Apa itu Terapi Gen?

Terapi gen adalah penyisipan gen ke dalam sel individu dan jaringan untuk mengobati penyakit, seperti penyakit keturunan di mana suatu alel mutan merusak diganti dengan yang fungsional. Meskipun teknologi tersebut masih dalam masa pertumbuhan, telah digunakan dengan beberapa keberhasilan. Ilmiah terobosan terus bergerak terapi gen terhadap obat utama.

Para ilmuwan pertama mengambil langkah logis dari mencoba untuk memperkenalkan gen langsung ke dalam sel manusia, fokus pada penyakit yang disebabkan oleh cacat gen tunggal, seperti cystic fibrosis, hemofilia, distrofi otot dan anemia sel sabit. Namun, hal ini terbukti lebih sulit daripada bakteri memodifikasi, terutama karena masalah yang terlibat dalam menjalankan bagian besar DNA dan mengantarkan mereka ke situs yang benar pada genom relatif besar. Hari ini, studi gen kebanyakan ditujukan untuk terapi kanker dan penyakit keturunan dihubungkan dengan cacat genetik. Terapi Antisense tidak sepenuhnya suatu bentuk terapi gen, tetapi adalah terapi, terkait genetik-dimediasi.Terapi gen menggunakan vektor adenovirusTerapi gen menggunakan vektor adenovirus: Sebuah gen baru disuntikkan ke dalam vektor adenovirus, yang digunakan untuk memperkenalkan DNA dimodifikasi ke dalam sel manusia. Jika pengobatan berhasil, gen baru akan membuat protein fungsional.

Biologi terapi gen manusia masih banyak teknik rumit dan membutuhkan pengembangan lebih lanjut. Banyak penyakit dan link ketat genetik perlu dipahami lebih lengkap sebelum terapi gen dapat digunakan dengan tepat. Perdebatan seputar kebijakan publik kemungkinan penggunaan bahan rekayasa genetika pada subyek manusia telah sama-sama kompleks. peserta utama dalam perdebatan berasal dari bidang biologi, pemerintahan, hukum, kedokteran, filsafat, politik, dan agama, masing-masing membawa pandangan yang berbeda untuk diskusi.

Ada berbagai metode yang berbeda untuk mengganti atau memperbaiki gen target dalam terapi gen.

Sebuah gen normal dapat dimasukkan ke lokasi yang spesifik dalam genom untuk mengganti gen berfungsi. Pendekatan ini yang paling umum. Sebuah gen abnormal bisa ditukar gen normal melalui rekombinasi homolog. Gen abnormal bisa diperbaiki melalui mutasi reverse selektif, yang mengembalikan gen berfungsi normal. Peraturan (sejauh mana gen diaktifkan atau dimatikan) gen tertentu dapat diubah.''' Spindle transfer digunakan untuk menggantikan seluruh mitokondria yang membawa DNA mitokondria cacat

Terapi gen Jenis

Terapi gen dapat diklasifikasikan ke dalam jenis berikut:Kuman garis gen terapi

Dalam kasus garis terapi gen kuman, sel-sel kuman, yaitu sperma atau telur, dimodifikasi oleh pengenalan gen fungsional, yang biasanya diintegrasikan ke dalam genom mereka. Oleh karena itu,

perubahan akibat terapi akan diwariskan dan akan diteruskan ke generasi berikutnya. Pendekatan baru ini, secara teoritis, harus sangat efektif dalam menangkal gangguan genetik dan penyakit keturunan. Namun, banyak yurisdiksi melarang ini untuk aplikasi dalam diri manusia, setidaknya untuk saat ini, karena berbagai alasan teknis dan etika.Somatik gen terapi

Dalam kasus terapi gen somatik, gen terapeutik dipindahkan ke dalam sel somatik pasien. Setiap modifikasi dan efek akan dibatasi untuk setiap pasien saja, dan tidak akan diwariskan oleh keturunannya pasien atau generasi berikutnya.

Terapi gen Vektor Virus

Semua mengikat virus untuk host mereka dan memperkenalkan materi genetik mereka ke dalam sel inang sebagai bagian dari siklus replikasi mereka. Bahan genetik ini berisi dasar 'petunjuk' tentang bagaimana untuk menghasilkan lebih banyak salinan virus ini, pembajakan produksi normal tubuh mesin untuk melayani kebutuhan virus. Sel inang akan melaksanakan petunjuk dan menghasilkan salinan tambahan virus, menyebabkan sel lebih dan lebih menjadi terinfeksi. Beberapa jenis virus secara fisik memasukkan gen mereka ke genom host (fitur mendefinisikan retrovirus, keluarga virus yang termasuk HIV, adalah bahwa virus akan memperkenalkan reverse transcriptase enzim ke dalam host dan dengan demikian penggunaannya RNA sebagai "instruksi" ). Ini menggabungkan gen dari virus yang di antara gen sel inang untuk masa hidup sel itu.

Dokter dan ahli biologi molekular menyadari bahwa virus seperti ini dapat digunakan sebagai kendaraan untuk membawa 'baik' gen ke dalam sel manusia. Pertama, seorang ilmuwan akan menghilangkan gen pada virus yang menyebabkan penyakit. Kemudian mereka akan menggantikan mereka dengan pengkodean gen gen efek yang diinginkan (misalnya, produksi insulin dalam kasus diabetes). Prosedur ini harus dilakukan sedemikian rupa sehingga gen yang memungkinkan virus untuk menyisipkan ke dalam genom genom inangnya adalah dibiarkan utuh. Hal ini dapat membingungkan, dan memerlukan penelitian yang signifikan dan pemahaman tentang gen virus 'untuk mengetahui fungsi masing-masing. Contohnya:

''Virus ditemukan yang ulangan dengan menyisipkan gen ke dalam genom sel inang. Virus ini memiliki dua gen-A dan B. Gene A mengkode protein yang memungkinkan virus ini untuk memasukkan dirinya ke dalam genom inang. Gene B menyebabkan penyakit virus ini dikaitkan dengan. Gene C adalah "normal" atau "diinginkan" gen yang kita inginkan dalam tempat gen B. Jadi, dengan re-engineering virus sehingga gen B diganti dengan C gen, sementara memungkinkan gen A untuk berfungsi dengan benar, virus ini bisa memperkenalkan gen diperlukan - C gen ke dalam genom sel inang tanpa menimbulkan penyakit''.

