3. metode penelitian 3.1 alat dan bahan penelitian 3.1.1 ...repository.ub.ac.id/11271/3/bab...
Post on 03-Dec-2020
4 Views
Preview:
TRANSCRIPT
3. METODE PENELITIAN
3.1 Alat dan Bahan Penelitian
3.1.1 Alat-alat Penelitian
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain wadah kultur
(erlenmayer 600 ml), aerator, selang, lampu TL, botol sprayer, pH meter, DO
meter, termometer, haemocytometer 0,1 mm (BOECO, Hamburg, Germany),
nampan, mikroskop (Olympus CX21, Jepang), bola hisap D&N, pipet volume 10
ml dan 1 ml pyrex lwaki, pipet tetes, elenmeyer 500 ml pyrex lwaki, autoklaf GEA,
mikropipet Eppendorf Research Plus, gelas ukur 100 ml, beaker glass pyrex 250
ml, handtally counter, gayung, washing bottle, cover glass, cuvet, sentrifuge, oven
RedLine RE53, timbangan analitik Radwag AS2201X, bak besar, refraktometer
(Master Refractometer, Jepang), kalkulator, lux meter Sunche,
spektrofotometer Spectroquant pharo 300, bunsen, sprayer, botol film, valcon,
Laminary Air Flow (LAF), sendok media, blue tip, white tip, pinset, triangle,tabung
reaksi, rak tabung reaksi, rotary evaporator (IKA® RV 10), colony counter,
timbangan digital, spektofotometer, botol vial, GC-MS, petridish dan vaccum
pump s VE115 Value.
3.1.2 Bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi Nannochloropsis
sp. berasal dari Balai Besar Pengembangan Budidaya Air Payau (BBPBAP)
Jepara, air laut salinitas 15 ppt, klorin, Na-Thiosulfat, alkohol 70%, tissue, kapas,
Etil acetat, Bakteri Vibrio harveyi, vitamin, pupuk walne, kertas saring GF/C
(diameter 90 mm), aquadest, metanol absolute, benang kasur, kertas koran,
kertas label,air tawar, Media Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose Agar (TCBS),
19
Media Trypticase Soy Broth (TSB), Plastic warp, Spirtus, Tetracycline disk, DMSO
10%, dan aluminium foil.
3.2 Metode Penelitian
Metode kerja pada penelitian ini menggunakan gabungan 2 metode, yaitu
metode eksperimen dan deskriptif dengan pendekatan secara kuantitatif. Menurut
Wasis (2006), metode eksperimen merupakan metode penelitian yang menguji
hipotesis berbentuk hubungan sebab-akibat melalui pemanipulasian variabel
independen (misal treatment, stimulus, kondisi) dan menguji perubahan yang
diakibatkan oleh pemanipulasian. Efek dari manipulasi disebut variabel dependen.
Selama pemanipulasian perlakuan, peneliti melakukan kontrol terhadap variabel
luar (extraneous variables) agar perubahan yang terjadi benar-benar akibat
pemanipulasian, bukan disebabkan variabel lainnya.
Menurut Sugiyono (2015), analisis deskriptif yaitu dengan memberikan
ulasan atau interpretasi terhadap data yang diperoleh sehingga menjadi lebih jelas
dan bermakna dibandingkan dengan sekedar angka-angka. Langkah-langkahnya
adalah reduksi data, penyajian data dengan bagan dan teks, kemudian penarikan
kesimpulan. Sedangkan pendekatan kuantitatif dilakukan denan cata mencatat
dan menganalisa data hasil penelitian secara eksak dengan menggunakan
perhitungan statistik.
