ACARA IVPENENTUAN PROTEIN SECARA KUANTITATIF

A. PELAKSANAAN PRAKTIKUM1. Tujuan Praktikum Untuk mencari konsentrasi protein dengan menggunakan metode biuret.2. Waktu Praktikum Sabtu, 2 Mei 20153. Tempat PraktikumLantai III, Laboratorium Kimia, Fakultas MIPA, Universitas Mataram.

B. LANDASAN TEORI Protein adalah makromolekul yang paling berlimpah didalam sel hidup dan merupakan 50 % atau lebih berat kering sel. Protein ditemukan didalam semua sel dan semua bagian sel. Protein juga amat bervariasi, ratusan jenis yang berbeda dapat ditemukan dalam satu sel. Tambahan lagi, protein mempunyai berbagai peranan biologis, karena protein merupakan instrument molekuler yang mengekspresikan informasi genetik ( lehninger,1982:107).Protein mempunyai massa molar yang tinggi, mulai dari sekitar 5000 g sampai 1 x 107 g, tetapi persen komposisi berdasar massa dari unsur-unsur di dalam protein ternyata konstan: karbon, 50 sampai 55 persen; hidrogen, 7 persen; oksigen, 23 persen; nitrogen, 16 persen; dan sulfur, 1 persen. Struktur protein biasanya dibagi menjadi empat tingkat organisasi. Struktur primer adalah sebutan untuk urutan asam amino khas dari rantai polipeptida. Struktur sekunder meliputi bagian-bagian dari rantai polipeptida yang distabilkan oleh suatu pola teratur dari ikatan-ikatan hidrogen antara gugus CO dan gugus NH dari tulang punggung., misalnya, -heliks. Istilah struktur tersier berlaku pada struktur tiga dimensi yang distabilkan oleh gaya dispersi, ikatan hidrogen, dan gaya antarmolekul lainnya. Struktur tersier berbeda struktur sekunder karena asam amino yang mengambil bagian dalam interaksi ini mungkin jaraknya berjauhan dalam rantai polipeptida. Jadi, selain berbagai interaksi di dalam rantai yang menghasilkan struktur sekunder dan tersier, kita juga harus mempertimbangkan interaksi di antara rantai. Susunan keseluruhan rantai polipeptida dinamakan struktur kuaterner (Chang, 2005: 295).Protein reseptor yang dihasilkan oleh dialisis menggunakan tabung (Serva, 5cm dm) diukur konsentrasinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang Nanodrop 280 nm. Absorbansi 1 di seperti setara panjang gelombang dengan konsentrasi protein 1 mg / ml. Sampel protein dihasilkan dari dialisis dikemas dalam Nanodrop spektrofotometer untuk 2 ml. Komputer secara otomatis akan membaca konsentrasi protein dalam sampel. Untuk blanko, itu diterapkan solusi ekstrak penyangga(Yanuhar,2011).Struktur utama mengacu amino urutan asam disebut struktur primer. Struktur primer diselenggarakan bersama oleh kovalen atau peptida obligasi, yang dibuat selama proses biosintesis protein atau terjemahan. Struktur utama dari protein ditentukan oleh gen yang sesuai dengan protein. Sebuah urutan tertentu dari nukleotida dalam DNA ditranskripsi menjadi mRNA, yang dibaca oleh ribosom dalam proses yang disebut penerjemahan. Urutan protein unik untuk protein itu, dan mendefinisikan struktur dan fungsi protein. Urutan protein dapat ditentukan dengan metode seperti Edman degradasi atau tandem spektrometri massa. Seringkali Namun, dibaca langsung dari urutan gen menggunakan kode genetik (Mandle,2012).Analisa kandungan protein dilakukan dengan metode Biuret, metode ini memanfaatkan reaksi antara logam Cu2+ dengan ikatan peptida pada protein. Kadar protein dihitung dalam satuan g/mL enzim. Kadar protein diukur berdasarkan indikator spektrum warna menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 520 nm. Kurva standard dibuat menggunakan Larutan Bovine Serume Albumin (BSA) 0; 100; 200; 300; 400; dan 500 g/mL(Wahyuningtyas,2013).Reagen Biuret mengandung CuSO4. Biuret dibentuk dengan pemanasan urea dan mempunyai struktur mirip dengan struktur pepetida dari protein. Prinsip reaksi Biuret adalah reaksi antara tembaga sulfat dalam alkali dengan senyawayang berisi dua atau lebih ikatan pepetida seperti protein yang memberikan warna ungu biru yang khas. Fungsi reagen biuret adalah untuk membentuk kompleks sehingga yang dikandung dapat diidentifikasi(Machin,2012).C. ALAT DAN BAHAN PRAKTIKUM1. Alat-alat Praktikum a. Kuvet b. UV-Visc. Tabung reaksid. Pipet tetese. Mikro pipet

