ANALISIS SENYAWA AKTIF DALAM MATRIKS BIOLOGI

Prof. Dr. Slamet Ibrahim S. DEA. Apt.Marlia Singgih Wibowo, PhD, Apt.

Sekolah Farmasi ITB

INTRODUCTION Senyawa Aktif seperti Obat memiliki peran penting

dalam tubuh kita, terutama saat penyembuhanpenyakit

Sampel Biologis adalah samples yg diambil darisebagian tubuh untuk tujuan analisis , misalnyabloo/darah , urine, stomach contents ( including stomach washing and vomit/muntah), liver/hati, bile/empedu, brain, kidneys, meat, hairs, ataubagian tubuh.

Blood atau urine samples adalah contoh sampelyang paling umum utk clinical cases dan utkmendeteksi misalnya : detect doping in athletes, in fatal or poisoning cases, in pharmacokinetics study, and in therapeutic drug monitoring.

Sampel biologi adalah contoh uji yang diambil atauberasal dari tubuh manusia, khewan atau tumbuhanberupa urin, darah, cairan lambung, daging, hati, ataujaringan lainnya.

Matriks biologi adalah bahan-bahan lain di luar analitdalam sampel biologi.

Analit dalam sampel dapat berupa senyawa tunggalatau campuran berbagai senyawa yang akandianalisis.

SAMPEL DAN PENGAMBILAN SAMPEL Blood/darah adalah sampel yg paling baik untuk

identifikasi obat atau zat aktif lainnya dan utkanalisis kuantitatif. Sampel darah harus diambiloleh petugas yang trampil dan berpengalaman untukmenjamin kebenaran sampel nya.

Plasma atau serum biasanya digunakan untukanalisis klinis karena kandungan komponen darahlebih sedikit dibandingkan darah utuh. Namunkebanyakan obat terdistribusi antara erythrocytes dan plasma, rasio nya bervariasi. Karena alasantersebut, plasma hrs dipisahkan dari eritrositsesegara mungkin setelah penambahananticoagulant untuk menjamin hemolisiserythrocytes tidak akan mempengaruhi analysis.

Urine memiliki keuntungan dibandingkan darah krnkonsentrasi obat dalam urin dpt sekitar 100x lebihbesar drpd dlm blood, dan bebas dari protein ygmungkin dpt mempengaruhi analysis.

Kerugian sampel Urine adalah kebanyakan obat yang diekskresikan di urin hampir seluruhnya berada dlmbentuk metabolit nya, sehingga untuk membukikankeberadaan obat asli nya diperlukan analisis di jaringan lain..

Urine masih merupakan “sample of choice” utkdeteksi dopping pada atlet karena mudahdiperoleh dalam jumlah besar dan mengandungbanyak senyawa2 secara bersamaan.

Sampel hati (liver extract) bermanfaat untukanalisis dalam “postmortem examination”. Banyakjenis obat yg berada dalam konsentrasi tinggi di hatidibandingkan di dalam darah.

Sangat penting diperhatikan kantung empedu telahdiikat terlebih dahulu, agar organ hati tidakterkontaminasi oleh empedu.

Bile/empedu secara khusus bermanfaat sbg sampelutk deteksi “morphine-like compounds” karena dptberada dlm konsentrasi yg tinggi dlm btk ikatanglucuronida. Sampel empedu harus dibuat terpisah.

Analisis senyawa aktif dalam sampel biologimempunyai berbagai tujuan:

1. Untuk mengetahui/menetapkan adanya atau jumlahsenyawa endogenik tertentu: kimia klinik untuktujuan diagnosa.

2. Untuk menetapkan adanya atau jumlah senyawaexogenik ( berasal dari luar tubuh):analisismetabolit, doping, keracunan, kesetaraan danketersediaan hayati suatu obat.

3. Untuk memantau penggunaan obat baik dalamanalisis farmakodinamik, pemantauan maupunkepatuhan pasien.

Berbagai kendala perlu diperhatikan dalam analisissenyawa aktif dalam sampel biologi yaitu:

1. Kadar analit biasanya rendah, oleh karena itu perlumetode analisis yang sensitif.

2. Dalam sampel biologi biasanya mengandungberbagai senyawa baik endogen maupun exogenyang dapat mempengaruhi hasil analisis. Olehkarena itu perlu analisis yang selektif ataudilengkapi dengan teknik pemisahan sebelumdilakukan analisis.

