KUANTITASI MIKROBIA

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

OLEH :

NAMA : EKI SOPHYA NOORHAYATI

NIM : H1E107005

KELOMPOK : 5

ASSISTEN : M. BASUKI YUS’A

PROGRAM STUDI TEKNIK LINGKUNGAN

FAKULTAS TEKNIK

UNIVERSITAS LAMBUNG MANGKURAT

BANJARBARU

OKTOBER, 2009

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Di dalam bidang ilmu mikrobiologi ada suatu hal mendasar yang juga

perlu diperhatikan yaitu analisia kualitatif terhadap suatu bahan. Suatu analisis

ini Sangat penting untuk mengetahui jumlah mikroorganisme yang ada pada

suatu sampel tertentu mengandung banyak mikroorganisme atau sebaliknya

(Ferdiaz, 1992).

Analisis kualitatif atau biasa disebut dengan enumerasi mikroorganisme

dalam hal ini dapat dilakukan baik dengan perhitungan langsung terhadap suatu

sampel yaitu salah satunya dengan alat bantu mikroskop, maupun dengan cara

tidak langsung yaitu dengan beberapa metode perhitungan (Gobel, 2008).

Pengukuran kuantitatif populasi mikroorganisme sangat diperlukan untuk

berbagai macam penelaahan mikrobiologis. Ada berbagai macam cara untuk

menghitung jumlah mikroorganisme, akan tetapi secara mendasar, ada dua cara

yaitu secara langsung dan secara tidak langsung (Anonim, 2009).

Cara perhitungan langsung, antara lain dengan cara pembuatan preparat dari

suatu bahan (preparat sederhana/tidak diwarnai), dan penggunaan ruang hitung

(counting chamber). Sedangkan cara perhitungan tidak langsung bertujuan

mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup (viabel

count). Terdapat 4 cara tidak langsung, yaitu : perhitungan pada cawan petri (total

plate count/TPC), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah

terkecil/terdekat (most probable number/MPN method), dan kalorimeter (cara

kekeruhan atau turbidimetri) (Hadioetomo, 1993).

Perhitungan secara tidak langsung bertujuan mengetahui jumlah

mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja, dalam pelaksanaanya

ada beberapa cara yaitu metode hitungan cawan, perhitungan melalui

pengenceran, perhitungan jumlah terkecil/terdekat dan kalorimeter (Frobisher,

1968).

Pada percobaan yang akan dilakukan, dapat di amati bahwa dalam suatu

bahan/ media itu apabila diberi perlakuan tertentu ternyata menunjukkan tanda-

tanda adanya mikroorganisme yang berkembang biak di sana. Seperti percobaan

yang akan dilakukan menggunakan sampel air daging segar dan air daging kornet

dengan pemberian perlakuan dengan metode tertentu (MPN dan TPC) yang akan

memunculkan banyak mikroba dan kemudian akan dilakukan kuantitasi atau

perhitungan jumlah mikrobia yang ada dengan menggunakan alat colony counter

maupun hitung manual yang hasilnya akan diketahui setelah didapatkan hasil dari

percobaan yang dilakukan ini.

1.2 Tujuan

Tujuan dari praktikum ini adalah untuk mengenalkan mahasiswa terhadap

metode-metode perhitungan populasi mikrobia.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Istilah pertumbuhan umumnya dipergunakan bakteri dan mikroorganisme

yang lainnya dan biasanya lebih mengacu pada perubahan di dalam hasil panen sel

dan bukanlah dilihat. Dari pertambahan jumlah individu mikroorganisme tersebut.

Suatu proses pertumbuhan menyatakan pertambahan jumlah atau massa yang

melebihi dari yang ada di dalam inokulum asalnya (Volk, 1985).

Sebelum kita dapat mengevaluasi atau menafsirkan respon pertumbuhan

bakteri dalam berbagai media atau pada kondisi yang berbeda- beda kita harus

menyatakan pertumbuhan secara kualitatif. Di dalam bidang ilmu mikrobiologi,

istilah pertumbuhan ini ditafsirkan dalam berbagai cara. Sebagai contoh mungkin

dalm suatu perangkat tertentu dari kondisi pembiakan di nilai sama sebaiknya

karena bakteri melakukan pertumbuhan yang relatif cepat pada stadium awal,

tetapi panen sel total akhirnya belum tentu sebanyak yang di dspat pada perangkat

yang lainnya (Pelczar, 1986).