3.3 Kerangka Operasional Penelitian
Adapun kerangka operasional pada penelitian ini (Gambar 9), yaitu
sebagai berikut :
20
Gambar 9. Kerangka Operasional Penelitian
3.4 Prosedur Penelitian
3.4.1 kultivikasi Nannochloropsis sp.
a. Sterilisasi Alat dan Bahan
Sterilisasi merupakan suatu proses membunuh mikroorganisme yang tidak
diinginkan baik pada alat-alat, bahan, atau media yang digunakan. Sterilisasi yang
digunakan dalam penelitian ini meliputi sterilisasi panas basah dan sterilisasi
kimia. Sterilisasi panas basah menggunakan autoklaf, sedangkan sterilisasi kimia
menggunakan bahan meliputi klorin 30 ppm selama 24 jam dan diberi Na
Thiosulfat 15 ppm untuk menghilangkan bau klorinnya (Suminto, 2009).
Peralatan yang terbuat dari kaca meliputi pipet volume dan pipet tetes
disterilisasi dengan menggunakan autoklaf. Peralatan yang akan disterilkan dicuci
menggunakan sabun, kemudian dibilas dengan air tawar, dan ditunggu sampai
kering. Selanjutnya peralatan tersebut dibungkus dengan menggunakan kertas
Analisis Data
21
rius. Namun sebelum dibungkus, pipet volume dan pipet tetes harus diberi kapas
dan diikat menggunakan benang kasur. Setelah itu, ditata peralatan yang akan
disterilkan di dalam autoklaf, kemudian ditutup. Prinsip kerja autoklaf adalah
sterilisasi panas basah dengan tekanan 1 atm pada suhu 1210C selama 30 menit.
Peralatan lainnya yaitu toples kaca, erlenmeyer, beaker glass, dan gelas ukur yang
digunakan untuk kultur disterilisasi cara direndam air tawar dan ditambahkan
larutan klorin 30 ppm, didiamkan selama 24 jam kemudian dinetralkan dengan
larutan Na Thiosulfat 15 ppm.
Media kultur berupa air laut 15 ppt ditambah dengan pupuk walne kemudian
disterilisasikan di autoclaf. Selanjutnya dilakukan penambahan vitamin sebelum
penataan wadah kultur dengan dosis masing-masing yaitu 1 mL/L. Wadah yang
telah diisi media steril sebanyak 1,5 liter kemudian diletakkan di atas rak kultur.
b. Penyiapan Inokulan
Bibit Nannochloropsis sp. diperoleh dari kultur murni BBPBAP Jepara.
Selanjutnya dikultur pada toples dengan volume 1,5 liter dengan media air laut
sebanyak 2 buah. Penyediaan inokulan Nannochloropsis sp. dilakukan selama 4
hari untuk mencapai fase eksponensial. Selama penyiapan inokulan tersebut suhu
ruang dijaga pada 28oC dengan intensitas cahaya 4.500 lux.
Stok Nannochloropsis sp. yang ditebar, sebelumnya dihitung kepadatan
awalnya untuk mengetahui seberapa banyak bibit Nannochloropsis sp. yang
dibutuhkan untuk ditebar pada media. Selanjutnya apabila telah diketahui
kepadatannya, ditentukan bibit Nannochloropsis sp. yang dibutuhkan dengan
metode pengenceran. Menurut Cresswel (2014), pengenceran dapat digunakan
untuk menghitung jumlah bibit plankton yang dikehendaki untuk budidaya maupun
untuk diberikan sebagai makanan larva. Jumlah bibit yang dikehendaki dihitung
menggunakan rumus sebagai berikut:
22
Keterangan:
V1 : volume bibit untuk penebaran awal (ml) N1 : jumlah bibit yang akan ditebar (sel/ml) V2 : volume budidaya yang dikehendaki (ml) N2 : jumlah bibit yang dikehendaki (sel/ml) c. Pelaksanaan Kultur Nannochloropsis sp.
Pelaksanaan kultur Nannochloropsis sp. dengan menempatkan wadah yang
telah diisi media sebanyak 1,5 liter di atas rak kultur. Intensitas cahaya diatur
dengan lampu TL 4.500 lux. Selanjutnya diaerasi, bibit Nannochloropsis sp. yang
ditebar memilki kepadatan awal 5 x105 sel/ml dengan pengenceran (Nass,2013).