2. Bahan-bahan Praktikum a. Aquadestb. Pereaksi Biuret (CuSO4: NaOH = 1:10)c. Sampel protein d. Standar protein

D. CARA KERJA1. Persiapan Larutan standarPereaksi biuret Ditambahkan pada larutan standar 0,5, 1, 2 dan 4 mg/ml dimasukkan ke dalam sampel dikocokHasil disimpan dalam es Hasil

2. Menentukan Panjang Gelombang ProteinInstrument UV-Vis Diatur panjang gelombang pada 450 nm Dimasukkanpereaksi biuret (blanko) dalam kuvet, kemudian diatur nilai absorbans nol. Dimasukkan sampel 0,5, 1, 2, 4 mg/ml dalam kuvet

Dicatatnilaiabsorbansinya Hasil Diulangi untuk panjang gelombang 520-545 nm dengan interval 5

3. InstrumenUV-VisHasilMembuat Kurva Kalibrasi Protein

Diatur pada panjang gelombang maksimum Dimasukkan blanko ke dalam kuvet, diatur hingga absorbans nol Diukur nilai absorbans dari larutan sampel protein A dan B HasilDibuat kurva kalibrasi dan ditentukan konsentrasi sampel

E. HASIL PENGAMATAN 1. Menentukan Panjang gelombang Maksimal NoPanjang gelombang (nm)Absorbansi

15200,320

25250,323

35300,330

45350,338

55400,345

65450,368

2. Membuat kurva kalibrasiNoPenambahan pereaksi biuret (mg/ml)Panjang gelombang (nm)Absorbansi (A)

10,55450,251

21,00,292

32,00,367

44,00,368

3. Menentukan konsentrasi sampelNoSampel Absorbansi (A) (nm)

1A0,246

2B0,246

F. ANALISIS DATA1. Persamaan reaksi

atau

2. Panjang gelombang maksimalNoPanjang gelombang (nm)Absorbansi

15200,320

25250,323

35300,330

45350,338

55400,345

65450,368

Kurva penentuan panjang gelombang maksimum

Berdasarkan grafik di atas maka panjang gelombang maksimum untuk pengukuran sampel protein adalah 545 nm

3. Kurva standar Penambahan pereaksi Biuret (mg/ml)

Absorbansi

0,50,251

1,00,292

2,00,367

4,00,368

Sehingga diperoleh kurva kalibrasi sebagai berikut :