Suatu bakteri dapat dihitung secara elektronik yaitu dengan cara

memasukkan biakan melalui lubang yang sangat kecil pada alat penghitung

partikel counter. Alat penghitung yang semacam ini dapat dipakai secara rutin

memecah sel darah, namun dapat pula disesuaikan untuk memecah bakteri (Volk,

1985).

Penetapan jumlah bakteri di dalam suatu populasi bakteri mungkin saja

akan mengalami hambatan. Hal ini karena tidak semua sel yang ada di dalam

suatu biakan itu mampu untuk hidup secara trus- menerus. Jadi dalam perhitungan

ini maka yang dianggap sebagai sel hidup adalah sel yang membentuk koloni di

dalam medium biakan atau dapat juga digunakan bakteri yang mampu membentuk

suspensi di dalam medium biakan. Sel- sel yang mampu hidup terus adalah yang

dihitung dengan berbagai metode untuk menetapkan jumlah selnya. Pada jumlah

total sel, maka ikut dihitung semua sel yang tampak atau yang dapat dihitung

dengan cara yang lainnya, sehingga dengan demikian sel-sel mati dan cacat akan

ikut terhitung (Pradhika, 2008).

Metode MPN terdiri dari tiga tahap, yaitu uji pendugaan (presumtive test),

uji konfirmasi (confirmed test), dan uji kelengkapan (completed test). Dalam uji

tahap pertama, keberadaan coliform masih dalam tingkat probabilitas rendah;

masih dalam dugaan. Uji ini mendeteksi sifat fermentatif coliform dalam sampel.

Karena beberapa jenis bakteri selain coliform juga memiliki sifat fermentatif,

diperlukan uji konfirmasi untuk mengetes kembali kebenaran adanya coliform

dengan bantuan medium selektif diferensial. Uji kelengkapan kembali

meyakinkan hasil tes uji konfirmasi dengan mendeteksi sifat fermentatif dan

pengamatan mikroskop terhadap ciri-ciri coliform: berbentuk batang, Gram

negatif, tidak-berspora (Fardiaz,1989).

Untuk menentukan jumlah bakteri yang ada di dalam suatu medium maka

dapat digunakan beberapa cara, yaitu:

Metode MPN

Metode MPN terdiri dari tiga tahap, yaitu uji pendugaan (presumtive test),

uji konfirmasi (confirmed test), dan uji kelengkapan (completed test). Dalam uji

tahap pertama, keberadaan coliform masih dalam tingkat probabilitas rendah;

masih dalam dugaan. Uji ini mendeteksi sifat fermentatif coliform dalam sampel.

Karena beberapa jenis bakteri selain coliform juga memiliki sifat fermentatif,

diperlukan uji konfirmasi untuk mengetes kembali kebenaran adanya coliform

dengan bantuan medium selektif diferensial. Uji kelengkapan kembali

meyakinkan hasil tes uji konfirmasi dengan mendeteksi sifat fermentatif dan

pengamatan mikroskop terhadap ciri-ciri coliform: berbentuk batang, Gram

negatif, tidak-berspora (Fardiaz,1989).

Untuk metode MPN (Most probable number) digunakan medium cair

dalam wadah berupa tabung reaksi, perhitungan di lakukan berdasarkan jumlah

tabung yang positif yaitu tabung yang mengalami perubahan pada mediumnya

baik itu berupa perubahan warna atau terbentuknya gelembung gas pada dasar

tabung durham. Pada metode perhitungan MPN ini digunakan bentuk tiga seri

pengenceran, yang pertama 10-1, 10-2, dan 10-3. Kemudian dari hasil perubahan

tersebut dicari nilai MPNnya pada tabel nilai MPN, dan untuk jumlah bakterinya

maka digunakan rumus (Gobel, 2008).

