analisis imunokimia
TRANSCRIPT
ANALISIS IMUNOKIMIA UNTUK DETEKSI MIKROBA PATOGEN DAN SENYAWA RACUN
ANALISIS IMUNOKIMIA UNTUK DETEKSI MIKROBA PATOGEN DAN SENYAWA RACUNMarlia Singgih WibowoMarlia Singgih WibowoSekolah FarmasiSekolah Farmasi--ITBITB
Uji kehamilan menggunakan kit
Test Mikrobapatogen
Analisis Imunokimia
ImunoImuno (basis : (basis : sistemsistemimunimun mamaliamamalia))KimiaKimia ((reaksireaksi kimiakimia))
Analisis Imunokimia
AnalisisAnalisis berdasarkanberdasarkan reaksireaksi spesifikspesifikantaraantara Antigen (Ag) Antigen (Ag) dandan AntibodiAntibodi ((AbAb))
AnalisisAnalisis kualitatifkualitatif maupunmaupun kuantitatifkuantitatif
PenggunaanPenggunaan senyawasenyawa “label” “label” untukuntukvisualisasivisualisasi reaksireaksi
Apakah Antibodi&Antigen itu?
Reaksi spesifik antara Antigen (Ag) danAntibodi (Ab)
Ab dibentuk berdasarkan Ag yang menginduksinya
Antigen Antigen (antibody generator)(antibody generator)
ImunogenikImunogenik : : SenyawaSenyawa yang yang dapatdapatmemicumemicu sistemsistem imunimun mamaliamamaliaAntigenikAntigenik : : senyawasenyawa yangdapatyangdapatbereaksibereaksi spesifikspesifik dengandengan antibodiantibodiSyaratSyarat : BM : BM tinggitinggi (>5000), (>5000), strukturstrukturkimiakimia komplekskompleks. (. (bilabila BM BM rendahrendah dapatdapatdikonjugasidikonjugasi dengandengan protein carrier protein carrier agar agar bersifatbersifat imunogenikimunogenik))
Bahan yang dapat dianalisis(sebagai Antigen) dengan metodeimunokimia
MikrobaMikroba patogenpatogen dandanatauatau toksintoksin mikrobamikrobaToksinToksin tanamantanaman, , hewanhewanProtein Protein spesifikspesifik atauatausenyawasenyawa lain yang lain yang berstrukturberstruktur spesifikspesifikSenyawaSenyawa obatobat((narkotiknarkotik, , psikotropikpsikotropik))SenyawaSenyawa pestisidapestisida
Contoh obat XTC
AntibodiAntibodi
HasilHasil reaksireaksi humoralhumoral selsel B B dalamdalam limpalimpamamaliamamaliaSpesifikSpesifik terhadapterhadap antigen yang antigen yang memicunyamemicunyaImunoglobulinImunoglobulin : : IgAIgA, , IgDIgD, , IgMIgM, , IgEIgE, , IgGIgG
Struktur IgG dan IgM
IgG IgM
PrinsipPrinsip ReaksiReaksiReaksiReaksi imunologiimunologi didi dalamdalam mamaliamamalia ::
AgAb Reaksi primer
Reaksisekunder
Reaksi tersier(degranulasi,opsonisasi)
(Fiksasi komplemen, aglutinasi, presipitasi)
Label
VisualisasiVisualisasi ReaksiReaksi AgAg--AbAb
SUBSRAT
PRODUK (dapatdivisualisasi)
Kompleks
Ag-Ab-Label
SenyawaSenyawa ““LABELLABEL” ”
SenyawaSenyawa yang yang dikonjugasidikonjugasi padapadaantigen antigen atauatau antibodiantibodi untukuntuk dapatdapatmemmem--visualisasivisualisasi reaksireaksi AgAg--AbAbDapatDapat berupaberupa enzimenzim, , senyawasenyawaberfluoresensiberfluoresensi, , radioaktifradioaktif, , dlldll..ReaksiReaksi amplifikasiamplifikasi dapatdapat dilakukandilakukansehinggasehingga dapatdapat diukurdiukur secarasecarafisikokimiafisikokimia
BeberapaBeberapa contohcontoh “label”“label”
Enzim Enzim : Horse radish peroxidase (HRP), : Horse radish peroxidase (HRP), Alkaline PhosphataseAlkaline PhosphataseSenyawa berfluoresensiSenyawa berfluoresensi : Fluorescein, : Fluorescein, Umbelliferon, Tetrametil rodhaminUmbelliferon, Tetrametil rodhaminSenyawa LuminescenceSenyawa Luminescence : Luciferin: LuciferinPartikel Partikel : Tanned erythrocyte, Colloidal, : Tanned erythrocyte, Colloidal, microsphere , gold, silvermicrosphere , gold, silverVesikel Vesikel : liposom: liposom
MetodeMetode analisisanalisis imunokimiaimunokimiaberdasarkanberdasarkan labelnyalabelnya
EIAEIA (Enzyme (Enzyme ImmunoAssayImmunoAssay))ELISAELISA (Enzyme Linked(Enzyme Linked--ImmunosorbentImmunosorbent Assay)Assay)RIARIA (Radio (Radio ImmunoAssayImmunoAssay))IFA IFA ((ImmunoFluorescenceImmunoFluorescence Assay)Assay)LIALIA (Luminescence (Luminescence ImmunoAssayImmunoAssay))
Bahan yang diperlukan dalam reaksi Ag-Ab dalam analisis imunokimia
AntigenAntigenAntibodiAntibodiMedia Media penyanggapenyangga reaksireaksiLarutanLarutan DaparDapar pelarutpelarutLarutanLarutan DaparDapar pencucipencuciSenyawaSenyawa “Label”“Label”SubstratSubstratSenyawaSenyawa penghentipenghenti reaksireaksiInstrumenInstrumen pendeteksipendeteksi hasilhasil reaksireaksi
Suatu larutan atau suspensi antigen (dapat pula dilakukan sebaliknya yaitu dengan memasukkan antibodi terlebih dahulu) dimasukkan kedalam sumur pelat solid, lalu diinkubasi pada suhu tertentu selama waktu tertentu pula (sesuai dengan jenis antigen dan antibodi yang digunakan), lalu ditambahkan larutan pem”blok” untukmenghindari ikatan non-spesifik
Larutan antibodi B (anti-antigen A) dimasukkan kedalam sumur pelat tersebut setelah proses pencucian. Kompleks A-B akan terbentuk dengan kuat. Suatu konjugat antibodi C (anti-antibodi B) dengan suatu Label (misalnya suatu Enzim) ditambahkan sehinggaakan membentuk kompleks A-B-C-Enz.