Pengamatan pertumbuhan Nannochloropsis sp. dilakukan setiap hari selama
masa kultur hingga fase eksponensial hingga mencapai 5 hari waktu pengkulturan.
Selanjutnya dilakukan pemanenan untuk dilakukan proses ekstraksi.
Parameter yang diukur pada media pemeliharaan meliputi suhu, DO, pH
dilakukan satu kali sehari setiap 24 jam pada pukul 11.00 WIB.
d. Pertumbuhan Nannochloropsis sp.
Perhitungan kepadatan Nannochloropsis sp. dilakukan setiap hari dari awal
kultur hingga akhir percobaan. Perhitungan kepadatan Nannochloropsis sp.
dilakukan menggunakan metode penghitungan konsentrasi sel menggunakan 0,1
mm deep Neubauer haemocytometer dan alat bantu mikroskop dengan
menggunakan rumus perhitungan menurut Cresswel (2010) yaitu:
Jumlah (sel/ml) = x 104
23
Apabila kepadatannya tinggi maka menggunakan perhitungan yaitu
sebagai berikut:
- Laju Pertumbuhan Spesifik
Perhitungan laju spesifik dari pertumbuhan saat awal kultur hingga puncak
konsentrasi maksimum. Laju pertumbuhan spesifik dihitung dengan menggunakan
rumus Ak et al. (2008) yaitu:
µ =
keterangan:
µ : laju pertumbuhan per unit konsentrasi sel (hari-1) x1 dan x2 : konsentrasi sel pada waktu ke-1 (tl) dan waktu ke-2 (t2), berturut-turut.
- Doubling Time
Doubling time (dt) ialah waktu penggandaan dari sel Nannochloropsis sp.
Waktu penggandaan sel (dt) merupakan rata-rata waktu generasi sel membelah.
Doubling Time dihitung dari laju pertumbuhan dengan menggunakan rumus
menurut Ak et al. (2008) sebagai berikut:
3.4.2 Ekstraksi Ekstraseluler Nannochloropsis sp.
Pembuatan ekstrak ekstraseluler Nannochloropsis sp. dilakukan melalui 2
tahap yaitu sentrifugasi dan evaporasi untuk mendapatkan ekstrak murni dari
ekskresi Nannochloropsis sp. Proses ekstraksi yang pertama dilakukan adalah
sentrifugasi dengan pemisahan cairan luar tubuh Nannochloropsis sp.
menggunakan pelarut ethyl acetat. Nannochloropsis sp. dipanen pada fase
Jumlah (sel/ml) =
24
eksponensial sebanyak 1,5 liter kemudian dimasukkan kedalam 6 valcon
sebanyak 10 ml setiap valcon kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3.000
rpm selama 10 menit. Hasil sentrifugasi dari Nannochloropsis sp. diambil larutan
yang berada pada bagian atas biomassa yang mengendap di bawah sebagai
supernatan. Supernatan dituang sebanyak 5ml pada setiap valcon yang telah
diberi ethyl acetat sebanyak 5 ml. Perbandingan pemberian ethyl acetat dengan
larutan supernatan Nannochloropsis sp. adalah 1:1 yaitu 5 ml ethyl acetat dan 5
ml spernatan. Selanjutnya valcon ditutup kemudian disentrifugasi dengan
kecepatan 3.000 rpm selama 10 menit. Setelah disentrifugasi larutan yang berada
diatas larutan supernatan diambil dan ditampung pada Erlenmeyer steril sebagai
larutan sampel supernatan Nannochloropsis sp. Proses sentrifugasi untuk setiap
sampel Nannochloropsis sp. dilakukan tiga kali ulangan. Setelah seluruh sampel
terkumpul kemudian diuapkan menggunakan rotary evaporator dengan kecepatan
80 rpm selama ± 3,5 jam dengan suhu 320C. Larutan hasil penguapan kemudian
dipindahkan ke dalam botol sampel sebagai sampel hasil ekstraksi ekstraseluler
Nannochloropsis sp.. Sampel ekstrak selanjutnya disimpan dalam lemari
pendingin dengan suhu -200C hingga pemakaian.
