ENZIM (SIFAT – SIFAT UMUM)

Kontribusi : Wheny

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Enzim merupakan polimer biologik yang mengatalisis lebih dari satu proses

dinamik yang memungkinkan kehidupan seperti yang kita kenal sekarang. Sebagai

determinan yang menentukan kecepatan berlangsungnya berbagai peristiwa fisiologik,

enzim memainkan peranan sentral dalam masalah kesehatan dan penyakit. Pemecahan

makanan untuk memasok energi serta unsur-unsur kimia pembangunan tubuh (building

blocks); perakitan building blocks tersebut menjadi protein, membran sel, serta DNA

yang mengkodekan informasi genetik; dan akhirnya penggunaan energi untuk

menghasilkan gerakan sel, semua ini dimungkinkan dengan adanya kerja enzim-enzim

yang terkoordinasi secara cermat. Sementara dalam keadaan sehat semua proses

fisiologis akan berlangsung dalam cara yang tersusun rapi serta teratur dan homeostatis

tetap dipertahankan, homeostatis dapat mengalami gangguan berat pada keadaan

patologis. Sebagai contoh, cedera jaringan hebat yang mencirikan penyakit sirosis

hepatis dapat menimbulkan gangguan berat pada kemampuan sel membentuk enzim-

enzim yang mengatalisis berbagai proses metabolisme penting seperti sintesis ureum.

Ketidakmampuan mengubah ammonia yang toksik menjadi ureum yang nontoksik

sebagai akibat dari penyakit tersebut akan diikuti dengan intoksikasi ammonia, dan

akhirnya koma hepatikum. Suatu spektrum penyakit genetik langka tetapi yang sering

sangat menurunkan keadaan umum penderitanya dan kerap fatal, memberi contoh-

contoh tambahan dramatis tentang konsekuensi fisiologis drastis yang dapat menyertai

gangguan terhadap aktivitas bahkan hanya satu enzim.

Menyusul suatu cedera jaringan berat (misal, infark jantung atau paru, cedera

remuk pada anggota gerak) atau pertumbuhan sel yang tidak terkendali (misal,

karsinoma prostat), enzim yang mungkin khas bagi jaringan tertentu akan dilepas ke

dalam darah. Dengan demikian, pengukuran terhadap enzim intrasel ini didalam serum

dapat memberikan informasi diagnostik dan prognostic yang tidak ternilai bagi dokter.

1

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang di atas, maka dapat dirumuskan beberapa

permasalahan sebagai berikut:

1) Klasifikasi Enzim berdasarkan tipe dan mekanism reaksi.

2) Enzim memerlukan koenzim.

3) Enzim murni berfungsi sangat penting bagi pemahaman struktur, fungsi,

mekanisme reaksi, dan pengaturan enzim.

4) Enzim dapat ditemukan di dalam organel spesifik

1.3 Tujuan

Berdasarkan rumusam masalah maka makala ini bertujuan sebagai berikut:

1) Mengetahui Klasifikasi Enzim berdasarkan tipe dan mekanism reaksi.

2) Mengetahui bahwa Enzim memerlukan koenzim.

3) Mengetahui Enzim murni berfungsi sangat penting bagi pemahaman struktur,

fungsi, mekanisme reaksi, dan pengaturan enzim.

4) Mengetahui Enzim dapat ditemukan di dalam organel spesifik

2

BAB II

PEMBAHASAN

2.1 ENZIM DIKLASIFIKASIKAN BERDASARKAN TIPE DAN

MEKANISME REAKSI

Satu abad lalu, baru ada beberapa enzim yang dikenal dan kebanyakan di

antaranya mengatalisis reaksi hidrolisis ikatan kovalen. Semua enzim ini diidentifikasi

dengan penambahan akhiran –ase pada nama substansi atau substrat yang

dihidrolisisnya. Jadi, lipase menghidrolisis lemak (Yunani lipos), amilase

menghidrolisis pati (Yunani amylon), dan protease menghidrolisis protein. Meskipun

banyak sisa peristilahan ini masih tetap bertahan sampai sekarang, pemakaiannya sudah

terbukti tidak memadai ketika ditemukan berbagai enzim yang mengatalisis reaksi yang

berbeda terhadap substrat yang sama, misal, oksidasi atau reduksi terhadap fungsi

alcohol suatu gula. Sementara akhiran -ase tetap digunakan, nama enzim yang ada

sekarang ini lebih menekankan pada tipe reaksi yang dikatalisisnya. Sebagai contoh,

enzim dehidrogenase mengatalisis pengeluaran hidrogen, sementara enzim transferase

mengatalisis reaksi pemindahan gugus. Dengan semakin banyaknya enzim yang

ditemukan, ketidakjelasan juga semakin tak terelakkan, dan kerap kali tidak jelas enzim

mana yang tengah dibicarakan oleh seorang penyelidik. Untuk mngatasi permasalahan

ini, International Union of Biochemistry (IUB) telah mengadopsi sebuah sistem yang

kompleks tetapi tidak meragukan bagi peristilahan enzim yang didasarkan pada

mekanisme reaksi. Meskipun kejelasan dan pengurangan keraguan tersebut membuat

sistem nomenklatur IUB dipakai untuk ujian riset, nama yang lebih pendek tetapi

kurang begitu jelas tetap digunakan dalam buku ajar dan laboratorium klinik. Karena

alasan tersebut, sistem IUB hanya disampaikan secara sepintas.

1) Reksi dan enzim yang mengatalisis reaksi tersebut membentuk enem kelas,

masing-masing mempunyai 4-13 subkelas.

2) Nama enzim terdiri atas 2 bagian. Nama pertama menunjukkan substrat.

Nama kedua, yang berakhir dengan akhiran –ase, menyatakan tipe reaksi yang

dikatalisis.

3) Informasi tambahan, bila diperlukan untuk menjelaskan reaksi, dapat

dituliskan dalam tanda kurung pada bagian akhir; misal, enzim yang mengatalisis reaksi

3

L-malat + NAD+ → piruvat + CO2 + NADH + H + diberi nama 1.1.1.37 L-malat: NAD+

oksidoreduktase (dekarboksilasi).