Semua ini jelas suatu penyederhanaan yang berlebihan, dan banyak masalah ada yang mencegah terapi gen menggunakan vektor virus, seperti: efek masalah yang tidak diinginkan mencegah, memastikan virus akan menginfeksi sel target yang benar dalam tubuh, dan memastikan bahwa gen disisipkan tidak mengganggu setiap vital gen sudah di genom. Namun, ini mode dasar pengenalan gen saat ini menunjukkan banyak janji dan dokter dan ilmuwan bekerja keras untuk memperbaiki masalah potensial yang dapat ada. Retrovirus

Bahan genetik dalam retrovirus adalah dalam bentuk molekul RNA, sedangkan materi genetik semesta alam mereka adalah dalam bentuk DNA. Ketika retrovirus yang menginfeksi sel tuan rumah,

ia akan memperkenalkan pada RNA sama dengan beberapa enzim, yaitu reverse transcriptase dan integrase, ke dalam sel. Molekul RNA dari retrovirus harus menghasilkan salinan DNA dari molekul RNA-nya sebelum dapat diintegrasikan ke dalam bahan genetik dari sel inang. Proses produksi salinan DNA dari molekul RNA disebut transkripsi terbalik. Hal ini dilakukan oleh salah satu enzim dibawa dalam virus, yang disebut reverse transcriptase. Setelah salinan DNA diproduksi dan bebas dalam inti sel inang, maka harus dimasukkan ke dalam genom sel inang. Artinya, harus dimasukkan ke dalam molekul DNA besar di sel (kromosom). Proses ini dilakukan oleh enzim lain dicatat di integrase virus yang disebut.

Sekarang bahwa bahan genetik virus telah dimasukkan, dapat dikatakan bahwa sel inang telah dimodifikasi mengandung gen baru. Jika ini sel inang membelah kemudian, keturunannya semua akan berisi gen baru. Kadang-kadang gen dari retrovirus tidak mengungkapkan informasi mereka dengan segera.

Salah satu masalah retrovirus terapi gen menggunakan adalah bahwa enzim integrase dapat memasukkan bahan genetik virus ke setiap posisi sewenang-wenang dalam genom inang, melainkan secara acak Sorong materi genetik ke dalam kromosom. Jika bahan genetik terjadi untuk dimasukkan di tengah salah satu gen asli dari sel inang, gen ini akan terganggu (mutagenesis insersional). Jika gen terjadi menjadi salah satu mengatur pembelahan sel, pembelahan sel yang tidak terkendali (misalnya, kanker) dapat terjadi. Masalah ini baru-baru ini mulai diatasi dengan memanfaatkan nucleases seng jari atau dengan termasuk urutan tertentu seperti daerah kontrol lokus beta-globin untuk mengarahkan lokasi integrasi ke situs kromosom tertentu.

percobaan Terapi gen menggunakan vektor retroviral untuk mengobati immunodeficiency X-linked gabungan berat (X-SCID) merupakan aplikasi yang paling sukses hingga saat ini terapi gen. Lebih dari dua puluh pasien telah dirawat di Prancis dan Inggris, dengan tingginya tingkat pemulihan sistem kekebalan tubuh diamati. percobaan serupa dihentikan atau dibatasi di Amerika Serikat saat leukemia dilaporkan pada pasien yang diobati dalam uji coba terapi gen X-SCID Perancis. Sampai saat ini, empat anak dalam persidangan Perancis dan satu di sidang Inggris telah mengembangkan leukemia sebagai hasil dari mutagenesis insersional oleh vektor retroviral. Semua kecuali satu dari anak-anak merespon dengan baik pengobatan anti-leukemia konvensional. percobaan Terapi gen untuk mengobati SCID karena kekurangan enzim Deaminase Adenosin (ADA) terus berjalan relatif sukses di Amerika Serikat, Inggris, Italia dan Jepang. Adenovirus

Adenovirus merupakan virus yang membawa materi genetiknya dalam bentuk DNA beruntai ganda. Mereka menyebabkan infeksi pernafasan, usus, dan mata pada manusia (khususnya flu biasa). Ketika virus ini menginfeksi sel tuan rumah, mereka memperkenalkan molekul DNA mereka ke dalam host. Bahan genetik dari adenovirus tidak tergabung (fana) ke dalam bahan genetik sel inang. Molekul DNA dibiarkan bebas dalam inti sel inang, dan petunjuk dalam molekul DNA ditranskripsi tambahan sama seperti gen lain. Satu-satunya perbedaan adalah bahwa gen tambahan tidak direplikasi ketika sel tersebut akan mengalami pembelahan sel sehingga keturunan sel yang tidak akan memiliki gen tambahan. Akibatnya, pengobatan dengan adenovirus akan memerlukan readministration dalam populasi sel tumbuh walaupun tidak adanya integrasi ke dalam genom sel inang harus mencegah jenis kanker terlihat pada uji coba SCID. Sistem vektor telah dipromosikan untuk mengobati kanker dan memang produk gen pertama terapi untuk dilisensikan untuk mengobati kanker, Gendicine, adalah adenovirus. Gendicine, terapi gen p53 berbasis adenoviral telah disetujui oleh FDA Cina pada tahun 2003 untuk pengobatan kanker kepala dan leher. Advexin, pendekatan terapi gen serupa dari Introgen, ditolak oleh FDA Amerika tahun 2008.

