pcr merupakan salah satu tekknik in
Post on 13-Feb-2018
223 Views
Preview:
TRANSCRIPT
-
7/23/2019 PCR Merupakan Salah Satu Tekknik In
1/5
PCR merupakan salah satu teknik in-vitro yang digunakan untuk mengaplifikasi suatu
molekul DNA secara eksponensial dengan menggunakan reaksi enzimatis (Yuono! "##$%& PCR
atau polymerisasi 'erantai adalah teknik amplifikasi (per'anyakan% DNA spesifik dengan
melakukan proses pemanangan nukleotida dari Primer yang merupakan pasangan komplementer
dari utas DNA secara simultan& Proses pemanangan nukleotida dilakukan oleh DNApolymerase
'erdasarkan cetakan DNA ()uladno! "##"%&
)enurut )uladno ("##"%! tahap-tahap PCR meliputi tahap denaturasi! penempelan
Primer pada cetakan DNA (annealing% dan tahap pemanangan Primer melalui reaksi
polimerisasi nukelotida (extention%&
a& *ahap pele'uran (melting% atau denaturasi&
Pada tahap ini 'erlangsung pada suhu tinggi +,oC-+$oC& *ahap ini merupakan tahappengudaran DNA utas ganda menadi DNA utas tunggal! dimana masing-masing untai
dapat mencetak pasangannya (komplementer%& iasanya pada tahap aal PCR tahap ini
dilakukan agak lama (sampai . menit% untuk memastikan semua 'erkas DNA terpisah&'& *ahap penempelan atau annealing&
*ahap ini merupakan tahap penempelan Primer pada utas DNA template yang telah
terdenaturasi menadi utas tunggal aki'at kecocokan pasangan 'asa& /ni dilakukan pada
suhu antara ,.oC-$#oC& Penempelan ini 'ersifat spesifik& 0uhu yang tidak tepat
menye'a'kan tidak teradinya penempelan atau Primer menempel disem'arang tempat&
c& *ahap pemanangan atau e1tention&Pemanasan sampai 2"oC merupakan temperatur optimum DNA polymerase untuk
memanangkan Primer oligonukleotida& 3nzimpolymerase mensintesis utas kedua yang
komplementer terhadap template& 0intesis DNA diinisiasi pada uung 4567 dari tiap
Primer& *a8 polymerase tidak dirusak oleh proses denaturasi pada suhu tinggi! sehingga
reaksi dapat diulang tanpa menam'ah enzim Taq polymeraseyang 'aru pada tiap siklus&
9etiga tahap di atas akan 'erulang 'e'erapa kali sehingga proses amplifikasi DNA dapat
teradi& )esin PCR digunakan untuk memudahkan proses reaksi 'erantai ini& )esin PCR terdiri
dari suatu alat pemanas dan pendingin yang dapat diprogram sehingga dapat memanaskan pada
suhu dan selang aktu yang dikehendaki untuk setiap siklus pada suatu reaksi& anyaknya
pengulangan sangat tergantung dari kemampuan DNA polymerase untuk mensintesis DNA dan
'iasanya 'erkisar antara ". dan ,# siklus&
-
7/23/2019 PCR Merupakan Salah Satu Tekknik In
2/5
Deteksi E. coli Dengan Menggunakan PCR
Ada 'e'erapa tahapan yang harus dilakukan untuk mendeteksi 3& coli menggunakan PCR
adalah se'agai 'erikut:
;& Penyiapan *emplate DNA dari 0ampel Air
Cara keranya adalah sampel air se'anyak ;!. ml dimasukkan ke dalam ta'ung
mikrosentrifuge eppendorf dan disentrifugasi dengan kecepatan ;### rpm selama ;#
menit& 0etelah disentrifugasi supernatan di'uang dan hanya tersisa pelet! selanutnya
pelet diisi kem'ali dengan sampel air yang sama se'anyak ;!. ml dan disentrifugasi
se'anyak < kali& 9emudian diiam'il se'anyak ; ml media Nutrient roth dimasukan ke
dalam ta'ung mikrosentrifuge eppendorf yang 'erisi pelet& Pelet dicampur dengan media
N hingga tercampur& 0elanutnya pelet dimasukkan ke dalam ta'ung reaksi yang 'erisi, ml Nutrient roth lalu diinku'asi pada suhu 42oC selama ", am&
2. Penyiapan *emplate DNA 3& coli&
3kstraksi DNA 'akteri 3& coli dilakukan dengan menggunakan Purification 9it dari &
Adapun prosedur kera ekstraksi DNA 'akteri 3& coli adalah kultur isolat 'akteri diam'il
se'anyak ;!. ml lalu disentrifugasi dan supernatan di'uang& Pelet ditam'ahkan larutan
3D*A se'anyak ,.# => lalu divorte1 sampai homogen& 9emudian pelet ditam'ahkan
$## => cell lysis solution dan divorte1 kem'ali&
d& Pelet ditam'ahkan Proteinase 9 se'anyak . =>! lalu dipanaskan pada
suhu
-
7/23/2019 PCR Merupakan Salah Satu Tekknik In
3/5
se'anyak $## => disentrifugasi kem'ali dengan kecepatan ;.### rpm
selama ;# menit&
h& 0elanutnya supernatan di'uang sehingga hanya tersisa pelet yang
'erarna putih&
i& Pelet ditam'ahkan $## => etanol 2#? lalu disentrifugasi dengan
kecepatan ;.### rpm selama dua menit&
& 0elanutnya etanol di'uang dan dikeringkan! lalu dikeringanginkan
selama ;. menit&
k& DNA pelet ditam'ah dengan DNA rehydration solution ;## => dan
dipanaskan kem'ali pada suhu $.oC selama ; am& 0elanutnya produk
DNA ekstraksi disimpan dalam kulkas&
;.