4. Penentuan Konsentrasi Protein SampelDiketahui : Absorbansisampel protein A dan B = 0,246 pada = 545 nmPersamaan linear dari kurva kalibrasi : y = 3,008x-0,033Dengan mensubtitusikan nilai absorbansi cuplikan pada persamaan linearitas kurva kalibrasi sebagai nilai y,maka akan di dapat nilai konsentrasi cuplikan sebagai nilai x:y= 0,0316x + 0,2602 0,246 = 0,0316x + 0,26020,246 0,2602 = 0,0316xX= -0,44937M= 0,44937 MG. PEMBAHASANProtein adalah molekul raksasa yang terdiri dari satuan-satuan kecil penyusunnya yang disebut asam amino yang tersusun dalam urutan tertentu, dengan jumlah dan struktur tertentu. Molekul-molekul ini merupakan bahan pembangun sel hidup. Protein yang paling sederhana terdiri atas 50 asam amino, tetapi ada beberapa protein yang memiliki ribuan asam amino. Hal yang terpenting adalah ketidakhadiran, penambahan, atau penggantian satu saja asam amino pada sebuah struktur protein dapat menyebabkan protein tersebut menjadi gumpalan molekul yang tidak berguna. Setiap asam amino harus terletak pada urutan yang benar dan struktur yang tepat.Asam amino adalah monomer protein yang mempunyai dua gugus fungsi yaitu gugus amino dan gugus hidroksil. Jumlah asam amino yang terdapat di alam ada beratus ratus jumlahnya, namun yang diketahui ikut membangun protein hanya sekitar 20 macam. Sifat asam amino antara lain memiliki titik leleh di atas 200 C, larut dalam senyawa polar dan tidak larut dalam senyawa nonpolar serta memiliki momen dipol yang besar.Analisis protein dapat dilakukan dengan dua metode, yaitusecara kualitatif dan kauntitatif . Secara kualitatif terdiri atas ; reaksi Xantoprotein,reaksi Hopkins-Cole, reaksi Millon, reaksi Nitroprusida, dan reaksi Sakaguchi. Secara kuantitatif terdiri dari ;metode Kjeldahl, metode titrasi formol, metode Lowry, metode spektrofotometri visible (Biuret), dan metode spektrofotometri UV. Analisa KuantitatifAnalisis protein dapat digolongkan menjadi dua metode, yaitu: Metode konvensional, yaitu metode Kjeldahl (terdiri dari destruksi, destilasi, titrasi), titrasi formol. Digunakan untuk protein tidak terlarut.Metode modern, yaitu metode Lowry, metode spektrofotometri visible, metode spektrofotometri UV. Pada praktikum ini bertujuan untuk menentukan konsentrasi protein secara kuantitatif, yaitu dengan menggunakan metode modern yaitu metode spektrofotometri visible (Biuret). Digunakan nya metode modern ini karena protein yang akan dianalisis adalah protein yang sukar atau tidak terlarut.kemudian uji yang digunakan adalah uji biuret,dimana uji biuret digunakan karena berlaku untuk senyawaan yang mempunyai jumlah ikatan peptida > 1. Biuret dibentuk dengan pemanasan urea dan mempunyai struktur mirip dengan struktur pepetida dari protein. Prinsip reaksi Biuret adalah reaksi antara tembaga sulfat dalam alkali dengan senyawayang berisi dua atau lebih ikatan pepetida seperti protein yang memberikan warna ungu biru yang khas. Fungsi reagen biuret adalah untuk membentuk kompleks sehingga yang dikandung dapat diidentifikasiReaksi ini dapat dipakai untuk penentuan protein secara kualitatif dan kuantitatif. Slain itu juga uji buret adalah salah satu cara untuk mengidentifikasi adanya protein, dalam larutan basa biuret memberikan warna violet dengan CuSO4 karena akan terbentuk kompleks Cu2+ dengan gugus CO dan gugus NH dari rantai peptida dalam suasana basa. Pengendapan dengan logam diketahui bahwa protein mempunyai daya untuk menawarkan racun. Salting out, apabila terdapat garam-garam anorganik alam presentase tinggi dalam larutan protein, maka kelarutan protein akan berkurang, sehingga mengakibatkan pengendapan. Pengendapan dengan alkohol, penambahan pelarut organik seperti aseton atau alkohol akan menurunkan kelarutan protein pada kedudukan dan distribusi dari gugus hidrofil polar dan hidrofob polar di dalam molekul hingga menghasilkan protein yang dipol (Tim Dosen Kimia, 2011). Larutan Protein + NaOH + CuSO4 lembayung Warna kompleks ungu/violet menunjukkan adanya protein. Intensitas warna ynag dihasilkan merupakan ukuran jumlah ikatan peptida yang ada dalam protein. Ion Cu2+ dari pereaksi Biuret dalam suasana basa akan bereaksi dengan polipeptida atau ikatan-ikatan peptide yang menyusun protein, dan membentuk senyawa kompleks berwarna ungu atau violet. Reaksi ini positif terhadap dua buah ikatan peptida atau lebih, tetapi negatif untuk asam amino bebas atau ikatan peptida. Protein melarutkan hidroksida tembaga untuk membentuk kompleks warna. Reaksi pembentukan warna ini dapat terjadi pada senyawa yang mengandung dua gugus karbonil yang berikatan dengan nitrogen atau atom karbon. Adapun reaksi yang terjadi pada reaksi biuret