Kekhawatiran tentang keselamatan vektor adenovirus terangkat setelah kematian 1999 dari Jesse

Gelsinger saat turut berpartisipasi dalam percobaan terapi gen. Sejak itu, bekerja menggunakan vektor adenovirus telah difokuskan pada versi genetik melumpuhkan virus. Adeno terkait virus

virus adeno terkait, dari keluarga parvovirus, adalah virus kecil dengan genom DNA beruntai tunggal. Jenis liar AAV dapat menyisipkan materi genetik di situs tertentu pada kromosom 19 dengan kepastian 100% dekat. Tapi AAV rekombinan, yang tidak mengandung gen virus dan hanya gen terapeutik, tidak mengintegrasikan ke dalam genom. Sebaliknya sekering rekombinan genom virus di ujung-ujungnya melalui Itr (mengulang terminal terbalik) rekombinasi untuk membentuk lingkaran, bentuk episomal yang diperkirakan menjadi penyebab utama dari ekspresi gen jangka panjang. Ada beberapa kelemahan menggunakan AAV, termasuk jumlah kecil dari DNA itu dapat membawa (kapasitas rendah) dan kesulitan dalam produksinya. Virus jenis ini sedang digunakan, tetapi, karena non-patogenik (kebanyakan orang membawa virus ini tidak berbahaya). Berbeda dengan adenovirus, kebanyakan orang diperlakukan dengan AAV tidak akan membangun respon kekebalan untuk menghapus virus dan sel yang telah berhasil diobati dengan itu. Beberapa percobaan dengan AAV berada di-pergi atau dalam persiapan, terutama berusaha untuk mengobati penyakit otot dan mata; dua jaringan di mana virus tampaknya sangat berguna. Namun, uji klinis juga telah dimulai di mana AAV vektor yang digunakan untuk menyampaikan gen ke otak. Hal ini dimungkinkan karena AAV virus dapat menginfeksi non-membagi (diam) sel, seperti neuron di mana genom mereka disajikan untuk waktu yang lama. Protein envelope pseudotyping vektor virus

Vektor virus yang dijelaskan di atas memiliki populasi sel alami mereka menginfeksi host yang paling efisien. Retrovirus memiliki rentang yang terbatas sel inang alam, dan meskipun adenovirus dan virus adeno-terkait dapat menginfeksi kisaran yang relatif lebih luas sel efisien, beberapa jenis sel yang refrakter terhadap infeksi virus ini juga. Lampiran dan masuk ke dalam sel rentan dimediasi oleh amplop protein pada permukaan virus. Retrovirus dan virus adeno terkait memiliki lapisan protein membran mereka, sedangkan adenovirus yang dilapisi dengan kedua protein amplop dan serat yang memperpanjang dari permukaan virus. Protein amplop pada masing-masing mengikat virus untuk molekul sel-permukaan seperti heparin sulfat, yang melokalisasi mereka atas permukaan host potensial, serta dengan reseptor protein spesifik yang menginduksi baik entry-mempromosikan perubahan struktural dalam protein virus , atau melokalisasi virus di endosomes dimana pengasaman lumen menginduksi ini refolding dari mantel virus. Dalam kedua kasus, masuk ke sel inang potensial memerlukan interaksi yang menguntungkan antara protein pada permukaan virus dan protein pada permukaan sel.

Untuk keperluan terapi gen, satu baik mungkin ingin membatasi atau memperluas kisaran sel rentan terhadap transduksi oleh vektor terapi gen. Untuk tujuan ini, banyak vektor telah dikembangkan di mana protein amplop virus endogen telah digantikan oleh salah satu protein amplop dari virus lain, atau dengan protein chimeric. angan-angan tersebut akan terdiri dari bagian-bagian protein virus yang diperlukan untuk dimasukkan ke dalam virion serta urutan dimaksudkan untuk berinteraksi dengan protein sel inang yang spesifik. Virus di mana protein amplop telah digantikan seperti yang dijelaskan disebut virus sebagai pseudotyped. Sebagai contoh, vektor retroviral yang paling populer untuk digunakan dalam percobaan terapi gen telah menjadi Lentivirus Simian immunodeficiency virus dilapisi dengan protein amplop, G-protein, dari virus stomatitis Vesikular. vektor ini disebut sebagai Lentivirus VSV G-pseudotyped, dan menginfeksi satu set hampir universal sel. tropisme Ini adalah karakteristik dari protein G VSV-dengan yang dilapisi vektor ini. Banyak upaya telah dilakukan untuk membatasi tropisme vektor virus untuk satu atau beberapa host populasi sel. Uang muka ini akan memungkinkan untuk administrasi sistemik dalam jumlah yang relatif kecil vektor. Potensi modifikasi sel off-target akan terbatas, dan banyak kekhawatiran dari komunitas medis akan diringankan. Kebanyakan upaya untuk membatasi tropisme telah menggunakan protein amplop

chimeric bantalan fragmen antibodi. Vektor ini menunjukkan sangat menjanjikan untuk pengembangan terapi "peluru ajaib" gen. Replikasi Vektor

Sebuah vektor replikasi-kompeten digunakan dalam replikasi sel tumor. ONYX-015 adalah replikasi-kompeten. Contoh dari hal ini adalah ONYX-015. Ini ditemukan dalam tidak adanya protein E1B-55Kd, adenovirus menyebabkan apoptosis sangat cepat terinfeksi, 53 (+) sel, dan ini menghasilkan progeni virus secara dramatis mengurangi dan tidak menyebar berikutnya. Apoptosis terutama hasil dari kemampuan AMDAL untuk menonaktifkan P300. Dalam p53 (-) sel, penghapusan E1B 55kd tidak memiliki konsekuensi dalam hal apoptosis, dan replikasi virus mirip dengan virus tipe liar, mengakibatkan pembunuhan besar-besaran sel.