Pelarut yang digunakan dalam penelitian ini adalah etil asetat. Etil asetat
merupakan pelarut yang baik digunakan untuk ekstraksi karena dapat dengan
mudah diuapkan, tidak higroskopis, dan memiliki toksisitas rendah. Etil asetat
bersifat semi polar sehingga mampu menarik senyawa aglikon maupun glikon.
(Wardhani dan Sulistyani, 2012).
3.4.3 Pembuatan Stock AHL (Acyl Homoserine Lactone)
AHL yang digunakan dalam penelitian ini merupakan AHL sintetis. Bahan
ini termasuk dalam salah satu autoinducer yang digunakan oleh V. harveyii untuk
menyatukan sinyal antar sel dengan sel yang lain dalam kepadatannya yaitu N-3-
25
oxo-octanoyl-l-homoserine lactone (3OC8HSL). Pembuatan stok AHL 4 mM
dilakukan dengan pengukuran AHL sebanyak 215,472 µg AHL kemudian
dilarutkan kedalam 200 µl methanol 5% untuk mendapatan konsentrasi sebesar
4mM 3OC8HSL stok larutan. Kemudian larutan stok tersebut dilarutkan dengan
perbandingan methanol dengan konsentrasi 5% dan aquades untuk mendapatkan
konsentrasi pengenceran sebanyak 200; 20; 2; 0, 5; 0,1 dan 0,05 µM
perbandingan pelarut air dan methanol ditunjukkan pada Tabel 3. AHL dengan
konsentrasi 0,05 µM diambil sebanyak 5 ml untuk dimasukkan dalam valkon dan
disimpan dalam freezer -20C sebelum digunakan untuk menghindari kerusakan
dari AHL (Acyl Homoserine Lacton).
Tabel 3. Pengenceran dan pembagian Konsentrasi AHL 3OC8HSL
Larutan AHL (µM)
Pengenceran AHL 200 (10 µl dari AHL 4mM dengan pelarut methanol)
20 (20µl dari AHL 200 µM)
2 (20µl dari AHL 20 µM)
0,5 (50µl dari AHL 2 µM)
0,1 (40µl dari AHL 0,5 µM)
0,05 (100µl dari AHL 0,1 µM)
Akuades (µl)
195 0 0 0 0 0
Methanol 5% (µl)
0 180 180 150 160 100
Volume total (µl)
200 200 200 200 200 200
3.4.4 Persiapan Media Kultur Bakteri
Pada penelitian ini bakteri V. harveyi dikultur pada media agar dan media
cair. Media agar kultur bakteri V. harveyi adalah Thiosulfat Citrate Bile Salt Sucrose
Agar (TCBSA) dengan penambahan NaCl 2%. Mayoritas isolat bakteri V.harveyi
BB120 memiliki batas toleransi kadar garam 0% sampai dengan 5% dengan
pertumbuhan bakteri sebesar 96,7% (Musa et al., 2008). Persiapan pembuatan
media agar yaitu dengan menimbang sebanyak 6,6 gram TCBSA dengan
penambahan 2 % NaCl yaitu sebanyak 1,5 gram NaCl menggunakan timbangan
26
digital. Media yang telah ditimbang selanjutnya dilarutkan ke dalam 75 ml akuades
dimasukkan ke dalam erlenmayer 250 ml. Kemudian erlenmayer ditutup dengan
kapas dan alumunium foil kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf selama 20
menit dengan suhu 1210C tekanan 1 atm. Sedangkan media cair kultur bakteri
V.harveyi digunakan media Tryptic Soy Broth (TSB) dengan penambahan NaCl
sebanyak 2%, hal pertama yang dilakukan adalah penimbangan media TSB
sebanyak 0,6 gram dengan penambahan NaCl sebanyak 0,4 gram dilarutkan
dalam 20 ml akuades dimasukkan kedalam erlenmayer 250 ml kemudian dibagi
secara merata pada 2 tabung reaksi sebanyak 9 ml untuk masing-masing tabung
reaksi. Kemudian tabung reaksi ditutup dengan kapas dan ditutup dengan
alumunium foil untuk selanjutnya disterilisasi menggunakan autoklaf selama 20
menit dengan suhu 1210C.