Kemudian praktikum ini menggunakan tiga macam reagen, yaitu reagen A, B, dan C. Reagen A mengandung CuSO4 dalam akuades. CuSO4 berfungsi sebagai penyedia ion Cu2+ untuk membentuk kompleks dengan protein. Reagen B mengandung KI dalam akuades. KI berfungsi untuk mencegah terjadinya reduksi pada Cu2+ sehingga tidak mengendap. Reagen C mengandung Na-sitrat, Na2CO3, dan NaOH. Na-sitrat dan Na2CO3 berfungsi sebagai buffer dan NaOH berfungsi untuk menyediakan seasana basa (Martono et al. 2012). Pada awal percobaan dibuat terlebih dahulu larutan standart dari larutan induk dari protein dengan konsentrasi sebesar 10 mg/mL, kemudian diencerkan dan didapat larutan standart dengan konsentrasi 0,5 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/mL, dan 4 mg/mL, dimana tujuan pengenceran yaitu untuk mengurangi konsentrasi larutan agar dapat dianalsis di Uv-Vis. Karena jika larutannya terlalu pekat maka nilai absorbansinya terlalu tinggi. Yang akan mempengaruhi pembacaan absorbansinya dimana tingkat kesalahan minimum yang masih dalam batas dapat diterima yaitu berada pada kisaran 0,5%-1%transmitan atau absorbansi 0,2-0,8 sehingga memenuhi hokum Lambert Beer. Disiapkan pula sampel dan blanko yang akan diperlakukan sama dengan standard. Sampel yang dugunakan yaitu sampel protein A(CuSO4 dalam akuades) dan B (KI dalam akuades). Dalam praktikum ini yang dijadikan blanko adalah pereaksi biuret yang terdiri dari CuSO4 : NaOH dengan perbandingan 1:10 yang diencerkan dengan aquades. Pereaksi biuret digunakan sebagai blanko karena pereaksi inilah yang digunakan sebagai pelarut. Fungsi dari larutan Blanko adalah untuk menstandarkan alat sehingga dapat diukur nilai absorbansinya.Setelah itu kedalam masing-masing larutan standart dan sampel berikut ditambahkan 4 mL reagen Biuret, kemudian dikocok sampai warna ungu terbentuk stabil dan diinkubasi selama 30 menit didalam es. Penyimpanan di dalam es dilakukan karena sifat dari protein yang cepat terdegradasi apabila ditempatkan di ruangan dengan suhu yang tidak stabil, sehingga jika tidak ditempatkan didalam es ditakutkan protein maupun enzim menjadi tidak aktif dan rusak. Kemudian Waktu inkubasi ini merupakan operating time yaitu waktu yang dibutuhkan agar seluruh protein berekasi seluruhnya dengan reagen. Setelah itu diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometrik UV-Vis. Prinsip kerja alat ini yaitu penembakan sinar uv kedalam cuplikan dengan panjang gelombang tertentu yang dimana cuplikan ini harus dilarutkan dan dimasukkan kedalam kuvet yang dimana kuvet ini dimasukkan kedalam ruang hampa sehingga didapat absorbansinya ataupun transmitannya yang langsung dibaca oleh alat ini. Absorpsi adalah kemampuan suatu zat untuk menyerap suatu cahaya sedangkan Transmitan adalah kemampuan suatu zat untuk memantulkan suatu cahaya. Daya Absorpsi dan transmitan suatu zat dipengaruhi oleh atom-atom yang menyusun cuplikan atau sampel tersebut, apabila atom-atom penyusunnya memililki daya serap tinggi maka akan memiliki transmitans rendah begitu sebaliknya.Panjang gelombang yang digunakan adalah 520-545nm, dengan interval 5 dengan 6 kali pengukuran absorbansi. Dilakukannya pengukuran pada rentang panjang gelombang tersebut dikarenakan pada panjang gelombang tersebut terjadi penyerapan intensitas cahaya yang optimal. sehingga diperoleh panjang gelombang maksimum, yang bias digunakan untuk langkah selanjutnya. Hal ini juga dilakukan untuk menentukan panjang gelombang maksimum dari masing-masing larutan yang selanjutnya digunakan untuk mengukur kurva kalibrasi.Panjang gelombang maksimum adalah panjang gelombang dimana contoh memberikan serapan (absorbansi) maksimum. Ada beberapa alasan mengapa harus menggunakan panjang gelombang maksimal, yaitu: Pada panjang gelombang maksimal, kepekaannya juga maksimal karena pada panjang gelombang maksimal tersebut, perubahan absorbansi untuk setiap satuan konsentrasi adalah yang paling besar dan disekitar panjang gelombang maksimal, bentuk kurva absorbani datar dan pada kondisi tersebut hukum Lambert-Beer akan terpenuhi serta jika dilakukan pengukuran ulang maka kesalahan yang disebabkan oleh pemasangan ulang panjang gelombang akan kecil sekali, ketika digunakan panjang gelombang maksimal. Oleh karena itu, dengan mengetahuipanjang gelombang maksimum, maka dapat meminimalisir % error dalam pengukuran absorbansi dari sampel yang akan diukur selanjutnya. Berdasarkan hasil pengamatan,pada panjang gelombang 545 nm memberikan pembacaan yang paling tinggi yaitu sebesar 0,368, sehingga panjang gelombang ini digunakan untuk mengukur sampel yang berikutnya. Mula mula dimasukkan larutan blanko yaitu pereaksi biuret yang telah diencerkan dengan aquades ke dalam spektrofotometer uv-vis, hal tersebut bertujuan untuk menyetandarkan alat yang akan digunakan dengan membuat absorbannya menjadi 0. Digunakan nya pereaksi biuret karena dapat meneruskan sinar di daerah panjang gelombang yang dipakai tetapi tidak menyerap sinar. Blanko ini berguna untuk menstabilkan absorbsi akibat perubahan voltase atau intensitas cahaya awal dari sumbercahaya.Setelah itu dilakukan pengukuran pada standar protein yang telah dibuat pada panjang gelombang maksimu yaitu 545 nm. Dari pengukuran diperoleh absorbansi berturut-turut dari konsentrasi standar 0,5, 1,0, 2,0, dan 4,0 mg/ml yaitu 0,251, 0,292, 0,367, dan 0,368, serta dilakukan pengukuran pada sampel dimana diperoleh absorbansi untuk sampel A dan B sebesar 0,246. Dari data yang diperoleh ini kemudian dibuat kurva kalibrasi yang berdasarkan Hukum Lambert-Beer dengan hubungan antara konsentrasi larutan standart protein dengan absorbansinya. Tujuannya adalah untuk mendapatkan kurva linear dan persamaan kurva linear tersebut dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi sampel dari protein. Dari hasil pengamatan diperoleh sebuah grafik tidak linear (garis lurus) yang menunjukkan bahwa tidak ada kesesuaian antara grafik yang diperoleh dengan teori yaitu persamaan pada hukum Lambert-Beer, yang menyatakan bahwa semakin besar konsentrasi suatu zat maka nilai absorbans/serapannya akan semakin besar pula. Sehingga dalam persamaan linier akan didapat persamaan y = ax, dimana akan diketahui nilai a yang digunakan untuk mencari konsentrasi sampel yang tidak diketahui. Dalam persamaan y adalah absorbans sampel tersebut, a adalah nilai slope dan x adalah konsentrasi sampel protein yang ingin dicari. Sehingga dengan memasukkan nilai y=0,246 dan a=0,0316, maka diperoleh nilai x (konsentrasi sampel protein ) sebesar -0,44397 M dengan intersep sebesar 0,246. Nilai minus yang diperoleh dari perhitungan konsentrasi sampel dikarenakan kesalahan praktikan dalam menentukan panjang gelombang maksimum sehingga berimbas pada pengukuran selanjutnya. Oleh karena konsentrasi tidak bernilai minus maka dimutlakkan konsentrasi sampel menjadi 0,44397 M.H. KESIMPULANDari percobaan diatas dapat ditarik kesimpulan bahwa diperoleh absorbansi sampel A dan B sebesar 0,246 dan dari pengukuran standar diperoleh kurva kalibrasi dengan persamaan y = 0,0316x + 0,2602. Dari persamaan ini maka diperoleh konsentrasi dari sampel protein A dan B sebesar -0,44937 M yang jika dimutlakkan menjadi 0,44937M karena konsentarsi itu tidak bernilai minus.