Sebuah vektor replikasi-cacat menghapus beberapa gen penting. Gen ini dihapus masih diperlukan dalam tubuh sehingga mereka diganti dengan baik virus pembantu atau molekul DNA. Cis dan elemen trans-acting

vektor Replikasi-cacat selalu mengandung "transfer membangun". Transfer membangun membawa gen yang akan transduced atau "transgen". Pengalihan ini membangun juga membawa urutan yang diperlukan untuk fungsi umum dari genom virus: urutan kemasan, mengulangi untuk replikasi dan, bila diperlukan, priming transkripsi terbalik. Ini adalah elemen cis-acting mata uang, karena mereka perlu berada di bagian yang sama DNA sebagai genom virus dan gen yang diinginkan. unsur Trans-acting adalah elemen virus, yang dapat dikodekan pada sebuah molekul DNA yang berbeda. Misalnya, protein struktural virus dapat dinyatakan dari unsur genetik yang berbeda dari genom virus. Herpes Simplex Virus

Herpes Simplex Virus adalah virus Neurotropik manusia. Ini kebanyakan diperiksa untuk transfer gen dalam sistem saraf. Jenis liar HSV-1 virus mampu menginfeksi neuron. neuron yang terinfeksi tidak ditolak oleh sistem kekebalan tubuh. Meskipun virus laten tidak transcriptionally jelas, itu tidak memiliki promotor spesifik neuron yang dapat terus berfungsi secara normal. Antibodi terhadap HSV-1 yang umum pada manusia, namun komplikasi karena infeksi herpes agak jarang. Non-virus metode

Metode Non-virus ini keuntungan tertentu dari metode virus, dengan produksi skala sederhana besar dan imunogenisitas rendah tuan rumah yang hanya dua. Sebelumnya, rendahnya tingkat transfeksi dan ekspresi gen mengadakan metode non-virus pada posisi yang kurang menguntungkan, namun kemajuan terbaru dalam teknologi vektor telah menghasilkan molekul dan teknik dengan efisiensi transfeksi mirip dengan virus. Naked DNA

Ini adalah metode paling sederhana transfeksi non-virus. Uji klinis dilakukan injeksi intramuskular plasmid DNA telanjang telah terjadi dengan beberapa keberhasilan, namun, istilah telah sangat rendah dibandingkan dengan metode lain transfeksi. Selain uji coba dengan plasmid, telah terjadi uji coba dengan produk PCR telanjang, yang telah berhasil sama atau lebih besar. Keberhasilan ini, bagaimanapun, tidak membandingkan dengan metode lainnya, yang mengarah ke penelitian metode yang lebih efisien untuk pengiriman DNA telanjang seperti elektroporasi, sonoporation, dan penggunaan "pistol gen", yang menembak partikel emas dilapisi DNA ke dalam sel dengan menggunakan gas bertekanan tinggi atau senapan kaliber .22 terbalik. Oligonukleotida

Penggunaan oligonukleotida sintetik dalam terapi gen adalah untuk menonaktifkan gen yang terlibat

dalam proses penyakit. Ada beberapa metode dengan mana ini tercapai. Salah satu strategi menggunakan antisense spesifik untuk gen target untuk mengganggu transkripsi gen yang salah. Lain menggunakan molekul kecil RNA yang disebut siRNA untuk sinyal sel untuk membelah sekuens unik tertentu dalam transkrip mRNA gen rusak, mengganggu terjemahan dari mRNA yang salah, dan karena ekspresi gen. Strategi lebih lanjut menggunakan double stranded oligodeoxynucleotides sebagai umpan untuk faktor-faktor transkripsi yang diperlukan untuk mengaktifkan transkripsi gen target. Transkripsi faktor mengikat umpan bukan promotor gen yang salah, yang mengurangi transkripsi gen target, menurunkan ekspresi. Selain itu, DNA beruntai tunggal oligonukleotida telah digunakan untuk mengarahkan perubahan basa tunggal dalam gen mutan. oligonukleotida ini dirancang untuk anil dengan melengkapi untuk gen target dengan pengecualian basis pusat, dasar target, yang berfungsi sebagai dasar template untuk perbaikan. Teknik ini disebut sebagai oligonukleotida memperbaiki gen ditengahi, ditargetkan perbaikan gen, atau perubahan nukleotida yang ditargetkan. Lipoplexes dan polyplexes

Untuk meningkatkan pengiriman DNA baru ke dalam sel, DNA harus dilindungi dari kerusakan dan masuk ke dalam sel tersebut harus difasilitasi. Untuk ini berakhir yang baru molekul, lipoplexes dan polyplexes, telah diciptakan yang memiliki kemampuan untuk melindungi DNA dari degradasi yang tidak diinginkan selama proses transfeksi.

Plasmid DNA bisa ditutupi dengan lipid dalam struktur organisasi seperti misel atau liposom sebuah. Ketika struktur terorganisir dikomplekskan dengan DNA itu disebut lipoplex sebuah. Ada tiga jenis lipid, anionik (bermuatan negatif), netral, atau kationik (bermuatan positif). Awalnya, lipid anionik dan netral digunakan untuk pembangunan lipoplexes untuk vektor sintetis. Namun, meskipun fakta bahwa ada sedikit toksisitas terkait dengan mereka, bahwa mereka yang kompatibel dengan cairan tubuh dan bahwa ada kemungkinan beradaptasi mereka untuk menjadi jaringan khusus, mereka sangat rumit dan memakan waktu untuk memproduksi apa perhatian itu berubah menjadi yang kationik versi.