PENANGANAN SAMPEL Transportasi dan Penyimpanan sampel:1. Semua spesimen (sebutan lain dari sampel biologi

yang berasal dari tubuh manusia atau khewan) yang akan dianalisis hendaknya diberi label yang berisinama pasien, nomor, asal, jenis, tujuan analisis, tanggal penerimaan, nama pemohon analisis, dll.

2. Semua spesimen hendaknya disimpan pada suhu4oC sebelum analisis, dan setelah dilakukan analisissampel hendaknya disimpan selama 3 – 4 minggupada suhu 4oC atau untuk beberapa sampel dankasus, disimpan pada -20oC.

CONTAINER/ WADAH SAMPEL Sedapat mungkin menggunakan “Disposable container

“ untuk menghindari kemungkinan kontaminasi. Sampel biologi cair paling baik ditempatkan dalam

wadah gelas yang di seal dengan bahan yg inert (mis. PTFE liner). Tutup karet sebaiknya dihindari utukmencegah kemungkinan absorpsi atau contamination.

Wadah Plastik digunakan utk solid samples, selamatidak ada kontak dengan dinding wadah untukmencegah absorpsi oleh dinding wadah.

Sampel2 selanjutnya dikemas dalam kotak/bokskarton untuk melindungi sampel, dan dibawa dalamtas berbahan polythene supaya tidak basah bilakehujanan selama proses transportasi.

STORAGE/PENYIMPANAN Suatu obat dapat terdekomposisi (akibat proses photolysis,

oxidation, hydrolysis, atau temperature) selamatransportasi dan penyimpanan, , sehingga akanmenyebaban kesalahan analisis.

Secara umum, sampel biologis disimpan dalam suhurendah. Dibawah 4oC dan hrs dianalisis dlm beberapa hari. Sampel dapat disimpan lebih lama pada suhu -20o, tetapihanya bisa di “thawed” sekali saja sebelum analysis. Utk“long-term storage” , penyimpana dengan cara “freeze-drying” disarankan.

Sampel biologis membeku pada -20o utk preservasi. “Freezing/pembekuan” merupakan metode ideal utkmenyimpan bahan2 obat.

Kadang2 , senyawa preservative digunakan selamapenyimpanan. Mis. sodium azide atau sodium fluoride or embalming fluids for dead body.

• PERLAKUAN AWAL(PRETREATMENT)

1. Beberapa sampel biologi yang mengandung protein sepertidarah (plasma dan serum) perlu diperlakukan awal berupapenghilangan protein (deproteinasi) dengan cara pengendapanatau hidrolisis. Pengendapan dilakukan dengan penambahanasam triklorasetat, amonium tungstat, atau amonium sulfat. Hidrolisis dilakukan dalam suasana asam.

2. Ekstraksi dengan menggunakan pelarut organik yang sesuai. Kadang-kadang digunakan juga kromatografi kolom cepat ataumikrodialisis untuk isolasi senyawa aktifnya.

3. Proses “clean-up” atau pemekatan dengan menggunakanekstraksi fase padat (solid phase extraction).

4. Pemekatan (penguapan) dan pelarutan dalam pelarut yang sesuai untuk pengukuran/analisis.

DRUGS COMMONLY TAKEN IN OVERDOSES

Fraction A (Strong Acids): Salycilates, Phenytoin.

Fraction A-2 (Weakly Acids): Barbiturates, Chlorpropamide, Glutethimide, Paracetamol, Phenylbutazone, and Phenytoin.

Fraction A-3 (Neutral Drugs):Caffeine, Carbromal, Chlordiazepoxide, Chlormethiazole, Ethchlorvynol, Flurazepam, Glutethimide, Lorazepam, Meprobamate, Methaqualone, Methyprylone, Nitrazepam, Phenazone, Temazepam, Theophyline

Fraction B (Basic Drugs)Amitriptyline, Amphetamine, Caffeine, Chlordiazepoxide, Chlormethiazole, Chlorpromazine, Clomipramine, Desipramine, Dextropropyphene, Diazepam, Dihydrocodein, Dothiepin, Doxepin, Ergot alkaloids, Flurazepam, Imipramine, Lorazepam, Maprotiline, Methadone, Methaqualone, Mianserin, Morphine, Nitrazepam, Orphanedrine, Oxprenolol, Phenelzine, Propanolol, Quinine, Temazepam, Theophylline, Thioridazine, Trimipramine.

Fraction BE (Benzophenones): Benzodiazepines Fraction O (Opiates):

Codeine, Morphine, etc.