4&$&4 Amplifikasi *emplate DNA dengan PCR&
Proses PCR dilakukan dengan menggunakan modifikasi yang telah
dilakukan Radi dkk&! ("#;#%& Adapun cara keranya adalah se'agai 'erikut :
a& Disiapkan reagen seperti dd7"6! PCR 'uffer! DN*P0 (< m)%! )gCl"
(". m)%! Primer ;$3; ! Primer ;$3" masing-masing (;# m)% dan
enzym ta8 polymerase semua reagen dimasukkan ke dalam satu ta'ung
mikrosentrifuge eppendorf yang steril kemudian divorte1 hingga
homogen&
'& Disiapkan ta'ung PCR yang 'erukuran #!. ml yang steril! dimasukkan ;
-
7/23/2019 PCR Merupakan Salah Satu Tekknik In
4/5
=> produk ektrasksi DNA ke dalam ta'ung PCR! selanutnya
dimasukkan reagen yang sudah dicampur masing-masing se'anyak ",
=> untuk setiap ta'ung sampel&
c& >alu dimasukkan ke dalam mesin PCR dan diatur tahap-tahap PCR yaitu
dengan mengatur profil suhu pra denaturasi PCR +,oC selama . menit!
pasca denaturasi PCR +,oC selama "# detik! annealing ..oC selama "#
detik! pra-ekstension 2" oC selama "# detik! dan paska ekstension 2" oC
selama ;# menit&
4&$&, Analisis Produk PCR dengan 3lektroforesis @el Agarosa&
Adapun cara kera analisis produk PCR dengan elektroforesis gel adalah
se'agai 'erikut :
a& Disiapkan cetakan gel elektroforesis kemudian sisir dipasang dengan
posisi tegak&
'& uat gel agarosa dengan konsentrasi yang dikehendaki! lalu dipanaskan
sampai gel agarosa terlihat 'ening atau terpolarisasi&
c& 0elanutnya gel agarosa dimasukkan ke dalam cetakan gel yang telah
disiapkan! selanutnya di'iarkan mengeras pada suhu ruang&
d& 0etelah mengeras sisir diam'il lalu gel agarosa dimasukkan ke dalam alat
elektroforesis yang 'erisi larutan *A3 'uffer ; 1
e& DNA ladder! DNA kontrol positif! DNA sampel masing-masing diam'il
se'anyak , => dan masing-masing dicampur dengan ; => loading dye
-
7/23/2019 PCR Merupakan Salah Satu Tekknik In
5/5
dan dimasukkan ke dalam sumur-sumur gel agarosa&
;$
f& 3lektroforesis dialankan dengan voltase ;## volt selama 4# menit&
g& 0elanutnya gel dimasukkan ke dalam larutan editium 'romida selama
kurang le'ih 4# menit&
h& @el diangkat dan selanutnya dicelupkan ke dalam air selama kurang
le'ih ; menit&
i& @el diletakkan di atas B transluminator&
& ragmen yang terlihat di'andingkan dengan kontrol positif dan DNA
penanda&
4&$&. /dentifikasi
0ampel yang menunukkan positif 3& coli ika terdapat pita pada ukuran
sekitar .
top related