lipid Kationik, karena muatan positif mereka, pertama kali digunakan untuk menyingkat molekul DNA bermuatan negatif sehingga memudahkan enkapsulasi DNA ke liposom. Kemudian ditemukan bahwa penggunaan lipid kationik secara signifikan meningkatkan stabilitas lipoplexes. Juga sebagai akibat biaya mereka, liposom kationik berinteraksi dengan membran sel, endositosis secara luas diyakini sebagai rute utama di mana sel-sel serapan lipoplexes. Endosomes terbentuk sebagai hasil dari endositosis, namun, jika gen tidak dapat dilepaskan ke sitoplasma oleh membran melanggar endosome, mereka akan dikirim ke lisosom mana DNA semua akan hancur sebelum mereka bisa mencapai fungsi mereka. Hal ini juga ditemukan bahwa meskipun lipid kationik sendiri dapat mengembun dan merangkum DNA menjadi liposom, efisiensi transfeksi sangat rendah karena kurangnya kemampuan dalam hal "melarikan diri endosomal". Namun, ketika pembantu lemak (biasanya lemak electroneutral, seperti DOPE) ditambahkan untuk membentuk lipoplexes, efisiensi transfeksi jauh lebih tinggi diamati. Kemudian, ia menyadari bahwa lipid tertentu memiliki kemampuan untuk mengguncang endosomal membran sehingga memudahkan keluarnya DNA dari lipid fusogenic endosome, karena itu mereka disebut lipid. Meskipun kationik liposom telah banyak digunakan sebagai alternatif untuk vektor pengiriman gen, toksisitas dosis tergantung dari lipid kationik juga diamati yang dapat membatasi penggunaan terapi mereka.

Penggunaan paling umum dari lipoplexes telah di transfer gen ke dalam sel-sel kanker, dimana gen yang disediakan telah mengaktifkan gen supresor tumor kontrol dalam sel dan menurunkan aktivitas onkogen. Studi terbaru menunjukkan lipoplexes akan berguna dalam transfecting sel epitel pernapasan, sehingga mereka dapat digunakan untuk pengobatan penyakit pernapasan genetik seperti cystic fibrosis.

Kompleks polimer dengan DNA polyplexes disebut. polyplexes Sebagian terdiri dari polimer kationik dan produksi mereka diatur oleh interaksi ionik. Satu perbedaan besar antara metode tindakan polyplexes dan lipoplexes adalah bahwa polyplexes tidak dapat melepaskan memuat DNA mereka ke dalam sitoplasma, sehingga untuk tujuan ini, bersama-transfeksi dengan agen endosome-litik (agar terjadi lisis endosome yang dibuat selama endositosis, proses oleh yang polyplex memasuki sel) seperti yang dilemahkan adenovirus harus terjadi. Namun, hal ini tidak selalu terjadi, polimer seperti polyethylenimine memiliki metode mereka sendiri gangguan endosome seperti halnya kitosan dan trimethylchitosan. Metode Hybrid

Karena setiap metode transfer gen memiliki kekurangan, ada beberapa metode yang dikembangkan hibrida yang menggabungkan dua atau lebih teknik. Virosomes adalah salah satu contoh, mereka menggabungkan liposom dengan dilemahkan HIV atau virus influenza. Ini telah terbukti memiliki transfer gen lebih efisien dalam sel epitel pernapasan dari baik metode load atau liposomal saja. Metode lain melibatkan pencampuran vektor virus lainnya dengan lipid kationik atau virus hybridising. Dendrimers

dendrimer adalah makromolekul yang sangat bercabang dengan bentuk bulat. Permukaan partikel tersebut dapat difungsikan dalam banyak cara dan banyak sifat-sifat yang dihasilkan membangun ditentukan oleh permukaannya.

Secara khusus adalah mungkin untuk membangun dendrimer kationik, satu yaitu dengan muatan permukaan positif. Ketika di hadapan materi genetik seperti DNA atau RNA, complimentarity biaya mengarah ke sebuah asosiasi sementara asam nukleat dengan dendrimer kationik. Pada mencapai tujuan kompleks dendrimer-asam nukleat ini kemudian dibawa ke dalam sel melalui endositosis.

Dalam beberapa tahun terakhir patokan bagi agen transfeksi telah lipid kationik. Keterbatasan ini reagen bersaing telah dilaporkan meliputi: kurangnya kemampuan untuk transfect sejumlah jenis sel, kurangnya kemampuan yang kuat penargetan aktif, ketidakcocokan dengan model binatang, dan toksisitas. Dendrimers menawarkan konstruksi kovalen yang kuat dan kontrol ekstrem struktur molekul, dan karena itu ukuran. Bersama ini memberikan keuntungan yang menarik dibandingkan dengan pendekatan yang ada.

dendrimers Memproduksi secara historis merupakan proses yang lambat dan mahal yang terdiri dari berbagai reaksi lambat, rintangan yang sangat dibatasi pembangunan komersial mereka. Perusahaan yang berbasis di Michigan Nanotechnologies Dendritic menemukan sebuah metode untuk menghasilkan dendrimers menggunakan kinetis didorong kimia, sebuah proses yang tidak hanya mengurangi biaya dengan besaran tiga, tapi juga memotong waktu reaksi dari lebih dari satu bulan untuk beberapa hari. Ini baru "Priostar" dendrimers dapat secara khusus dibangun untuk membawa muatan DNA atau RNA yang transfects sel pada efisiensi yang tinggi dengan toksisitas sedikit atau tidak ada.

Terapi gen Masalah

Untuk keamanan terapi gen, penghalang Weismann adalah fundamental dalam pemikiran saat ini. umpan balik Soma-ke-germline karena itu harus mustahil. Namun, ada indikasi bahwa penghalang Weissman bisa dilanggar. Salah satu cara itu mungkin bisa dilanggar adalah jika pengobatan entah bagaimana keliru dan menyebar ke testis dan karena itu akan menginfeksi germline terhadap niat

dari terapi.

