedaan yang bermakna. Apabila data berdistribusi normal namun variabel

tidak sama (tidak homogen) maka dapat dilanjutkan dengan uji Post Hoc

Tamhane

38

Jika data hasil transformasi tidak terdistribusi normal atau ragam data tetap

tidak sama, maka dipilih uji nonparametrik yaitu Kruskal-Wallis sebagai

alternatifnya dan dilanjutkan dengan uji Post Hoc Mann-Whitney untuk

menentukan pada konsentrasi mana yang memiliki hasil kebermaknaan,

selanjutnya dilakukan uji regresi linear untuk mengetahui seberapa besar dan

memprediksi pengaruh pemberian ekstrak kulit pisang kepok (Musa paradisiaca

L.) dengan jumlah koloni T.rubrum yang tumbuh pada Sabouraud agar

(Dahlan,2015)