polymerase chain reaction (pcr)

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)Oleh :

KARTIKA CINDIA RANI (F1C1 13 018)WA ODE UMI KALSUM (F1C1 13 034)PUPING JUINAR (F1C1 13 076)UMAN MUNASAR (F1C1 13 0)

JURUSAN KIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS HALU OLEOKENDARI2016

A. PENDAHULU

AN

pemanfaatan berbagai prinsip

ilmiah dan rekayasa terhadap organisme,

meningkatkan potensi organisme, sehingga menghasilkan produk

dan jasa bagi kepentingan hidup

manusia

Polymerase Chain Reaction(PCR)

Bioteknologi TradisionalBIOTEKNOLOGI

Bioteknologi Modern

What is PCR ???

Kary B. Mullis (1985), Nobel (1994)

PCR : suatu metode enzimatis untuk amplifikasi DNA dengan cara in vitro

B. PEMBAHASA

NPolymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase (enzim yang digunakan dalam PCR)Chain (Produk dari reaksi

pertama menjadi substrat dari reaksi selanjutnya, dst

LANJUTAN ….

Komponen Penting PCR

DNA templa

te

Enzyme

buffersdNTPs

Oligonukleoti

da Primer

s

melakukan katalisis reaksi sintesis rantai DNA, dari Eubacterium (Thermus aquaticus), diisolasi dari taman Yellowstone (1969)

suatu sekuen oligonukleotida pendek (18 – 28 basa nukleotida) yang digunakan untuk mengawali sintesis rantai DNA

fragmen DNA yang akan dilipatgandakan. DNA cetakan yang digunakan sebaiknya berkisar antara 10^5 – 10^6 molekul.

LANJUTAN ….

Komponen Penting PCR

DNA templa

teOligonukleoti

da Primer

sEnzyme Taq DNA polymer

ase

Larutan pendukung, umumnya larutan buffer PCR mengandung 10 – 50mM Tris-HCl pH 8,3-8,8 (suhu 20 oC); 50 mM KCl; 0,1% gelatin atau BSA (Bovine Serum Albumin); Triton X-100 sebanyak 0,1%; disamping itu perlu ditambahkan 1,5 mM MgCl2.

Deoksiribonukelotida trifosfat (dNTP), terdiri dari dATP, dCTP, dGTP, dTTP. dNTP mengikat ion Mg2+ sehingga dapat mengubah konsentrasi efektif ion

LANJUTAN ….

Komponen Penting PCR

buffers

dNTPs

Alat dan bahan yang digunakan dalam PCR

Sumber: Mahmuddin (2010)

Peralatan khusus yang dibutuhkan dalam pelaksanaan PCR antara lain:1. Mighty-small II SE-250 vertical gel

electrophoresis unit (Hoefer)2. Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler3. Sterile Thin-wall 0.5 ml4. Thermocycler microfuge tubes: (TC-5,

Midwest Scientific)

Reagen khusus yang dibutuhkan dalam pelaksanaan proses PCR secara in vitro antara lain: 1. Pasangan primer oligonukleotida sintetik2. Buffer PCR 5X (250 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 7,5 mM MgCl2)3. Campuran dari empat dNTP sebesar 2,5 mM dengan volume 10

mM.4. Taq DNA Polymerase5. Minyak mineral ringan6. Akrilamida (grade elektroforesis)7. N, N’-Methylenebisacrylamide (grade elektroforesis)8. Amonium persulfat9. TEMED (N, N, N’N ‘Tetramethylethylenediamine)Sumber: Mahmuddin (2010)

LANJUTAN ….

LANJUTAN ….

Tahapan dalam PCR

Denaturasi DNA merupakan proses pembukaan DNA untai ganda menjadi DNA untai tunggal. Ini biasanya berlangsung sekitar 3 menit, untuk meyakinkan bahwa molekul DNA terdenaturasi menjadi DNA untai tunggal.

Annealing (penempelan primer) dimana ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan komplemen pada templat, dilakukan pada suhu 50°C – 60°C,

Pemanjangan Primer (Extention) umumnya, terjadi pada suhu 72°C. Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi 3’nya dengan penambahan dNTP yang komplemen dengan templat oleh DNA polimerase.

LANJUTAN ….

LANJUTAN ….

Jumlah produk yang dihasilkan:

XY : jumlah amplikasiN : jumlah siklusX : jumlah molekul DNA template semula

PCR (Polymerase Chain Reaction).mp4

LANJUTAN ….

Teknik PCR dapat dimodifikasi ke dalam beberapa jenis diantaranya: • Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP); metode

ini digunakan untuk membedakan organisme berdasarkan analisis model derifat dari perbedaan DNA.

• Inverse-PCR, metode ini digunakan ketika hanya satu sekuen internal yang diketahui.

• Nested-PCR, proses ini memungkinkan untuk mengurangi kontaminasi pada produk selama amplifikasi dari penyatuan primer yang tidak diperlukan.

• Quantitative-PCR; digunakan untuk pengukuran berulang dari hasil produk PCR

• Reverse Transcriptase (RT-PCR); metode ini digunakan untuk amplifikasi, isolasi atau identifikasi sekuen dari sel atau jaringan RNA. Metode ini dibantu oleh reverse transcriptase (mengubah RNA menjadi cDNA), mencakup pemetaan, menggambarkan kapan dan dimana gen diekspresikan.

• Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) bertujuan untuk mendeteksi polimorfisme pada tingkat DNA.

Polymerase Chain Reaction (PCR) dapat digunakan untuk:• Amplifikasi urutan nukleotida• Menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang

mengalami mutasi• Bidang kedokteran forensik• Melacak asal-usul sesorang dengan membandingkan

“finger print”.

Manfaat PCR

Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan, diantaranya:

- Isolasi gen - DNA sequencing- Identifikasi Forensik - Diagnosa

Penyakit

KESIMPULAN

• PCR merupakan suatu metode enzimatis untuk amplifikasi DNA dengan cara in vitro.

• Komponen utama PCR yaitu: DNA template, oligonukleotida primer, enzim Taq DNA polimerase, dNTP, larutan buffer.

• PCR terdiri dari tiga tahap utama, yaitu: denaturasi, annealing (penempelan primer) dan pemanjangan primer (extention).

• PCR yang sudah digunakan secara luas yaitu: isolasi gen, DNA sequencing, identifikasi forensik dan diagnosa penyakit.

THANK YOU