PENYIAPAN SAMPEL DANPRETREATMENT

Pilihan solvent utk extraction terbatasberdasarkan polaritas senayawa aktif yang akandianalisis.

Pilihan adalah antara ether, chlorinated hydrocarbons, ethyl acetate, atau acetone.

Jika chloroform digunakan untuk kedua fraksibasa atau asam (Fraction B or A), the basic group should be performed first in order to avoid the loss chloroform-soluble salt in the chloroform used to extract the acids group.

Techniques of general solvent extraction are used according to Stass-Otto method.

METODE EKSTRAKSI Dapat dilihat atau diadopsi dari pustaka primer

(jurnal ilmiah) atau sekonder (buku teks, peganganatau acuan).

Secara umum dapat digunakan metode ekstraksiStass-Otto atau Metode Jackson dalam Clarke’s Analysis of Drugs and Poisons.

Senyawa asam diekstraksi dalam suasana asam (pH < pKa - 2) dan senyawa basa pada suasana basa (pH > pKb + 2) dengan menggunakan pelarut organik yang sesuai. Sedangkan senyawa netral diekstraksi padasuasana netral (pH sekitar 7) dengan menggunakanpelarut organik.

• EKSTRAKSI Ekstraksi cair-cair senyawa aktif seperti obat dan senyawa

lipofilik lainnya dari spesimen ke dalam pelarut organiktak bercampur dengan air yang sesuai, biasanya dilakukanpada pH yang terkontrol.

Ekstraksi bertujuanmenghilangkan air dan senyawa lain yang mengganggu analisis, dilanjutkan dengan pemekatandengan penguapan atau dengan SPE dan akhirnyadilarutkan dalam pelarut yang sesuai sebelum dilakukananalisis.

Ekstraksi dapat dilakukan dalam tabung reaksi sesuai danpengocokan dilakukan dengan alat Vortex. Sedangkanpenguapan dapat dilakukan dengan hembusan gas nitrogen, udara panas atau dalam alat penguap putarvakum (vacuum rotary evaporator).

Pemisahan kadang-kadang dilakukan dengan sentrifugasi.

EXTRACTION OF URINE To 10 ml of urine + phosphoric acid or tartaric acid to adjust

pH 3, extract with 2 X 30 ml portions of ether. Combine the ether extracts and wash with 5 ml of water.

Retain the aqueous layer for later extraction. Extract the ethereal layer with 5 ml of saturated sodium

bicarbonate solution and retain the aqueous layer for possible examination for the presence of salicylate or strong acid- Fraction A-1).

Extract the ethereal layer with 5 ml of 0.5 M sodium hydroxide and retain the aqueous extract for barbiturates or weakly acid (Fraction A-2).

Wash the ethereal solution with water, discard the washing, dry the solution with anhydrous sodium sulfate, and evaporate to dryness. The residue may contain neutral drugs (Fraction A-3N)

FAKTOR-FAKTOR YANG HARUSDIPERTIMBANGKAN DALAM EKSTRAKSI. Sifat fisiko-kimia analit (pKa, stabilitas,

kelarutan, volatilitas, dll.) Sifat alami (nature) dari sampel : mengandung

protein atau lemak, stabilitas, dll.) Sifat fisiko-kimia pelarut organik yang

digunakan (immiscibility, volatility, polarity, dankemampuan pelarutan, dll.)

Metode atau teknik analisis yang akandigunakan.

MISALNYA EKSTRAKSI SENYAWA DIURETIKA Sejumlah 3 ml urin dipipet kedalam tabung

sentrifuga, tambahkan sejumlah baku internal dantambahkan dapar fosfat pH 5 dan 0,5 g natrium sulfatanhidrat.

Campuran divortex dan diekstraksi dengan 5 ml dietileter lalu divortex lagi selama 5 mn.

Tabung disentrifugasi pada 2500 g selama 5 menit. Fase organik dipindahkan ke dalam tabung yang lain dan diuapkan dengan aliran udara panas atauhembusan gas Nitrogen atau penguap putar hampa.

Residu dilarutkan dalam 200 µl metanol dan disaringmelalui membran 0.45 µm, dan 5 atau 10 µl disuntikan kedalam kromatograf.

ANALISIS SENYAWA AKTIF

Setelah diekstraksi, diuapkan, dan dilarutkankembali dalam pelarut sesuai, analit dianalisissecara:

1. Spektrofotometri (UV, IR, AAS/FES, MS)2. Kromatografi (KCKT, KG dan KLT-

Densitometri).3. Radioimunokimia (RIA, dll).