Output metode MPN adalah nilai MPN. Nilai MPN adalah perkiraan

jumlah unit tumbuh (growth unit) atau unit pembentuk-koloni (colony-forming

unit) dalam sampel. Namun, pada umumnya, nilai MPN juga diartikan sebagai

perkiraan jumlah individu bakteri. Satuan yang digunakan, umumnya per 100 mL

atau per gram. Jadi misalnya terdapat nilai MPN 10/g dalam sebuah sampel air,

artinya dalam sampel air tersebut diperkirakan setidaknya mengandung 10

coliform pada setiap gramnya. (FDA, 1989).

Sampel ditumbuhkan pada seri tabung sebanyak 3 atau 5 buah tabung

untuk setiap kelompok. Apabila dipakai 3 tabung maka disebut seri 3, dan jika

dipakai 5 tabung maka disebut 5 seri. Media pada tabung adalah Lactose Broth

yang diberi indikator perubahan pH dan ditambah tabung durham. Pemberian

sampel pada tiap seri tabung berbeda-beda. Untuk sampel sebanyak 10 ml

ditumbuhkan pada media LBDS (Lactose Broth Double Stegth) yang memiliki

komposisi Beef extract (3 gr), peptone (5 gr), lactose (10 gr) dan Bromthymol Blue

(0,2 %) per liternya. Untuk sampel 1 ml dan 0,1 ml dimasukkan pada media LBSS

(Lactose Broth Single Stegth) yang berkomposisi sama tapi hanya kadar laktosa

setengah dari LBDS yaitu 5 gr (Pradhika, 2008).

Berdasar sifat coliform, maka bakteri ini dapat memfermentasikan laktosa

menjadi asam dan gas yang dideteksi oleh berubahnya warna dan gas dalam

tabung durham. Nilai MPN ditentukan dengan kombinasi jumlah tabung positif

(asam dan gas) tiap serinya setelah diinkubasi (Pradhika, 2008).

Gambar metode MPN

Metode TPC (Hitungan Cawan)

Plate count / viable count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel

mikroorganisme hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah

ditumbuhkan dalam media pertumbuhan dan lingkungan yang sesuai. Setelah

diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau

dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi tersebut. Koloni yang tumbuh

tidak selalu berasal dari satu sel mikroorganisme karena beberapa mikroorganisme

tertentu cenderung membentuk kelompok atau berantai. Berdasarkan hal tersebut

digunakan istilah Coloni Forming Units (CFU’s) per ml. koloni yang tumbuh

berasal dari suspensi yang diperoleh menggunakan pengenceran bertingkat dari

sebuah sampel yang ingin diketahui jumlah bakterinya (Pradhika, 2008).

Syarat koloni yang ditentukan untuk dihitung adalah sebagai berikut

(Pradhika,2008)

Satu koloni dihitung 1 koloni.

Dua koloni yang bertumpuk dihitung 1 koloni.

Beberapa koloni yang berhubungan dihitung 1 koloni.

Dua koloni yang berhimpitan dan masih dapat dibedakan dihitung 2 koloni.

Koloni yang terlalu besar (lebih besar dari setengah luas cawan) tidak

dihitung.

Koloni yang besarnya kurang dari setengah luas cawan dihitung 1 koloni.

Dalam perhitungan jumlah mikroorganisme ini seringkali digunakan

pengenceran. Di dalam laboratorium, pengenceran di lakukan dengan botol

pengenceran seperti lazimnya pada SPC, namun dapat pula menggunakan tabung

reaksi. Pada pengenceran dengan menggunakan botol cairan terlebih dahulu

dikocok dengan baik sehingga kelompok sel dapat terpisah. Pengenceran sel dapat

membantu untuk memperoleh perhitungan jumlah mikroorganisme yang benar.

Namun pengenceran yang terlalu tinggi akan menghasilkan lempengan agar

dengan jumlah koloni yang umumnya relatif rendah (Firebiology07,2009).

Pada metode perhitungan cawan dilakukan pengenceran yang bertingkat

yang mana ditujukan untuk membentuk konsentrasi dari suatu suspensi bakteri.