DAFTAR PUSTAKAChang, Raymond. 2005. Kimia Dasar: Konsep-Konsep Inti. Jilid 2/Edisi Ke-3. Jakarta: Erlangga.Lehninger, Albert L.1982. Dasar-Dasar Biokimia Jilid 1.Jakarta : Erlangga.Machin, Achmad.2012. Potensi Hidrolisat Tempe sebagai Penyedap Rasa Melalui Pemanfaatan Ekstrak Buah Nanas. Jawa :SMA Negeri 1 Dempet.Mandle,Anil Kumar,dkk. 2012. Protein Structure Prediction Using Support Vector Machine.India: Information Technology Department Samrat Ashok Technological Institute Vidisha.Wahyuningtyas,Puspita,dkk.2013. Studi Pembuatan Enzim Selulase dari Mikrofungi Trichoderma Reesei dengan Substrat Jerami Padi sebagai Katalis Hidrolisis Enzimatik pada Produksi Bioetanol.Malang : Universitas Brawijaya.Yanuhar,Uun.2011. The Function Of Receptor Protein Humpback Grouper Cromileptes Altivelis In Expression And Proliferation Of CD4 And CD8 Cells In Defence Immunity Of Viral Nervous Necrotic Infection.Malang : University Of Brawijaya.

LAPORAN MINGGUAN PRAKTIKUMBIOKIMIA IIACARA IVUJI KUANTITATIF PROTEIN

DISUSUN OLEHNAMA: LILI NURMALASARINIM: G1C012019

PROGRAM STUDI KIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS MATARAM2015