4) Setiap enzim mempunyai nomor kode (EC) yang mencirikan tipe reaksi ke

dalam kelas (digit pertama), subkelas (digit kedua), dan subsubkelas (digit ketiga). Digit

keempat adalah untuk enzim spesifik. Jadi, EC 2.7.1.1 menyatakan kelas 2

(transferase), subkelas 7 (transfer fosfat), subsubkelas 1 (alcohol merupakan aseptor

fosfat). Digit terakhir menyatakan heksokinase atau ATP: D-heksosa 6-fosfotrasferase,

sebuah enzim yang mengatalisis pemindahan fosfat dari ATP ke gugus hidroksil pada

atom karbon keenam molekul glukosa.

2.2 ENZIM MEMERLUKAN KOENZIM

Banyak enzim yang megatalisis proses pemindahan gugus dan reaksi lain

memerlukan, di samping substratnya, sebuah molekul organik sekunder yang dikenal

sebagai koenzim karena tanpa koenzim, enzim tersebut tidak aktif. Koenzim akan

memperbesar kemampuan katalitik sebuah enzim sehingga menjadi jauh melebihi

kemampuan yang ditawarkan hanya oleh gugus fungsional asam aminonya, yang

menyusun massa enzim tersebut. Koenzim yang berikatan secara erat dengan enzim

lewat ikatan kovalen atau gaya nonkovalen kerap kali disebut sebagai gugus prostetik..

Koenzim yang mampu berdifusi secara bebas umumnya berfungsi sebagai unsur

pembawa (yang didaur ulang secara kontinu) hydrogen (FADH), hidrida (NADH dan

NADPH), atau unit-unit kimia seperti gugus asil (koenzim A) atau gugus metil (folat),

membawanya bolak-balik antara tempat pembentukannya dan pemakaiannya. Oleh

karena itu, koenzim yang disebut belakangan ini dapat dianggap sebagai substrat

sekunder.

Jenis-jenis enzim yang membutuhkan koenzim adalah enzim yang mengatalisis

reaksi oksidoreduksi, pemindahan gugus serta isomerisasi, dan reaksi yang membentuk

ikatan kovalen (kelas IUB 1,2,5, dan 6). Reaksi lisis, termasuk reaksi hidrolisis yang

dikatalisis oleh enzim-enzim pencernaan, tidak memerlukan koenzim.

2.2.1 Koenzim Dapat dianggap Sebagai Subtrat Sekunder

Untuk dua laasan penting, akan sering kali membantu untuk menganggap

koenzim sebagai substrat sekunder. Alasan pertama, perubahan kimia di dalam koenzim

terjadi tepat mengimbangi perubahan kimia yang berlangsung di dalam substrat.

4

Sebagai contoh, dalam reaksi oksideruduksi, jika satu molekul substrat dioksidasi, satu

molekul koenzim akan direduksi.

Aalsan kedua untuk memberi koenzim penghargaan yang sama adalah bahwa

aspek reaksi ini mungkin mempunyai makna fisiologik mendasar yang lebih besar.

Sebagai contoh, peran penting kmampuan otot yang bekerja secara anaerob untuk

mengubah piruvat menjadi laktat tidak terletak pada piruvat ataupun laktat. Reaksi

tersebut semata-mata bertujuan mengoksidasi koenzin NADH yang tereduksi menjadi

NAD+. Tanpa NAD+ glikolisis tidak dapat berlanjut dan sintesis ATP Anaerob (dan

dengan demikian, aktivitas kerjannya) akan terhenti. Di bawah keadaan anaerob,

reduksi piruvat menjadi laktat menghasilkan oksidasi ulang NADH dan memunkinkan

sintesis ATP. Reaksi lain dapat melakukan funsi ini sama baiknya. Sebagai contoh pada

bakteri atau ragi yang tumbuh secara anaerob, metabolit yang berasal dari piruvat

bertindak secara oksidan bagi NADH dan mereka sendiri berada dalam keadaan

tereduksi.

OH O

CH O C O

H3C C H3C C

I-Laktat Piruvat

NAD+ NADH + H+

Gambar : NAD+ bekerja sebagai kosubstrat dalam reaksi laktat hidrogenase.

5

Tabel . Mekanisme bagi regenerasi Anaerob NAD+

Oksidan Produk Tereduksi Bentuk KehidupanPiruvat

Asetaldehid

Dihidroksiasoton fosfat

Fruktosa

Laktat

Etanol

α-Gliserofosfat

Matinol

Otot, bakteri laktat, ragi

(yeast) Eschrichia coli

bakteri heterolaktat

2.2.2 Fungsi Koenzim sebagai Reagensia Pemindah Gugus

Tipe reaksi biokimia pemindahan gugus

D – G + A A – G + D

Yang memindahkan gugus molekul fungsional (G) dari molekul donor (D-G)

kepada sebuah molekul aseptor akhir (misal, reaksi dahidrogenasi) atau sebagai

pembawa gugus intermediet (misal, reksi transaminasi). Diagram berikut melukiskan

konsep yang disebut terakhir ini.

D – H KoE A – H

D KoE - H A

Meskipun diagram ini mengesankan pembentukan hanya satu kompleks KoE-G

tunggal saat berlangsungnya seluruh reaksi, sebenarnya ada berbagai kompleks

intermediet KoE-G yang dapat terlibat dalam suatu reaksi tertentu (misal, transaminasi).

Jika gugus yang dipindahkan merupakan hydrogen, adalah biasa untuk

menggambarkan hanya “separuh reaksi” di sebelah kiri:

D – H KoE

D KoE - H

6

Bahwa hal ini sebenarnya merepresentasikan hanya suatu kasus khusus dari

pemindahan gugus yang biasa dapat paling mudah dipahami dalam pengertian reksi

yang berlangsung di dalam sel utuh.