Sampel yang telah di encerkan ini di hitung ke dalam cawan baru kemudian di

tuang ke mediumnya (metode tuang). Kemudian setelah diinkubasi selama 24- 48

jam, amati koloni yang tumbuh dan koloni yanng diamati hanyalah koloni yang

berjumlah 30- 300 koloni

Adapun prinsip dari metode hitung cawan ini adalah jika sel jasad renik

yang masih hidup ditumbuhkan pada suatu medium agar, maka sel jasad renik

tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat di lihat

langsung dan dihitung dengan mata tanpa menggunakan alat bantu seperti

mikroskop dan sebagainya. Metode hittung cawan ini merupakan cara yang paling

sensitif untuk menentukan jumlah jassad renik karena beberapa hal yaitu (Ferdiaz,

1992):

Hanya sel yang masih hidup yang dihitung

Beberapa jenis jasad renik dapat dihitung sekaligus

Dapat digunakan untuk mengisolasi dan identifikasi jasad renik karena

koloni yang terbentuk mungkin berasal dari suatu jassad renik yang

mempunyai penampakan yang spesifik.

BAB III

METODE PRAKTIKUM

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum ini dilaksanakan pada hari senin tanggal 12 Oktober 2009

bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas MIPA Unlam Banjarbaru.

3.2 Alat dan Bahan

Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah labu erlenmeyer, tabung

reaksi steril, cawan petri steril, pipet ependorf, pipet volumetrik, lampu spritus,

kertas label, kapas, inkubator, colony counter, tabung durham, vortex mixer.

Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah aquadest, daging sapi

segar, daging kaleng, medium lactose broth, alkohol 70%.

3.3 Cara Kerja

Hitungan Cawan (Standart Plate Count)

1. Dilakukan pengenceran terlebih dahulu daging sapi dengan aquadest

2. Dinyalakan lampu spritus dan disterilkan tangan dengan alkohol 70%

3. Diambil pipet ependorf dan dimasukkan 1 ml sampel air daging

dimasukkan kedalam tabung reaksi

4. Dihomogenkan tabung reksi 10-2 dengan vortex mixer

5. Dilakukan hal yang sama sampai pengenceran 10-4

6. Dimasukkan 1 ml sampel pengenceran 10-2 yang homogen, masukkan

dalam cawan petri. Lakukan 2 kali.

7. Dilakukan hal yang sama pada pengenceran 10-3 dan 10-4, tunggu beberapa

saat.

8. Disterilkan tangan dengan alkohol 70%

9. Dimasukkan media NA ke dalam cawan petri yang steril (berisi sampel 1

ml pengenceran 10-2), kemudian dihomogenkan membentuk angka

delapan.

10. Diulangi masing-masing dua kali sampai pengenceran 10-4 di tunggu

sampai 1 x 24 jam

11. Diamati hasilnya dan dihitung dengan colony counter per ml sampel, mulai

menghitung jumlah koloni yang tumbuh dari jumlah 25–250 atau 30–300,

mengalikan jumlahnya dengan pengenceran.

Jumlah Perkiraan Terdekat (Metode MPN)

Uji Penduga

1. Diinokulasikan 5 ml sampel ke dalam 5 tabung medium LB seri ganda

2. Diinokulasikan 5 ml sampel ke dalam 5 tabung medium LB seri

tunggal

3. Diinokulasikan 0,1 ml sampel ke dalam 5 tabung medium LB seri

tunggal

4. Diinkubasikan semua tabung pada suhu 35oc selama 24 jam. Bila ada

asam dan gas dinyatakan positif.