Beberapa masalah gen terapi meliputi:

sifat hidup pendek terapi gen - Sebelum terapi gen dapat menjadi kesembuhan yang permanen untuk kondisi apapun, DNA terapeutik diperkenalkan ke dalam sel target harus tetap fungsional dan sel-sel yang berisi DNA terapeutik harus berumur panjang dan stabil. Masalah dengan mengintegrasikan DNA terapi ke dalam genom dan sifat cepat membagi sel banyak mencegah terapi gen dari mencapai manfaat jangka panjang. Pasien harus menjalani beberapa putaran terapi gen. Respon imun - Kapan saja benda asing diperkenalkan ke dalam jaringan manusia, sistem kekebalan tubuh telah berevolusi untuk menyerang penyerbu. Risiko merangsang sistem kekebalan tubuh dengan cara yang mengurangi efektivitas terapi gen selalu kemungkinan. Selanjutnya, meningkatkan respons sistem kekebalan tubuh untuk penyerang yang telah dilihat sebelumnya membuat sulit bagi terapi gen harus diulang pada pasien. Masalah dengan vektor virus - Virus, pembawa gen pilihan dalam studi yang paling terapi, menyajikan berbagai masalah potensial bagi toksisitas-pasien, respon imun dan inflamasi, dan kontrol gen dan masalah penargetan. Selain itu, selalu ada ketakutan bahwa vektor virus, begitu di dalam pasien, dapat memulihkan kemampuannya untuk menyebabkan penyakit. gangguan Multigene - Kondisi atau gangguan yang timbul dari mutasi pada gen tunggal adalah kandidat terbaik untuk terapi gen. Sayangnya, beberapa gangguan yang paling sering terjadi, seperti penyakit jantung, tekanan darah tinggi, penyakit Alzheimer, arthritis, dan diabetes, disebabkan oleh efek gabungan dari variasi di banyak gen. Multigene atau gangguan multifaktorial seperti ini akan sangat sulit untuk mengobati secara efektif dengan menggunakan terapi gen. Kesempatan merangsang tumor (mutagenesis insersional) - Jika DNA terintegrasi di tempat yang salah dalam genom, misalnya dalam gen penekan tumor, bisa menyebabkan tumor. Hal ini terjadi di uji klinis untuk X-linked immunodeficiency gabungan yang parah (X-SCID) pasien, di mana sel-sel induk hematopoietik adalah transduced dengan transgen korektif menggunakan retrovirus, dan ini menyebabkan perkembangan leukemia sel T dalam 3 dari 20 pasien .

Kematian telah terjadi akibat terapi gen, termasuk yang dari Jesse Gelsinger.

. PENDAHULUAN

Sejak ditemukan bahwa informasi genetik pada semua makhluk hidup ternyata terdapat pada DNA, maka pengetahuan genetika dan biologi molecular tumbuh dengan sangat pesat. Secara genetika sejumlah penyakit keturunan telah diidentifikasi dan diharapkan gen penyebab dapat diklon dan dikarakterisasi. Dunia pengobatan merasakan keuntungan dengan perkembangan biologi molekular melalui penemuan cara diagnosis dan penemuan obat. Lebih lanjut, pada masa mendatang diharapkan pengetahuan tentang penyakit pada aras molekular akan lebih banyak dipahami sehingga akan mempermudah pengobatan atau peningkatan prognosis suatu penyakit. Dengan cara memasukan gene terapetik kedalam sel pasien, maka fungsi gen yang rusak digantikan oleg gen terapetik. Terapi gen dikelompokkan dalam terapi gena germ–line dan terapi gen somatic. Terapi gen germ–line bermaksud memasukkan gen kedalam sel–germ atau sel embrio omnipoten. Terapi gen germ–cell pada manusia tidak diperkenankan karena alasan moral. Terapi gen somatic dilakukan dengan memasukkan suatu gen ke dalam sel somatic. Pertimbangan moral pada terapi gen somatic telah dibicarakan secara panjang lebar