2.2.3 Koenzim Dapat Diklasifikasikan Menurut Gugus yang Pemindahannya

Dipermudah oleh Koenzim tersebut

Berdasarkan konsep di atas, kita dapat mengklasifikasikan koenzim sebagai

berikut:

Untuk pemindahan gugus bukan hydrogen:

Gula fosfat

KoA-SH

Tiamin pirofosfat

Piridoksal fosfat

Koenzim folat

Biotin

Koenzim kobamida (B12)

Asam lipoat

Untuk pemindahan hidrogen:

NAD+, NADP+

FMN, FAD

Asam lipoat

Koenzim Q

2.2.4 Banyak Koenzim Merupakan Derivat Vitamin B dan Derivat Adenosin

Monofosfat

Vitamin B membentuk bagian dalam struktur banyak koenzim. Vitamin B

nikotinamida, tiamin, riboflafin dan asam pantotenat merupakan unsur esensial

yang membentuk koenzim bagi oksidasi serta reduksi biologik, dan koenzim kobamida

serta asam folat berfungsi dalam metabolisme satu karbon. Banyak koenzim

mengandung adenin, ribose, serta fosfat, dan merupakan darivat adenosin monofosfat

(AMP). Contoh-contohnya mencakup NAD+ dan NADP+.

7

2.3 ENZIM MENGATALISIS REAKSI SPESIFIK ATAU REAKSI TIPE

Kesanggupan enzim mengatalisis satu reaksi spesifik dan pada hakikatnya tidak

mengatalisis reaksi yang lain mungkin merupakan sifat enzim yang paling signifikan.

Laju proses metabolisme karenanya dapat diatur oleh perubahan dalam efisiensi

katalitik enzim spesifik. Banyak enzim mengatalisis jenis reaksi yang sama

(pemindahan fosfat, reduksi-oksidasi, dl) dengan hanya sejumlah kecil substrat yang

secara structural berhubungan, kendati sering pada kecepatan reaksi yang secara

bermakna lebih rendah. Berbagai reaksi dengan substrat alternatif ini cenderung terjadi

kalau substrat terdapat dalam konsentrasi yang tinggi. Meskipun kadar sedemikian

jarang ditemukan di dalam sel hidup, kadar ini dapat diciptakan di laboratorium. Disini,

substrat alami dan sintetik alternatif digunakan untuk memfasilitasi pendeteksian enzim

dan penelitian mengenai mekanisme katalitiknya.

Gambar : Pelekatan tiga titik sebuah substrat ke tapak – aktif enzim yang berbentuk

planar

2.3.1 Enzim Memperlihatkan Spesifisitas Optis

Kecuali enzim epimerase (rasemase) yang mengatalisis interkonversi isomer

optis, umumnya semua enzim akan memperlihatkan spesifisitas optis absolut untuk

paling tidak suatu porsi molekul substrat. Dengan demikian, enzim dari lintasan

glikolisis dan oksidasi langsung akan mengatalisis interkonversi gulafosfat-D tetapi

tidak gulafosfat-L. Dengan beberapa pengecualian (misal, enzim D-asam amino

oksidase pada ginjal), kebanyakan enzim mamalia bekerja pada isomer-L asam amino.

Spesifisitas optis dapat meluas hingga satu porsi tertentu atau hingga keseluruhan

melekul substrat tersebut. Enzim glikosidase menggambarkan kedua ujung ekstrem.

Enzim ini mengatalisis hidrilisis ikatan glikosida antara gula dan alcohol, bersifat

8

sangat spesifik untuk bagian gula serta untuk ikatan (α atau β), tetapi relatif nonspesifik

untuk aglikon (porsi alcohol).

2.3.2 Enzim Bersifat Spesifik bagi Tipe Reaksi yang Dikatalisisnya

Enzim untuk proses lisis (enzim lisis) bekerja pada kelompok kimia khusus,

misal, enzim glikosidase pada glikosida, pepsin serta tripsin pada ikatan peptida, dan

esterase pada senyawa-senyawa ester. Berbagai substrat peptida yang berbeda dapat

diserang oleh hanya satu enzim sehingga mengurangi jumlah enzim pencernaan yang

seharusnya diperlukan. Enzim protease dapat pula mengatalisis proses hidrolisis

senyawa ester. Penggunaan ester sebagai substrat untuk sintesis telah mempermudah

penelitian terhadap mekanisme kerja enzim protease.

Enzim-enzim lisis tertentu memperlihatkan spesifisitas yang lebih tinggi. Enzim

kimotripsin menghidrolisis ikatan peptida; pada reaksi ini, gugus karboksil berasal dari

asam amino aromatik fenilalanin, tirosin, atau triptofan. Enzim karboksipeptidase dan

aminopeptidase melepas asam-asam amino satu persatu, masing-masing secara

berturutan, dari ujung terminal karboksil atau terminal amino rantai polipeptida.

Meskipun beberapa enzim oksidoreduktase memanfaatkan NAD+ dan NADP+

sebagai akseptor elektronnya, kebanyakan hanya menggunakan salah satu di antaranya.

Secara umum, enzim oksidoreduktase yang berfungsi dalam proses biosintesis sistem-

sistem mamalia (misal, sintesis asam lemak atau sterol) menggunakan NADPH sebagai

reduktan sementara enzim yang berfungsi dalam proses penguraian (misal, glikolisis,

oksidasi asam lemak) menggunakan NAD+ sebagai oksidan.

2.4 AKTIVITAS KATALITIS YANG DIMILIKI ENZIM MEMFASILITASI

PENDETEKSIAN ENZIM TERSEBUT

Jumlah enzim yang kecil di dalam sel mempersulit pengukuran kadarnya di

dalam ekstrak jaringan atau cairan. Untungnya, aktivitas katalitis yang dimiliki enzim

dapat menjadi sarana pemeriksaan yang sensitive dan spesifik bagi pengukuran kadar

enzim itu sendiri. Kemampuan mengatalitis transformasi ribuan, puluhan ribu, atau

bahkan lebih molekul substat menjadi produk dalam periode waktu yang singkat

memberikan kepada setiap molekul enzim kemampuan untuk secara kimiawi

menguatkan keberadaannya.