5. Dicatat hasilnya dan dihitung dengan tabel MPN

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

Tabel 1. TPC (1 x 24 jam)

No Jenis Sampel Jumlah Koloni

(TPC)

Gambar

1. Daging Segar

a. Pengenceran 10-2 a 41 x 102

b. Pengenceran 10-2 b 30 x 102

c. Pengenceran 10-3 a 1132 x 103 (TBUD)

d. Pengenceran 10-3 b 563 x 103 (TBUD)

e. Pengenceran 10-4 a 272 x 104 (TBUD)

f. Pengenceran 10-4 b 167 x 104 (TBUD)

2. Daging Kaleng

a. Pengenceran 10-2 a 684 x 102 (TBUD)

b. Pengenceran 10-2 b 570 x 102 (TBUD)

c. Pengenceran 10-3 a 65 x 103 (TBUD)

d. Pengenceran 10-3 b 72 x 103 (TBUD)

e. Pengenceran 10-4 a 4 x 104 (TBUD)

f. Pengenceran 10-4 b 17 x 104 (TBUD)

Tabel 2. MPN (1 x 24 jam)

NO.Jenis

Sampel

Medium Lactose Broth

Jumlah Tabung Positif

MPN Coliform

Gambar

1. Daging Segar

Double Strength (DS) 5 ml

5

> 2400Single Strength (SS) 1,0 ml 5

Single Strength (SS) 0,1 ml 5

2. Daging Kaleng

Double Strength (DS) 5 ml

5

920

Single Strength (SS) 1,0 ml 5

Single Strength (SS) 0,1 ml 3

4.2 Pembahasan

Praktikum yang telah dilakukan bertujuan untuk memperkenalkan dua

teknik perhitungan mikroba yaitu teknik perhitungan MPN dan cawan (Standart

Plate Count), dimana keduanya merupakan teknik perhitungan secara tidak

langsung yang hanya dapat menghitung mikroba hidup saja. Kedua metode ini

digunakan atas dasar kemudahan untuk melihatnya pertumbuhan mikroorganisme.

MPN (Most Probable Number) merupakan metode yang dilakukan dengan

cara melakukan 3 seri (tahap) pengujian yaitu uji penduga, uji penguat dan uji

pelengkap. Namun pada praktikum yang telah dilakukan hanya melakukan

percobaan pada tahap pertama yaitu uji penduga saja. Metode MPN digunakan

untuk menghitung jumlah mikroba jenis tertentu yang terdapat di antara mikroba-

mikroba lainnya. Kepada medium ini kemudian diinokulasikan sejumlah ml air

yang mengandung bakteri yang menghasilkan gas. Sebagai contoh penggunaan

Lactose Broth dan tabung Durham dapat digunakan untuk menghitung jumlah

bakteri yang dapat memfermentasi laktosa membentuk gas, misalnya bakteri

coliform. Jika timbul gas sebelum 48 jam berakhir test ini disebut positif.

Pengamatan dilakukan setelah 24 jam dan telah terbentuk gas sehingga bisa

dikatakan tabung tersebut positif.

Hasil untuk uji penduga didapatkan jumlah tabung yang positif (ada

gelembung) pada air rendaman daging segar adalah 5 5 5, dengan nilai MPN

coliform > 2400, untuk air rendaman daging kornet didapatkan jumlah tabung

yang positif 5 5 3 dengan nilai MPN coliform 920, dan dapat disimpulkan air

rendaman daging segar mempunyai nilai MPN paling tinggi, yang berarti pada air

rendaman daging segar terdapat aktifitas mikroba paling banyak dikarenakan

unsur proteinnya masih tinggi sehingga menjadi medium pertumbuhan yang baik

bagi mikrobia. Selain itu, dikarenakan daging kaleng bertujuan untuk disimpan

dalam jangka waktu yang lama sehingga sebelumnya sudah dilakukan pengawetan

terlebih dahulu (adanya proses sterilisasi) dimana proses ini telah meminimalisir

jumlah mikroba yang ada didaging kaleng tersebut.