dan menghasilkan suatu persetujuan untuk memanipulasi genetic sel somatic pasien dengan tujuan membetulkan kerusakan gen yang ada. Cara terapi gen saat ini dengan cara menambahkan suatu gen sehat pada pasien. II. ISI A. Definisi Pengobatan dengan terapi gen telah berkembang dengan pesat sejak clinical trial terapi ini pertama kali diperkenalkan pada tahun 1990. Terapi gen adalah teknik untuk mengoreksi gen-gen yang cacat yang bertanggung jawab terhadap suatu penyakit. Selama ini pendekatan terapi gen yang berkembang adalah menambahkan gen-gen normal ke dalam sel yang mengalami ketidaknormalan. Pendekatan lain adalah melenyapkan gen abnormal dengan gen normal dengan melakukan ekombinasi homolog. Pendekatan ketiga adalah mereparasi gen abnormal dengan cara mutasi balik selsektif, sedemikian rupa sehingga akan mengembalikan fungsi normal gen tersebut. Selain pendekatan-pendekatan tersebut ada pendekatan lain untuk terapi gen tersebut, yaitu mengendalikan regulasi ekspresi gen abnormal tersebut. B. Terapi Gen Ex Vivo Sel dari sejumlah organ atau jaringan ( seperti kulit, system hemopoietik, hati ) atau jaringan tumor dapat diambil dari pasien dan kemudian dibiakkan dalam laboratorium. Selama pembiakkan, sel itu dimasuki suatu gen tertentu untu kterapi penyakit itu. Kemudian diikuti dengan reinfusi atau reimplementasi dari sel tertransduksi itu ke pasien. Penggunaan sel penderita untuk diperlakukan adalah untuk meyakinkan tidak ada respon imun yang merugikan setelah infuse atau transplantasi. Terapi gen ex vivo saat ini banyak digunakan pada uji klinis, kebanyakan menggunakan vector retrovirus untuk memasukkan suatu gen ke dalam sel penerima. Salah satu contoh terapi gen yang telah digunakan adala gen p53 untuk kondisi karsinoma squamus kepala dan leher sedangkan sel targetnya adalah sel tumor. C. Terapi Gen In Vivo Organ seperti paru paru, otak, jantung tidak cocok untuk terapi gen ex vivo, sebab pembiakan sel target dan retransplantasi tidak mungkin dilakukan. Oleh karena itu terapi gen somatic, dilakukan dengan pemindahan gen in vivo. Dengan kata lain dengan memberikan gen tertentu baik secara local maupun sistemik. Penggunaan vector retrovirus memerlukan kondisi sel target yang sedang membelah supaya dapat terinfeksi. Akan tetapi, banyak jaringan yang merupakan target terapi gen, sebagian besar selnya dalam keadaan tidak membelah. Akibatnya, sejumlah strategi diperlukan baik penggunaan system vector virus maupun non-virus untuk menghantarkan gen terapetik ke sel target yang sangat bervariasi seperti kulit, otot, usus, liver dan sel darah. System penghantar gen in vivo yang ideal adalah efisiensi tinggi masuknya gen terapetik dalam sel target. Gen itu dapat masuk ke inti sel dengan sedikit mungkin terdegradasi, dan gen itu tetap terekspresi walaupun ada perubahan kondisi. D. Penyakit Target Untuk Terapi Gen Sejak kanker diketahi sebagai suatu penyakit genetik yang disebabkan oleh mutasi atau perubahan – perubahan lain pada gen. penggunaan teknik DNA rekombinan semakin sering digunakan dalam menghambat perkembangan penyakit tersebut. Salah satu metode yang sering diandalkan adalah pendekatan terapi gen. Terapi gen merupakan pendekatan baru dalam pengobatan kanker, yang saat ini masih bersifat eksperimental. Sejak diketahui bahwa kanker merupakan penyakit akibat mutasi gen, para ahli mulai berfikir bahwa terapi gen tentu efektif untuk mengobatinya. Apalagi kanker jauh lebih banyak penderitanya dibandingkan dengan penyakit keturunan akibat kelainan genetis yang selama ini diobati dengan terapi gen. Saat ini para ilmuwan sedang mencoba beberapa cara kerja terapi gen untuk pengobatan kanker, yaitu : a. Menambahkan gen sehat pada sel yang memiliki gen cacat atau tidak lengkap. Contohnya sel sehat memiliki gen penekan tumor seperti p53 yang mencegah terjadinya kanker. Setelah diteliti, ternyata pada kebanyakan sel kanker gen p53 rusak atau bahkan tidak ada. Dengan memasukkan gen p53 yang normal ke dalam sel kanker, diharapkan sel tersebut akan normal dan sehat kembali. b. Menghentikan aktivitas gen kanker (oncogenes). Gen kanker merupakan hasil mutasi dari sel normal, yang menyebabkan sel tersebut membelah secara liar menjadi kanker. Ada juga gen yang menyebabkan sel kanker bermetastase (menjalar) ke bagian tubuh lain. Menghentikan aktivitas gen ini atau protein yang dibentuknya dapat

mencegah kanker membesar maupun menyebar. c. Menambahkan gen tertentu pada sel kanker sehingga lebih peka terhadap kemoterapi maupun radiasi, atau menghalangi kerja gen yang dapat membuat sel kanker kebal terhadap obat-obat kemoterapi. Juga dicoba cara lain, membuat sel sehat lebih kebal terhadap kemoterapi dosis tinggi, sehingga tidak menimbulkan efek samping. d. Menambahkan gen tertentu sehingga sel-sel tumor/kanker mudah dikenali dan dihancurkan oleh sostem kekebalan tubuh. Atau sebaliknya, menambahkan gen pada sel-sel kekebalan tubuh sehingga lebih mudah terdeteksi dan menghancurkan sel-sel kanker. e. Menghentikan gen yang berperan dalam pembentukan jaringan pembuluh darah baru atau menambahkan gen yang bisa mencegah angiogenesis. Jika suplai darah dan makannya terhenti, kanker akan berhenti tunbuh atau bahkan mengecil lalu mati. f. Memberikan gen yang mengaktifkan protein toksik tertentu pada sel kanker, sehingga sel tersebut melakukan aksi “bunuh diri” (apoptosis). Satu dari banyak tantangan dalam pengembangan pendekatan DNA rekombinan adalah bagaimana mengantarkan “gen pembunuh” hanya ke dalam sel tumor dan tidak ke sel normal. Pengantaran yang selektif merupakan satu aspek teknik yang sulit dalam terapi gen. Terapi gen yang paling berhasil dilakukan adalah yang menggunakan pendekatan ex vivo (di luar organisme hidup), di mana sel dipindahkan dari tubuh, dimanipulasi, dan selanjutnya dikembalikan ke tubuh, tetapi pendekatan ex vivo tidak dapat digunakan pada sel tumor karena sel tumor tidak dapat dipindahkan secara total dari tubuh.Walau demikian, suatu pendekatan in vivo (di dalam organisme hidup) yang menjanjikan telah berhasil dilakukan dalam mengatasi sel tumor, yaitu menggunakan gen virus herpes simplex-timidin kinase (HSV-tk) sebagai “gen pembunuh”. Gen tersebut diisolasi dari virus herpes simplex, suatu virus penyebab penyakit herpes.Tahap-tahap medis dalam terapi gen menggunakan gen HSV-tk untuk mematikan sel-sel glioblastoma multiform (suatu tumor otak), secara garis besar dapat dijelaskan sebagai berikut: 1) Operasi pembuangan bagian tumor yang dapat dibuang dari otak. 2) Pemasukan sel penghasil vektor yang membawa gen pembunuh (gen HSV-tk) secara injeksi atau implantasi sisa tumor yang tidak dapat dibuang dari otak. 3) Pemulihan setelah operasi serta pemeriksaan hasil menggunakan Magnetik Resonance Imaging-Scan (MRI-Scan) 4) Pemberian ganciclovir (GCV) secara intra-venous sesuai dosis. GCV merupakan turunan Acyclovir yang dikembangkan pada tahun 1970 untuk pengobatan infeksi virus herpes simplex. Obat ini merupakan analog nukleosida yang dapat difosforilasi oleh kinase timidin virus menjadi bentuk GCV-monofosfat.kemudian enzim seluler dapat mengubah bentuk monofosfat itu menjadi bentuk GCV-di dan trifosfat yang bersifat toksik, dengan fungsi sebagai terminator sintesis DNA yang berarti menghambat polimerasi DNA virus.enzim HSV-tk bekerja seribu kali lebih efisien pada fofsforilisasi GCV menjadi GCV-monofosfat daripada kinase timidin seluler. Oleh karena itu GCV tidak toksik pada sel tanpa HCV-tk pada konsentrasi terapi 1-10µM. Akan tetapi, pada penggunaan yang lama muncul neuropenia. GCV-trifosfat yang toksik ini menunjukan kemampuan melewati membran sel ditunjukan dengan waktu paruhnya dalam sel 6 kali lebih lama ( 18-24 jam) daripada GCV. Salah satu keuntungan dari mekanisme aksi ini bahwa sel tumor yang resisten terhadap obat tumor,seperti sel kanker overian SKOV-3, peka terhadap GCV jika sel itu diberi gen HCV-tk. 5) Perlakuan dengan penyinaran berenergi tinggi. Penyinaran dilakukan ke bagian yang telah pulih, dua atau tiga minggu setelah pembedahan. Kemudian setiap dua bulan, tumor otak pasien dipantau dengan MRI-Scan dan setelah satu tahun diharapkan terapi gen tersebut memberikan hasil yang positif. Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan oleh D Klatzmann dan koleganya di Department of Immunology, Hopital Pitie-Salpetriere, Paris, Perancis, yang dipublikasikan dalam Hum Gene Ther Volume 9 tahun 1998, disimpulkan bahwa pengobatan melalui terapi gen dengan memanfaatkan gen HSV-tk untuk mematikan glioblastoma multiform memberikan hasil yang memuaskan. Terapi gen tersebut dilakukan terhadap 12 pasien, di mana nilai tengah waktu bertahan hidup dari semua pasien mencapai 206 hari, dengan 25