Penambahan substrat tertentu akan menyebabkan terbentuknya warna dan reaksi warna dihentikan dengan penambahan senyawa lain agar warna yang terbentuk stabil pada saat pengukuran.
Warna yang terbentuk diukur intensitasnya dengan menggunakan alat spektrofotometer. Konsentrasi yang terukur akan sebanding dengan antigen yang terikat pada reaksi yang terjadi
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalammenggunakan kit pereaksi imunokimia:
ApakahApakah kit kit tersebuttersebut dilengkapidilengkapi dengandenganbrosurbrosur /booklet yang /booklet yang lengkaplengkap tentangtentangmetodemetode analisisanalisis yang yang digunakandigunakan??ApakahApakah sudahsudah adaada parameter parameter evaluasievaluasidandan validasivalidasi yang yang dilakukandilakukan ??MengevaluasiMengevaluasi sumbersumber--sumbersumberkesalahankesalahan yang yang mungkinmungkin terjaditerjadiSeleksiSeleksi awalawal kit kit pereaksipereaksi : : padapada tahaptahapiniini perluperlu dilakukandilakukan
SeleksiSeleksi awalawal kit kit pereaksipereaksi : : padapada tahaptahap iniini perluperludilakukandilakukan evaluasievaluasi terhadapterhadap kurvakurva standard standard dandanapakahapakah adaada reduksireduksi data yang data yang dilakukandilakukan, , Parameter evaluasi : accuracy, precision, sensitivity, selectivity, specificityMemahamiMemahami prosedurprosedur percobaanpercobaan : : EfekEfek matriksmatriks, , perolehanperolehan kembalikembali, , reaksireaksi silangsilang, , pengaruhpengaruh dandanpenangananpenanganan sample, sample, modifikasimodifikasi prosedurprosedur, , modifikasimodifikasi teknisteknis assay.assay.Pengembangan data validasi : rentang normal, ujiterhadap kondisi abnormal, stimulasi, supresi, rentang QC
SumberSumber kesalahankesalahan dalamdalamanalisisanalisis imunokimiaimunokimia
KesalahanKesalahanRandom/Random/AcakAcak(imprecision)(imprecision)KesalahanKesalahansistemiksistemik(inaccuracy)(inaccuracy)
KesalahanKesalahan acakacakPipetingPipeting : : masalahmasalah desaindesain pipetpipet ituitu sendirisendiri, , caracaramenggunakanmenggunakan dandan halhal teknisteknis dalamdalam penggunaanpenggunaanpipetpipet (volume yang (volume yang dikeluarkandikeluarkan, , dlldll))PemisahanPemisahan padatanpadatan daridari cairancairan : : prosesproses pembtknpembtknendapanendapan yang yang tergantungtergantung padapada waktuwaktu, , kecepatankecepatan, , suhusuhu, , dlldll, , pencucianpencucian yang yang tidaktidaksempurnasempurna, , dlldll..KondisiKondisi ReaksiReaksi BiokimiaBiokimia : : konstantakonstantakesetimbangankesetimbangan antibodiantibodi, , waktuwaktu, , suhusuhuJumlahJumlah radioaktifradioaktif : : untukuntuk prosesproses RIARIAIntensitasIntensitas fluoresensifluoresensi yang yang terjaditerjadi : : untukuntuk prosesprosesIFAIFAKesalahanKesalahan spektrofotometrikspektrofotometrikStabilitasStabilitas pereaksipereaksi
KesalahanKesalahan sistemsistem
KesalahanKesalahan mempipetmempipet : : masalahmasalah kalibrasikalibrasialatalat, , bentukbentuk pipetpipet, , dlldllInterferensiInterferensi dalamdalam reaksireaksi : : terjadinyaterjadinya nonnon--specific bindingspecific binding, , inhibisiinhibisi enzimenzim, , pendaranpendarancahayacahaya, , adanyaadanya pengaruhpengaruh enzimenzim endogen, endogen, pengaruhpengaruh obatobat lain yang lain yang digunakandigunakan , , pengaruhpengaruh senyawasenyawa endogen endogen lainnyalainnya((bilirubinbilirubin, , dlldll))EfekEfek matriksmatriks