Pada perhitungan dengan metode kedua yaitu TPC (Total Plate Count),

terlebih dahulu dilakukan serangkaian proses pengenceran yaitu pengenceran 10-1

sampai 10-4 akan tetapi inokulasi yang dilakukan hanya menggunakan

pengenceran 10-2 , 10-3, 10-4 perhitungan dengan menggunakan colony counter yang

dilakukan menunjukkan bahwa jumlah koloni mikrobia terbanyak ditemukan pada

cawan petri dengan pengenceran 10-3 pada pengambilan pertama untuk sampel

daging segar dan paling sedikit ditemukan pada pengenceran 10-2 pada

pengambilan kedua untuk sampel daging segar. Untuk sampel daging kaleng

ditemukan mikrobia paling banyak pada pengenceran 10-2 pengambilan pertama

dan paling sedikit pada pengenceran 10-4 pengambilan pertama. Dapat

disimpulkan air rendaman daging segar mempunyai nilai TPC (Total Plate Count)

paling tinggi, yang berarti pada air rendaman daging segar terdapat aktifitas

mikroba paling banyak dikarenakan kandungan proteinnya masih tinggi sehingga

menjadi medium pertumbuhan yang baik bagi mikrobia. Selain itu, karena dalam

pengemasan daging kaleng bertujuan untuk disimpan dalam jangka waktu lama

sehingga sebelumnya sudah dilakukan pengawetan terlebih dahulu (dimana disini

terjadi proses sterilisasi) dimana proses ini telah meminimalisir jumlah mikroba

yang ada di daging kaleng tersebut.

Dari kedua metode yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa

perhitungan mikrobia mendapatkan hasil perhitungan yang hampir sama.

Perhitungan yang paling mudah adalah dengan metode MPN namun dalam

prakteknya paling mudah dilakukan pada metode TPC.

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil praktikum yang telah dilakukan dapat diambil

kesimpulan sebagai berikut:

1.Teknik perhitungan MPN dan cawan (Standart Plate Count), dimana keduanya

merupakan teknik perhitungan secara tidak langsung yang hanya dapat

menghitung mikroba hidup saja.

2.Air rendaman daging segar lebih banyak mengandung mikrobia dibanding air

rendaman daging kaleng.

3.Jumlah koloni mikrobia terbanyak ditemukan pada cawan petri dengan

pengenceran 10-3 pada pengambilan pertama untuk sampel daging segar yaitu

>1132 (TBUD)

4.Perhitungan MPN lebih mudah dilakukan dibanding metode TPC.

5.2 Saran

Dalam melakukan percobaan MPN, sebaiknya dilakukan uji penguat dan

uji pelengkap juga sehingga praktikan lebih mengerti lagi secara keseluruhan tidak

setengah-setengah.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 2009. Penuntun Praktikum Laboratorium Lingkungan. F TEKNIK UNLAM, Banjarbaru.

Fardiaz, S.1989. Analisis Mikrobiologi Pangan. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan, IPB

Ferdias, S.1992. Mikrobiologi Pangan. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta

Firebiology07.2009. Enumerasi Secara Langsung dan Tidak Langsung.http://firebiology07.wordpress.com/2009/04/19/enumerasi-secara-langsung-dan-tidak-langsung/Diakses tanggal 15 Oktober 2009

Food and Drug Administration.1998. Bacteriological Analytical Manual. 8th Edition, FRIEDHEIM, E., AND MICHAELIS, L. 2001 J. Biol. Chem., 91,55-368. Cit. PORTER, J. R.

Frobisher. 1968. Fundamental of Microbiology. Toppan Company, Tokyo.

Gobel, Risco, B, dkk. 2008. Mikrobiologi Umum Dalam Praktek. Universitas Hasanuddin, Makassar.

Hadioetomo, R.S. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. PT. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.

Pelczar, Michael, J.1986. Dasar- Dasar Mikrobiologi. Universitas Indonesia, Jakarta.

Pradhika, E.I. 2008.MIKRO-BA NGET: Bab. 5 Morfologi Mikroba.http//ekmon-saurus/bab-5-Morfologi-mikroba/.htmldiakses tanggal 15 Oktober 2009

Pradhika, E.I. 2008.MIKRO-BA NGET: Bab.6. Menentukan Jumlah dan Ukuran Mikroba.http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/11/bab-6-menentukan-jumlah-ukuran-mikroba.htmldiakses tanggal 15 Oktober 2009.

Volk, dan Wheeler.1985. Dasar- Dasar Mikrobiologi. Erlangga, Jakarta.