9

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

200 250 300 350 400

Panjang gelombang (nm)

De

ns

itas

Op

tik

Untuk mengukur kadar enzim di dalam sebuah sampel ekstrak jaringan atau

cairan biologik lain, kecepatan reaksi yang dikatalitis oleh enzim dalam sampel tersebut

harus ditentukan. Dalam kondisi yang tepat, hasil pengukuran kecepatan reaksi harus

sebanding dengan jumlah enzim yang ada. Karena jumlah molekul atau massa enzim

yang ada sukar ditentukan, hasil pengukuran tersebut dinyatakan dalam unit enzim..

Jumlah relatif enzim dalam berbagai ekstrak kemudian dapat dibandingkan.

International Union of Biocemistry mengartikan satu unit aktivitas enzim sebagai 1

mikromol (1 µmol; 10-6) substrat yang bereaksi atau produk yang ditransformasikan per

menit.

2.4.1 Kadar Dehidrogenase Tergantung-NAD+ Diukur pada 340 nm

Dalam reaksi yang melibatkan NAD+ atau NADP+ (enzim-enzim dehidrogenase),

sifat NADH atau NADPH (tetapi bukan NAD+ atau NADP+ ) yang menyerap cahaya

dengan panjang gelombang 340 nm (Gambar 8-4) membawa manfaat. Oksidasi NADH

menjadi NAD+ terjadi disertai dengan penurunan densitas optik (OD, optical density)

pada 340 nm, yang proporsional dengan jumlah NADH yang dioksidasi. Demikian

pula, kalau NAD+ direduksi, OD pada 340 nm akan meningkat sebanding dengan

jumlah NADH yang terbentuk. Perubaahan OD pada 340 nm ini dapat dimanfaatkan

bagi pemeriksaan analisis kuantitatif setiap enzim dehidrogenase yang bergantung

NAD+ atau NADP+ sebagai berikut. Bagi enzim dehidrogenase yang mengatalitis

oksidasi NADH oleh substratnya yang teroksidasi, kecepatan penurunan OD pada 340

nm akan berbanding lurus dengan konsentrasi enzim. Oleh karena itu, hasil pengukuran

kecepatan oenurunan OD pada 340 nm memungkinkan kita menyimpulkan kuantitas

enzim, yang dinyatakan dengan unit aktivvitas, yang terdapat di dalam sampel biologik

tertentu seperti serum atau ekstrak jaringan

.

10

NADH

NAD+

Gambar : Spektrum Absopsi NAD+ dan NADH. Densitas yang tampak di sini adalah

untuk 44 Mg/L, larutan di dalam sebuah sel dengan lintasan cahaya 1 cm NADP+

mempunyai spectrum yangmasing-masing analog dengan spectrum NAD+ dan NADH.

2.4.2 Kadar Banyak Enzim Dapat Diukur dengan Merangkaikannya pada Enzim

Dehidrogenase

Pada contoh diatas, laju pembentukan produk (NADH) diukur untuk menentukan

aktivitas enzim. Enzim selain dehidrogenase diukur kadarnya lewat pengukuran

kecepatan kemunculan produk (atau, yang lebih jarang dilakukan, lewat pengukuran

kecepatan hilangnya substrat). Sifat-sifat fisiokimiawi produk atau substrat akan

menentukan metode spesifik yang dipilih untuk mengukur kadar enzim. Cara yang

sering dan mudah dilakukan adalah “merangkaikan” (coupling) produk reaksi dengan

sebuah enzim dehidrogenase, dengan produk srbagai substrat.

11

2.5 ENZIM MURNI BERFUNGSI SANGAT PENTING BAGI PEMAHAMAN

STRUKTUR, FUNGSI, MEKANISME REAKSI, DAN PENGATURAN

ENZIM.

Tujuan yang ingin dicapai dalam pemurnian enzim adalah mengisolasi enzim

spesifikasi dan ekstra sel “Mentah” (crude) yang mengandung banyak komponen lain.

Molekul-molekul kecil dapat disingkirkan lewat dialysis atau filtrasi gel, asam nukleat

melalui pngendapan dengan antibiotik streptomisin, dan seterusnya. Permaslahannya

adalah memisahkan enzim yang kita kehendaki dari ratusan protein yang mempunyai

stuktur kimia dan fisika yang seupa.

Perjalanan suatu pemurnian tipikal dan enzim hati dengan pemulihan yang baik

serta pemurnian keseluruhan yang besarnya mencapai 490 kali lipat.

Glukosa

ATP, Mg 2+

ADP, Mg2+

Glukosa-6-Fosfat

NADP+

+ H+

6-Fosfoglukonolakton

Enzim Diperoleh dari Sumber-Sumber Alami atau dari Sel Tempat Enzim

Tersebut Siekspresikan oleh Gen yang diKlon.

Dulu, riset awal terhadap enzim terbatas pada protein yang dapat dimurnikan dari

sel-sel binatang, tanaman, atau bakteri tempat enzim tersebut terdapat secara alami.

Sekarang, teknologi DNA rekombinan telah memungkinkan ilmuwan memprouksi

protein di dalam sel tempat protein tersebut normalnya tidak ditemukan. Sel-sel hospes

tipikal adalah bakteri dan ragi yang secara kuantitas mudah tumbuh. Kemmapuan

mengekspresikan protein rekombinan pada tingkat yang relatif tinggi menjadikan para

ilmuwan mempu mengisolasi enzim yang sulit dimurnikan karena konsentrasi

rendahnya di dalam sel tempat mereka ditemukan secara alami. Lebih lanjut, melalui

perubahan DNA yang mengkodekan protein melalui mutagenesis berorientasi –tapak

12

NADP

GLUKOSA-6-FOSFAT DEHIDROGENAE

HEKSOKINASE

(site-directed mutagenesis), para Ilmuwan dapat menambah, menghilangkan, atau

mengubah asam-asam amino spesifik dalam enzim rekombinan untuk untuk

memfasilitasi penentuan peran fungsional dan strukturalnya. Perubahan dapat pula

dilakukan untuk membuat protein lebih mudah dimurnikan. Bagaimanapun, pmurnian

enzim dan sumbernya yang alami tetap merupakan hal yang penting, khususnya guna

mengidentifikasi sifat serta peran modifikasi posstranslasi yang yang berfungsi

mengatur lokasi enzim serta efisiensi katalik.