3.4.5 Kultur Bakteri
Isolat bakteri Vibrio harveyi diremajakan di media agar TCBS dengan
konsentrasi NaCl 2%. Kultur bakteri dilakukan menggunakan metode gores
dengan jarum ose. Sebelumnya media TCBS dituang pada cawan petri ditunggu
hingga menjadi agar kemudian ditambahkan bakteri Vibrio harveyi dengan
memanaskan jarum ose pada bunsen hingga memijar untuk mensterilkan jarum
ose. Kemudian jarum ose diaklimatisasikan pada media agar kosong supaya tidak
terlalu panas saat pengambilan bakteri. Kemudian isolat bakteri diambil
menggunakan ose dan di goreskan pada media agar. Setelah itu cawan petri yang
berisi media dan bakteri peremajaan ditutup menggunakan plastic warp untuk
diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 300C. Setelah inokulan mencapai waktu
pengkulturan 24 jam kemudian inokulan diambil 1 koloni dan dibiakkan pada media
cair yaitu TSB dengan penambahan NaCl 2%, selanjutnya diaduk menggunakan
vortex mixer kemudian diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 300C. Inokulan
dihitung kepadatannya menggunakan kurva regresi dengan nilai OD600 = 89,821 -
27
6,385. Selanjutnya bakteri yang akan digunakan pada pengujian diencerkan
terlebih dahulu pada media NaFis 0,9% steril untuk mendapatkan kepadatan
106 CFU/ml.
3.5 Pelaksanaan Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dengan kultivikasi Nannochloropsis sp. terlebih
dahulu. Bibit yang ditebar pada awal kultivikasi Nannochloropsis sp. sebanyak
5x105 sel.mL-1 (Nass, 2013). Setelah itu, pengamatan pertumbuhan
Nannochloropsis sp. dilakukan setiap hari selama masa kultur. Pemanenan
dilakukan pada awal fase stasioner untuk tahap ekstrsksi menggunakan
sentrifuge untuk mendapatkan supernatan ekstrak ekstraseluler
Nannochloropsis sp.. Setelah mendapatkan supernatan maka dilakukan
evaporasi menggunakan Rotary Evaporator untuk mendapatkan ekstrak
ekstraseluler Nannochloropsis sp.. Kemudian ekstrak digunakan untuk ui
antagonisme bakteri, fitokimia, dan quorum sensing.
3.5.1 Uji Kandungan AHL Ekstrak Ekstraseluler Nannochloropsis sp.
Menggunakan Gas Chromatography-Mass spectrometer (GC-MS)
Pengidentifikasian dengan alat GC-MS menggunakan 3 sampel yaitu sampel
ekstraksi ekstraseluler Chlorella sp. dengan etil acetat, sampel ekstrak
ekstraseluler Chlorella sp. dengan etil acetat dan ditambahkan AHL (dengan
perbandingan 1:1) dan sampel standar AHL yang telah dilarutkan menggunakan
melthanol dengan konsentrasi 20 nM. Kemudian dianalisis dengan GC-MS untuk
mengetahui spektrum massa dari masing-masing sampel dan dibandingkan antara
keduanya. Spektrum massa yang diperoleh akan terbaca oleh spectrum massa
senyawa standar yang telah diketahui dalam database yang telah terprogram pada
alat GC-MS. GC-MS yang digunakan adalah agilent type 7890 A dilengkapi
dengan kolom jenis HP5 ukuran 30 m x 250 µm x 0,25 µm dioperasikan pada suhu
28
detektor 2300C dan suhu inlet 2500C dan digunakan gas helium sebagai fasa
geraknya. Alat GC-MS terdiri dari dua komponen alat yaitu GC (Gas
Cromatography) yang berfungsi sebagai alat pendeteksi suatu senyawa dari
bahan dan akan memecah struktur kimia dari bahan tersebut. Sedangkan MS
(Mass Spectrometry) adalah alat yang mampu memecah struktur senyawa dari
pecahan yang dihasilkan oleh GC menjadi struktur yang paling kecil dan
mendeteksi spektrum massa senyawa tersebut untuk mengetahui kelimpahan dan
waktu yang diperlukan dalam pendeteksian senyawa tersebut.