persen dari pasien mampu bertahan hidup lebih dari 12 bulan. Pada bulan ke-4 setelah terapi gen, 4 dari 12 pasien tidak memperlihatkan adanya tumor otak, nilai tengah waktu bertahan hidup 4 pasien tersebut adalah 528 hari. Satu pasien dari 12 pasien tersebut tidak terdeteksi tumor otaknya dan dinyatakan bebas dari tumor otak 2,8 tahun setelah menjalani terapi gen tersebut. Mekanisme biokimia dan penggunaan teknik-teknik DNA rekombinan di balik suksesnya terapi gen in vivo (langsung ke sel tumor) untuk mematikan glioblastoma multiform, seperti yang dilakukan D Klatzmann dan koleganya, dapat dijelaskan sebagai berikut. Pengantaran “gen pembunuh” (gen HSV-tk) secara selektif ke sel-sel tumor memerlukan suatu kendaraan (vektor). Vektor yang sering digunakan dalam terapi gen adalah suatu retrovirus. Retrovirus adalah virus berselubung yang genomnya berupa RNA untai tunggal sepanjang lebih kurang 10 kilobasa. Di dalam vektor retrovirus yang akan digunakan untuk membawa gen HSV-tk ke dalam sel tumor, beberapa “gen non-esensial”, seperti gag, pol, dan env, yang secara langsung mengkode protein-protein capsid, enzim-enzim untuk replikasi serta protein-protein pada selubung, digantikan oleh gen HSV-tk. Dengan demikian, dihasilkan suatu vektor retroviral rekombinan yang membawa gen HSV-tk. Vektor retroviral rekombinan biasanya diproduksi di dalam sel-sel penghasil vektor (vector producer cells/VPC) yang diisolasi dari fibroblast tikus. VPC berisi gen HSV-tk yang mengode suatu “prodruk” (HSV-tk) kemudian dimasukkan ke dalam sel tumor dengan cara disuntikkan atau dapat juga melalui implantasi menggunakan tuntunan suatu instrumen yang disebut Magnetic Resonance Imaging-Guided Stereotactic Implantation. Gen HSV-tk yang telah berhasil masuk ke dalam sel tumor selanjutnya terekspresi dan menghasilkan HSV-tk (suatu enzim virus yang berperan sebagai katalisator reaksi fosforilasi). HSV-tk di dalam sel tumor berubah sensitivitasnya terhadap “drug” ganciclovir (GCV) yang dimasukkan secara intra-venous (infus) ke dalam tubuh pasien. GCV-P selanjutnya diubah oleh enzim kinase dalam sel menjadi ganciclovir trifosfat (GCV-PPP), suatu inhibitor poten terhadap enzim DNA polimerase dan menyebabkan kematian sel tumor. Kematian sel tumor terjadi karena DNA polimerase yang memiliki fungsi vital pada proses replikasi DNA di dalam sel tumor terhambat (terinhibisi) oleh GCV-PPP. Retrovirus menginfeksi hanya sel-sel yang sedang membelah, yaitu sel-sel tumor, tetapi tidak menginfeksi sel-sel otak terdiferensiasi normal. Selanjutnya, suatu mekanisme yang disebut gap junction terjadi di dalam sel-sel tumor, di mana GCV-PPP berdifusi dari sel-sel tumor terinfeksi ke sel-sel tumor tetangga yang belum terinfeksi dan mematikan sel-sel tumor tetangga tersebut. Efek mematikan ini dikenal sebagai bystander effect. Proses tersebut berlangsung secara terus-menerus sampai semua sel-sel tumor mati.