Pemurnian Dilakukan menggunakan Kromatografi pada pertukaran Ion atau

pada Penyangga Penyisih Ukuran.

Porosdur pemurnian klasik yang bermanfaat adalah pengendapan dengan berbagai

konsentrasi garam (umumnya garam ammonium atau natrium sulfat) atau pelarut

(aseton atau etanol), pemanasan diferensial atau denaturasi PH Diferensil, sentifugasi

diferensial, filtrasi gel, dan elektroferosis. Adsopsi selektif dan elusi protein dari zat

penukar anio selulosa, yaitu deitilaminoetil (DEAE) selulosa dan zat penukar anion

selulosa, yaitu karboksimetil selulosa (CMC, carbokxymethylcellulose) juga telah

memberikan hasil yang sangat baik bagi pemurnian protein secara cepat dalam jumlah

besar.

Sebagi contoh,PH ekstrak ekuesosa jaringan hati diatur hingga 7, 5 yang pada PH ini,

sebagian besar protein akan memiliki muatan netto negatif. Campuran protein dapat

larut ini kemudian dialirkn lewat kolom selulosa DEAE pada PH 7.5 bemuatan negatif

akan terikat ke DEAE lewat interkasi muatan yang berlawanan, sementara protein yang

tidak bermuatan atau yang mempunyai muatan positif mengalir langsung lewat kolom

tersebut. Kemudian, kolom selulosa DEAE ini dielusikan menggunakan gradien NaCl,

yang memiliki kisaran dari konsntrasi rendah hingga tinggi, dan dilarutkan dalam

pendapan denganPH 7,5. karena Cl- bersaing dengan protein untuk berikatan ke

penyangga yang bermuatan positif, protein untuk elusikan secara selektif; protein yang

memiliki ikatan paling lemah diikat paling awal, dan protein yang memiliki ikatan

paling kuat diikat palinh akhir. Pemisahan protein analog dolakukan mengyunakn

penyangga bermuatan negatif seperti karboksimetilselulosa atau fosfoselulosa pada PH

yang sedikit lebih rendah untuk memastikan bahwa protein bermuatan lebih positif.

Pemisahan protein dapat pula dilakukan pada baha berpori yang dikenal sebagai

“ayakan molecular”.. Kalau campuran protein dialirkan lewat kolom yang mengandung

ayakan molecular, protein yang berukuran kecil akan tersebar baik di dalam ruang antar

13

partikel maupun di dalam ruang internal atau pori-pori penyangga. Ketika campuran

protein dengan ukuran yang berbeda-beda mengalir lewat kolom, mobilitas protein

yang berukuran kecil akan terhambat, relatif terhadap protein yang ukurannya terlalu

besar untuk masuk ke dalam pori- poi ini. Dengan demikian,protein berukuran besar

akan muncul dari dalam kolom sebelum protein yang berukuran kecil.

Tabel : Rangkuman skema pemurnian enzim tipikal

Fraksi Enzim Aktivitas

Total (mU)1

Protein

Total (mg)

Aktivitas

Spesifik

(mU/mg)

Pemulihan

Keseluruhan

Homogenat hati mentah

Cairan supernatan, pemusingan 100.000 x g

Endapan [NH4]2SO4 40 – 50 %

Endapan aseton 20 – 35 %

Fraksi kolom DEAE 80 – 110

Endapan [NH4]2SO4 43 – 48 %

Kristal pertama

Rekritalisasi

100.000

98.000

90.000

60.000

58.000

52.000

50.000

49.000

10.000

8.000

1.500

250

29

20

12

10

10

12, 2

60

240

2.000

2.600

4.160

4.900

(100)

98

90

60

58

52

50

49

Penyangga Kromatografi Afinitas Mampu Mengenali Regio Enzim Spesifik

Ciri yang menonjol pada kromatografi afinitas adalah kemampuannya untuk

secara selektif mengeluarkan satu protein tertentu, atau yang paling sering, sejumlah

kecil protein tertentu, dari campuran protein yang kompleks. Teknik ini menggunakan

suatu ligand tak bergerak yang mengadakan interaksi spesifik dengan enzim yang ingin

dimurnikan. Kalau campuran protein tersebut dipanjankan pada ligand tersebut. Protein

yang tidak di kehendaki akan mengalir lewat kolom dan dibuang. Protein yang di

kehendaki kemudian akan dielusikan dari ligan yang tak bergerak memakai cairan elusi

yang umumnya berupa larutan garam atau ligand berbentuk larut dengan konsentrasi

tinggi. Permunian yang dicapai melalui teknik kromatografi afinitas ini sangat

mengesankan dan sering melebihi hasil yang mungkin di peroleh dengan pemakaian

sejumlah teknik klasik secara berturutan

Ligand yang di suka adalah substrat serta derivat koenzim atau zat perwarna

organic yang bertindak sebagai nukleotida atau analog koenzim yang berikatan secara

kovalen dengan sebuah penyangga inert (misal, NAD-Spandex, Blue Sepharose).

Ligand ini secara khas berikatan dengan penyangga lewat molekul penghubung.Yang

mempunyai panjang tiga hingga delapan atom karbon.

14

Pada kromatografi yang bersifat hidrofobik, hidrokarbon, alkil atau aril akan

terikat ke penyangga seperti sephadex. Retensi protein pada penyangga ini melibatkan

interaksi hidrofobik antara rantai alkil dan regio hidrofobik pada protein tersebut.

Protein kemudian di masukan ke dalam larutan yang menggandung garam dengan

konsentrasi tinggi (misal, [NH4]2SO4) dan dielusikan dengan garam yang sama yang

memiliki gradien menurun.