Analisis data hasil GC-MS akan dianalisis secara bioinformatika. Analisis
bioinformatika digunakan untuk melakukan perancangan suatu obat dengan
komputerisasi melalui seleksi molekul target, visualisasi struktur molekul target,
dan merancang molekul obat ata senyawa kimia didasarkan pada molekul target.
Analisis bioinformatika yang digunakan terdiri dari 4 tahapan dimana pada
tahapan 1 dilakukan pencarian informasi senyawa target dengan menggunakan
software online PubChem (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) serta untuk
mendapatkan canonical smile yang berfungsi sebagai kode untuk analisis lanjutan,
tahapan 2 dianalisis dengan menggunakan software PassOnline yang berguna
untuk memprediksi keguaan senyawa target. Tahap 3 dianalisis dengan software
Stitch 5.0 program ini digunakan untuk mengetahui mekanisme senyawa target
bakeri uji dan tahap ke 4 dianalisis dengan software Uniprot yang digunakan untuk
mempelajari protein yang berikatan dengan senyawa target. Semua data hasil
analisis tersebut terhubung langsung dengan data ncbi yang merupakan library
atau perpustakaan senyawa-senyawa kimia yang diakui internasional.
29
3.5.2 Uji Antagonisme Bakteri
a. Uji Cakram
Uji antagonisme bakteri V. harveyi terhadap ekstrak ekstraseluler
Nannochloropsis sp. pada media agar menggunakan uji cakram, yaitu pengujian
antibakteri dengan mengukur diameter daerah hambatan yang terjadi di sekitar
kertas cakram yang sudah mengandung bahan antibakteri. Larutan antibakteri
disini adalah ekstrak ekstraseluler Nannochloropsis sp. yang telah dilarutkan
menggunakan pelarut DMSO 10%. Dosis yang diujikan merupakan hasil pelarutan
antara ekstrak dengan larutan pelarut diantaranya adalah 1 ppm, 10 ppm,
100 ppm, 1.000 ppm, serta 2 perlakuan kontrol positif dan negatif. Langkah
pertama yaitu dengan menuangkan media TCBSA dengan penambahan NaCl
sebanyak 2% steril ke masing-masing cawan petri dan ditunggu hingga menjadi
agar. Pengambilan bakteri dilakukan dengan menggunakan mikropipet, diambil
sebanyak 75 µl dari suspensi biakan uji, dengan kepadatan 106 CFU/ml, kemudian
diratakan menggunakan Trianggle agar pertumbuhan bakteri dapat merata. Media
agar dibiarkan mengering kurang lebih 5 menit, kemudian tempatkan kertas
cakram steril pada permukaan lempeng agar. Selanjutnya pemberian larutan
ekstrak dengan mengambil larutan ekstrak dengan konsentrasi yang telah
ditetapkan sebanyak 25 µl untuk satu kertas cakram menggunakan mikropipet,
kemudian diteteskan pada kertas cakram. Dalam 1 lempeng agar digunakan 1
macam dosis perlakuan. Kertas cakram ditekan dengan pinset, tidak perlu terlalu
keras karena akan merusak permukaan agar. Lempeng yang sudah ditempelkan
kertas cakram diinkubasi pada suhu tumbuh optimal dari bakteri V.harveyi yaitu
320C selama 24 jam. Pengamatan dilakukan selama 24 jam masa inkubasi. Zona
bening disekitar cakram merupakan petunjuk kepekaan bakteri terhadap bahan
antibakteri yang digunakan sabagai bahan uji dan dinyatakan dengan luas zona
30
hambat. Toy et al. (2015), menjelaskan cara pengukuran diameter zona hambat
menggunakan jangka sorong dengan perhitungan sebagai berikut :
Keterangan:
Dv : Diameter Vertikal Dh : Diameter horisontal Dc : Diameter Cakram
Gambar 10. Pengukuran diameter zona hambat
Setelah bakteri uji sudah tumbuh merata dan terlihat adanya zona jernih di
permukaan agar, maka luas zona bening dapat diukur dengan mengukur
diameternya dengan menggunakan jangka sorong seperti disajikan pada
Gambar 10.