Teknologi DNA Rekombinan Dapat Menjadi Sumber Enzim Yang Kaya

Banyak gen yang mengkodekan enzim telah diklon, ditentukan rangkaiannya, dan

disisipkan ke dalam vector yang berasal dari plasmid atau faga tempat gen tersebut

dapat di kontrol oleh suatu promoter yang kuat. Promoter tersebut dapat “mendorong”

produksi enzim rekombinan hingga mencapai taraf yang jauh lebih tinggi dibandingkan

dengan yang terdapat pada sumber – sumber alam. Dengan menggunakan promoter

yang diatur oleh zat penginduksi (inducer) kimia spesifik, ekspresi enzim rekombinan

dapat diatur secara cermat. Umumnya vector ekspresi semacam ini disisipkan ke dalam

mikroorganisme yang mudah tumbuh seperti Escherichia coli atau ragi untuk

memproduksi enzim rekombinan.

Protein Fusi Rekombinan Dimurnikan dengan kromatograsi afinitas

Disamping menghasilkan sumber yang kaya akan enzim, yang sangat memfasilitasi

pemurnian, teknologi DNA rekombinan dapat digunakan untuk menciptakan protein

termodifikasi yang dapat dimurnikan dengan kromatografi afinitas. Cara yang umum

dilakukan adalah dengan mengikatkan kepada gen, sejumlah rangkaian nukleutida yang

k\mengkodekan ekstensi protein sehingga terbentuk protein fusi yang merupakan ligand

yang baik bagi penyangga afinitas spesifik. Salah satu pendekatan yang popular adalah

denngan mengikatkan rantai yang terdiri atas lima atau enam asam amino histidin atau

sebagai alternatif lain, domain pengikat substrat untuk enzim glutation S-trasferase

kepada gugus terminal amino atau karboksil enzim yang bersangkutan. Protein fusi

rekombinan trsebut kemudian dapat dimurnikan pada kolom afinitas yang berisi ion

logam bivalen terikat seperti Ni2+ (untuk fusi dengan polihistidin) atau glutation terikat

(untuk protein fusi glutation S-trasferase) (Gambar 8-6).Protein fusi sering mengandung

tapak (site) pembelahan untuk protease yang sangat spesifik seperti trombin, pada regio

yang menghubungkan kedua bagian dari protein fusi tersebut. Hal ini memungkinkan

pengeluaran domain fusi tambahan tersebut setelah pemurnian afinitas.

15

EnzimGST

GST yang mengkodekan plasmid DNA Hasil klon

Dengan tapak trombin yang mengkodekan enzim

Ligasikan menjadi satu

Lakukan tranfeksi sel, tambahkan zatPenginduksi, kemudian lakukan pemecahan zat

Alirkan kedalam kolom afinitas glutation

(GSH)

lakukan alusi dengan GSH proses dengan

trombin

Gambar : Penggunaan protein –fusi glutation S-tranferae (GST) untuk pemurnian

enzim rekombinan

16

GST T Enzim

GSTEnzi

mGST

EnzimGSTGST

Elektroforesis Gel Poliakrilamida Dapat Mendeteksi Kontaminan

Penilaian homogeneitas protein paling baik dilakukan dengan elektroforesis gel

poliakrilamida (PAGE, polyacrylida gel electrophoresis) di bawah berbagai kondisi.

Yang paling popular di antaranya adalah elektroforesis gel poliakrilamida atau PAGE

dengan sodium dodesil sulfat (SDS), suatu detergen ion yang memisahkan protein

multimerik menjadi protomer. Karena setiap ikatan peptida mengikat kurang lebih dua

buah molekul SDS, polipeptida tersebut memiliki muatan negatif yang kuat. Dengan

demikian, jarak yang ditempuh setiap polipeptida ketika bermigrasi kearah anoda

bergantung pada massa molecular relatifnya (Mr). Sebagai alternatif lain, PAGE dapat

dilaksanakan dalam kondisi asli yaitu, tanpa adanya SDS atau denaturan lain sehingga

struktur kuaterner dan kerap kali pula aktivitas katalitik enzimnya dapat dipertahankan.

Dalam PAGE dua dimensi (O’Farrell), dimensi pertama memisahkan protein yang

terdenaturasi berdasarkan nilai pl-nya dengan melakukan ekuilibrasi protein tersebut di

dalam medan listrik yang mengandung urea dan dengan gradien pH yang dipertahankan

oleh amfolit terpolimerisasi. Setelah pemrosesan dengan SDS selesai, dimensi kedua

kemudian memisahkan protein berdasarkan ukuran molecular unit protomernya.

2.6 ENZIM DAPAT DITEMUKAN DI DALAM ORGANEL SPESIFIK

Susunan spasial dan kompartementalisasi enzim, substrat, serta kofaktor di dalam

sel mempunyai makna yang teramat penting. Sebagai contoh, di dalam sel-sel hati,

enzim untuk glikolisis terdapat di dalam sitoplasma sedangkan enzim untuk siklus asam

sitrat di dalam mitokondria. Distribusi enzim diantara berbagai organel subselular dapat

dipelajari setelah dilakukan fraksionasi homogenat sel melalui sentrifugasi

berkecepatan tinggi. Kandungan enzim pada setiap fraksi kemudian diperiksa.

Penentuan lokasi suatu enzim tertentu didalam sebuah sel atau jaringan pada

keadaan yang relatif tetap acapkali dilakukan dengan prosedur histokimiawi

(“histoenzimologi”). Sayatan tipis jaringan yang dibekukan (frozen section) dengan

ketebalan 2 hingga 10µm diproses dengan substrat untuk suatu suatu enzim tertentu. Di

mana terdapat enzim, di situ akan terbentuk produk dari reaksi yang dikatalisis enzim

tersebut. Jika terwarna dan tidak larut, produk akan tetap berada di tempat

pembentukannya dan mengungkap lokasi enzim. Histoenzimologi menghasilkan

gambar grafik dan pola yang relatif bersifat fisiologik mengenai distribusi enzim.

17

2.7 ISOZIM MERUPAKAN BENTUK YANG MEMPUNYAI PERBEDAAN

FISIK TETAPI DENGAN AKTIVITAS KATALISIS YANG SAMA

Kalau teknik pemurnian enzim diaplikasikan, sebagai contoh kepada enzim malat

dehidrogenase yang berasal dari sumber yang berbeda (misal, hati tikus dan escherichia

coli), kita akan melihat dengan jelas bahwa sekalipun enzim malat dehidrogenae yang

berasal dari hati tikus maupun E coli akan mengatalisis reaksi yang sama, sifat-sifat

fisik dan kimiamereka memperlihatkan banyak perbedaan bemakna. Bnetuk – bentuk

fisik berbeda dari aktivitas yang ama juga dapat ditemukan dalam berbagai jaringan

organisme yang sama, dalam tipe-tipe sel yang berbeda, dalam kompartemen

sunselular, atau dalam organisme prokaryotik seperti E coli. Temuan ini diperoleh

sebagai hasil penerapan prosedur pemisahan elektroforentik pada pemisahan bentuk-

bentuk aktivitas enzimatik tertentu yang berbeda secara elektroforetis.

Pemisahan dan Identifikasi Isoenzim memiliki Nilai Diagnostik

Isozim laktat dehidrogenase dalam serum dapat dilihat dengan melakukan

elektroforesis terhadap sampel serum pada bahan penyangga pati, agar atau gel

poliakrilamoda, yang biasanya dilakukan dengan PH 8,6. isozim tersebut mempunyai

muatan yang belainan pada pH 8,6 ini dan bermigrasi menuju lima daerah yang

berlainan pada elektoferogram. Isozim tersebut dideteksi berdasarkan kemampuan

masing –masing isozim. Mengatalisis proses reaksi suatu zat pewarna yang tidak

berwarna menjadi bentuk yang berwarna dan tidak larut.

Campuran Assay dehidrogenase tipikal mengandung NAD+ suatu substrat

terteduksi , bentuk teroksidasi zat pewarna redoks seperti nitroblue tetrazolium (NBT),

pembawa (carrier) electron intermediet yang diperlukan bagi pemindahan elektron dari

NADH ke NBT, serta pendapat serta ion pengaktif jika dibutuhkan..

(Laktat) SH2 S (piruvat)

18

LAKTAT DEHIDROGENASE

NAD+ NADH + H+

PMS Tereduksi PMS Teroksidasi

NBT Teroksidasi NBT tereduksi

(Tidak berwarna) (Formazan Biu)

Gambar : reaksi yang dirangkaiakn untuk mendeteksi aktivitas laktat dehidrogenase

pada sebuan elektroferogram. (NBT, netroblue tetrazolium, PMS, phenazine

methosulfate).

Isozim merupakan produk dari gen yang berkerabat erat.

Enzim oligomerik dengan protomer yang tidak sama bisa terdapat. Yang sering,

satu jaringan mengahsilkan terutama satu jenis protomer, sementara jaringan lain

menghasilkan protomer lain. Bila protomer-protomer ini dapat brgabung melalui

berbagai cara untuk membangun sebuah enzim yang aktif (misal, tetramer),

terbentuklah isozim dengan aktifitas enzimatik tersebut.

Isozim laktat dehidrogenase memiliki perbedaan pada tingkat stuktur kuanternernya.

Molekul oligomerik laktat dehidrogenase stuktur kuanternernya. Molekul oligomerik

laktat dehidrogenase (berat molekul 130.000) terdiri atas empat protomer dengan dua

tipe, yaitu tipe H dan M (berat molekul sekitar 34.000). hanya molekul tetramiklah yang

mempunyai aktivitas katalitik. Jika urutan tidak penting, protomer ini dapt

dikambinasikan melaLui cara berikut :

HHHH

HHHM

HHMM

HMMM

MMMM

Markert telah menggunakan sejumlah kondisi yang diketahui dapat membongkar

dan membentuk kembali struktur kuanterner untuk menerangkan hubungan antar isozim

19

laktat dehidrogenase. Pemecahan dan pembentukan kembali laktat dehidrogenase –I1

atatu laktat dehidrogenase –I5 homogen tidak emnghasilkan isozim yang baru.

2.8 ANALISIS KUANTITATIF ENZIM PLASMA TERTENTU MEMPUNYAI

MAKNA DIAGNOSTIK.

Enzim plasma nonfungsional tidak melakukan sembanrang fungsi fisiologik ynag

diketahui di dalam darah. Substrat sering tidak ditemukan di dalam plasma, dan enzim

sendiri terdapat di dalam darah manusia normal dengan kadar sampai sejuta kali lipat

lebih rendah daripada kadar di jaringan. Keberadaan enzim di dalam plasma dengan

kadar yang meningkat diatas nilai normalnya menunjukkan peningkatan laju kerusakan

jaringan.

2.9 ENZIM ENDONUKLEASE RESTRIKSI MEMFASILITASI PENEGAKAN

DIAGNOSIS PENYAKIT GENTIK

Penegakan diagnosis penyakit genetic telah memperoleh dorongan yang luar biasa

dari perkembangan teknologi DNA rekombinan. Meskipun semua penyakit molecular

telah lama diketahui terjadi sbagai akibat perubahan DNA, teknik untuk pemeriksan

langsung terhadap rangkaian DNA, teknik untuk pemeriksaan langsung terhadap

rangkaian DNA baru belakangan ini tersedia. Pengembangan pelacakan hibridasi untuk

fragmen DNA telah menghasilkan sejumlah teknik penapisan prenatal dengan

sensitivitas yang memedai guna menentukan ada tidaknya kalainan herediter, teknik ini

dilakukan dengan memetakan enzim retriksi DNA yang berasal dari sel-sel janin dalam

cairan amnion atau dengan memeriksa produk yang dihasilkan menggunakan

oligonukleotida sebagai senyawa primer untuk reaksi rantai polimerase, (PCR,

polymerase chain reaction). Pada prinsipnya berbagai pelacak terhadap DNA dapat

dilakukan untuk menengakan diagnosis sebagaian besar penyakit genetik. Sebuah

pelacak terhadap DNA yang dibuat terhadap suatu bagian gen untuk sub unit

hemoglobin normal dapat mendeteksi fragmen restrisik yang emmendek atau tidak ada

akibat delesi di dalam gen tersebut, sebagaiman terjadi pada sebagian penyakit

talasemia-α, dan pada tipe-tipe talasemia -β serta -β, ∆ yang langka.