b. Uji Co-Culture
Dilusi perbenihan cair terdiri dari makrodilusi dan mikrodilusi. Uji daya
hambat bakteri dilakukan dengan penentuan MIC (Minimum Inhibitation
Concentration) dan MBC (Minimum Bactericidal concentration). Pada uji MIC,
Persiapan pengujian dilakukan dengan menyiapkan tabung reaksi steril sebanyak
6 buah dan telah diberi label konsentrasi 1000 ppm, 100 ppm, 10 ppm, 1 ppm dan
kontrol bakteri V. harveyi dan kontrol media. Media cair yang digunakan untuk
setiap percobaan adalah media cair TSB (Tripticase Soya Broth) dengan
penambahan NaCL 2%. Ekstrak yang telah dilarutkan DMSO 10% pada
konsentrasi yang telah ditentukan kemudian dimasukkan kedalam tabung reaksi
31
yang berisi media pada perlakuan 1000 ppm, 100 ppm, 10 ppm dan 1 ppm masing-
masing konsentrasi sebesar 1ml. Dimasukkan 1 µl suspensi bakteri V. harveyi
dengan kepadatan 106 CFU/ml ke dalam tabung reaksi perlakuan dan kontrol,
selanjutnya divortex hingga homogen. Semua tabung diinkubasi pada suhu 300C
selama 24 jam. Setelah 24 jam, diamati dan dicatat kekeruhan pada semua tabung
dengan alat spektofotometer.
Penghitungan jumlah koloni dilakukan dengan inokulasi dari uji co-culture.
Pengenceran dengan NaFis 0,9 % dilakukan untuk memudahkan penghitungan
koloni. Pengenceran terakhir, 3 terakhir, dan 5 terakhir adalah konsentasi yang
akan ditanam untuk uji MBC. Penanaman bakteri dilakukan menggunakan metode
tuang (pour plate) dengan suspensi bakteri sebanyak 0,1 ml dari tabung
pengenceran Pengenceran terakhir, 3 terakhir, dan 5 terakhir. Media tumbuh yang
digunakan adalah media selektif TCBS. Kemudian inkubasi selama 24 jam pada
suhu 32oC. Media yang telah diinkubasi selanjutnya dihitung jumlah koloninya.
Nilai MBC ditentukan dari konsentrasi terendah ekstrak yang menunjukkan tidak
adanya pertumbuhan koloni bakteri pada cawan petri.
3.6 Analisis Data
Analisa data pada penelitian ini menggunakan metode deskriptif Menurut
Sugiyono (2015), Analisis deskriptif kualitatif yaitu dengan memberikan ulasan
atau interpretasi terhadap data yang diperoleh sehingga menjadi lebih jelas dan
bermakna dibandingkan dengan sekedar angka-angka. Langkah-langkahnya
adalah reduksi data, penyajian data dengan bagan dan teks, kemudian penarikan
kesimpulan.
top related