HASIL DIGESTI RESTRIKSI YANG SUDAH TERLACAK DAPAT

MENGUNGKAPKAN GEN HOMOLOG DENGAN RANGKAIAN BASA

BERBEDA.

Pelacak DNA dapat pula digunakan mendeteksi rangkaian DNA yang

behubungan erat dengan gen. Pemeriksaan analisis ini dapat dikembangkan untuk

20

mendeteksi berbagai variasi kromosom spesifik (perbedaan dalam rangkaian antar

kromosom homolog). Digesti DNA oleh enzim retriksi endonuklease akan

menghasilkan peta restriksi berbeda-beda (pola fragmen DNA) dari gen-gen

homologyang mengandung rangkaian basa yang berlainan . fenomena ini diberi nam

“polimorfisme panjang fragmen restriksi”. Bagi penyakit genetic yang berhubungan

dengan RFLP,seorang manusia yang menjadi pembawa penyakit tersebut akan

membawa satu kromosom dengan gen normal dan satu kromosom lagi dengan gen

cacat.

RNA KATALITIK

Meskipun jelas bukan merupakan protein, asam ribonukleat (RNA) tertentu

akan memperlihatkan aktivitas katalitik yang sangat spesifik bagi substrat tertentu.

RNA ini yang memenuhi semua kriteria klasik untuk didefinisi sebagai enzim, disebut

ribozim. Meskipun substrat yang dikatalisis oleh ribozim hanya terbatas pada ikatan

fosfodiester RNA, spesifitas kerjanya sepenuhnya sebanding kerja enzim yang klasik.

Ribozim mengatalisis reaksi trans esrterifikasi dan akhirnya reaksi hidrolisis ikatan

fosfodiester dalam molekul RNA. Reaksi ini diperlancar oleh gugus OH.

21

BAB III

PENUTUP

3.1 KESIMPULAN

1. Enzim merupakan katalisator yang mengatur kecepata berlangusngnaya berbagai

proses fisiologik

2. Cacat pada fungsi enzim sering menyebabkan penyakit

3. Enzim yang mengatalisis reaksi yang melibatkan pemindahan gugus isomerisasi,

oksido-reduksi, atau sintesis ikatan kovalen memerlukan substrat yang dikenal

dengan koenzim

4. Sebagian besar enzim bersifat sangat spesifik terhadap substratnya, koenzim serta

tipe reaksi yang dikatalisisnya. Meskipun demikian, beberapa enzim protease juga

memecah ester. Bagi enzim yang bekerja pada substrat dapat pula ikut bereaksi,

tetapi umumnya dengan kecepatan yang lebih rendah.

5. Pengukuran aktivitas enzim merupakan hal sentral bagi penentuan kuantitas

enzim dalam riset atau laboratorium klinik.

6. Aktivitas enzim dehidrogenase yang bergantung –NAD(P)+ diperiksa secara

spektrofotomentris dengan mengukur perubahan absorbsi pada 330 mm yang

menyertai oksidasi atau reduksi NAD (P)H.

7. Perangkaian enzim lain pada dehidrogenase dapat memperlancar analisisnya.

8. Untuk menyelidiki struktur mekanisme kerja, dan pengaturan aktivitasnya, enzim

harus dimurnikan hingga mencapai homogeneitas sekitar 95%.

9. teknik pemurnian enzim mencakup presipitasi selektif dengan pelarut garam atau

organic dan kromatografi pada penyangga pertukaran ion, filtrasi gel, afinitas

substrat, ligand zat warna, atau interaksi hidrofobik.

10. kemampuan memanfaatkan teknik rekombinan DNA untuk mengekspresikan

enzim dalam tubuh hospes yang dipilih telah membawa revolusi dalam teknik

pemurnian enzim dengan menghasilkan enzim dalan jumalh besar yang dalam

sebagian besar keadaan, mudah dimurnikan hingga mencapa homogeneitas.

11. Kemajuan pemurnian dinilai dengan mengukur peningkatan aktifitas spesifik

suatu enzim (aktivitas per unit masa) dan homogenitas akhir lewat elektroforesis

gel poliakrilamida (PAGE).

12. Penentuan lokasi enzim intrasel yang tepat disimpulkan lewat teknik histokimia

dan fraksionasi sel, yang dirangkaiakn dengan analisis enzimatik, terhadap

22

sayatan jaringan atau fraksi homogenat sel, isozim, bentuk yang secara fisik

berbeda pada enzim nonfungsional di dalam serum menunjukan kerusakan pada

jaringan tertentu manusia, dan memberikan informasi diagnostik seta prognostic

yang berharga.

13. Kemampuan enzim restriksi endonuklease mendeteksi perubahan yang sangat

kecil pada struktur gen telah memungkinkan dokter mendiagnosis penyakit

genetic akibat mutasi yang menghasilkan enzim yang cacat atau enzim

nonfungsional.

14. RNA katalitik yang dikenl sebagai ribozim mengatalisis reaksi hidrolisis yang

sangat spesifik ikatan fosfodiester pada RNA. Reaksi ini amat penting dalam

berbagai pristiwa pemrosesan yang terlibat di dalam maturasi pra-mRNA

3.2 SARAN

Peranan enzim dalam kesehatan sangat penting, untuk itu manusia hendaknya

lebih menjaga kesehatan. Dan kami penyusun mengharapkan masukan untuk

penyempurnaan makalah ini.

23

KEPUSTAKAAN

Murray, Robert K, 1996, Harper’s, Biochemistry

Mc. Gilvery, Robert W, And Gerald W, 1983

Page David, 1981.

Triman Jr, 2007 Materi Biokimia, Surabaya

24

25

26