CARA KERJA WESTERN BLOT ANALYSIS

1. Menyiapkan sampel yang akan diteliti, apakah itu limfosit T, fibroblas atau sel

darah tepi. Sampel harus dijaga tetap dingin.

2. Menyiapkan buffer supaya pH dapat berada pada jangkauan yang stabil

3. Menyiapkan antibodi yang akan digunakan sebagai pelacak

Monoklonal antibodi maupun poliklonal antibodi dapat digunakan

a. Antibodi monoklonal adalah yang lebih baik digunakan, karena :

- Sinyal yang lebih baik

- Spesifisitas yang lebih tinggi

- Hasil yang lebih jernih pada proses pembuatan film western blot

b. Antibodi Poliklonal

- Mengenali lebih banyak epitop

4. Melakukan Lisis pada Sel

Kita perlu melisis sel untuk mengeluarkan protein yang diinginkan dari sel.

Untuk melisis sel dapat digunakan detergen SDS dan RIPA. Bila yang

diinginkan adalah sebuah protein yang terfosforilasi, maka perlu

ditambahkan inhibitor fosfatase agar gugus fosfat pada protein tersebut tidak

dibuang.

Cara melisis : sentrifuge dan ambil pellet yang terbentuk. Jaga agar tetap

dingin dengan menggunakan kotak es. Tambahkan buffer lisis, lalu

kumpulkan dalam tabung eppendorf, jaga agar tetap dingin.

5. Gel Elektroforesis

Gel yang biasa dipakai misalnya SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-

polyacrylamide gel electrophoresis) untuk memisahkan protein berdasarkan

ukurannya dengan adanya arus listrik. Akrilamid 10% juga ditambahkan. Kerja

SDS-PAGE ini adalah dengan mendenaturasi polipeptida setelah terlebih

dahulu polipeptida tersebut dibuang struktur sekunder dan tersiernya.

Sampel terlebih dahulu dimasukkan ke dalam sumur gel. Satu jalur biasanya

untuk satumarker. Protein sampel akan memiliki muatan yang sama dengan

SDS yang negatif sehingga bergerak menuju elektroda positif melalui jaring-

jaring akrilamid. Protein yang lebih kecil akan bergerak lebih cepat melewati

jaring-jaring akrilamid. Perbedaan kecepatan pergerakan ini akan terlihat

pada pita-pita yang tergambar pada tiap jalur.

6. Transfer Gel

Agar protein tersebut dapat diakses oleh antibodi, maka protein tersebut

harus dipindahkan dari gel ke sebuah kertas membran, biasanya nitroselulosa

atau PVDF. Membran ini diletakkan di atas gel, dan tumpukan kertas

penyerap diletakkan di atasnya. Larutan buffer kemudian akan merambat ke

atas melalui reaksi kapiler dengan membawa protein-proteinnya.

Cara lain untuk mentransfer protein adalah dengan menggunakan teknik

elektroblotting. Teknik ini menggunakan arus listrik untuk menarik protein

dari gel ke membran.

Selain itu, diperlukan pula sebuah prosedur untuk mencegah terjadinya

interaksi antara molekul-molekul yang tidak diinginkan agar hasil yang

diperlukan lebih jernih (to reduce ‘noise’). Caranya adalah dengan

menempatkan membran pada BSA (Bovine serum albumin) atau non-fat dry

milk dengan sedikit detergen tween 20 sehingga serum tersebut akan

menempel pada pada daerah yang tidak ditempeli protein sampel. Hal ini

bertujuan untuk membuat antibodi hanya akan dapat menempel pada

binding site protein target. Setelah itu, barulah membran dengan protein

sampel tersebut diinkubasi dengan antibodi.

7. Deteksi

Deteksi dilakukan dengan antibodi yang telah dimodifikasi bersama dengan

sebuah enzim yang disebut reporter enzyme. Proses deteksi biasanya

berlangsung dalam dua tahap, yaitu :

a. Antibodi Primer

Antibodi yang digunakan di sini adalah antibodi yang pertama kali

dihasilkan sistem imun ketika terpajang protein target. Antibodi terlarut

kemudian diinkubasi bersama kertas membran paling sedikit selama 30

menit.

b. Antibodi Sekunder

Setelah diinkubasi bersama antibodi primer, kertas mebran dibilas

terlebih dahulu barulah diinkubasi dengan antibodi sekunder. Antibodi

sekunder adalah antibodi yang spesifik untuk suatu spesies pada antibodi

primer. Misalnya, anti-tikus hanya akan berikatan pada antibodi primer

yang berasal dari tikus. Antibodi sekunder biasanya berikatan dengan

enzim reporter seperti alkaline fosfatase atau horseradish peroxidase.

Antibodi sekunder ini kemudian akan menguatkan sinyal yang dihasilkan

oleh antibodi primer.

Sekarang, proses deteksi dapat dilakukan dengan satu langkah saja, yaitu

dengan menggunakan antibodi yang dapat mengenali protein yang

diinginkan sekaligus memiliki label yang mudah dideteksi

8. Analisis

a. Colorimetric detection

Metode ini digunakan bila substrat dapat bereaksi dengan reporter

enzyme sehingga dapat mewarnai membran nitorselulosa

b. Chemiluminescent

Metode ini digunakan bila substrat merupakan molekul yang bila bereaksi

dengan antibodi sekunder atu dengan reporter enzyme akan teriluminasi.

Hasilnya kemudian diukur dengan densitometri untuk mengetahui jumlah

protein yang terwarnai. Teknik terbarunya yang paking canggih disebut

Enhanced Cheiluminescent (ECL). Teknik inilah yang paling banyak

digunakan sekarang.

c. Radioactive detection

Metode ini menggunakan X-ray yang bila mengenai label akan

menciptakan region gelap. Namun metode ini sangat maha dan beresiko

tinggi terhadap kesehatan.

d. Fluorescent detection

Pelacak yang mmepunyai label yang dapat mengalami fluorosensi lalu

kemudian dideteksi oleh fotosensor seperti kamera CCD yang menangkap

image digital dari western blot. Hasil kemudian dapat dianalisi secara

kuantitaif maupun kualitatif

Metode ini juga merupakan salah satu metode yang paling sering

digunakan karena sangat sensitif.

PRINSIP KERJA WESTERN BLOT ANALYSIS

Prinsip kerja Western Blot yaitu pertama kali dilakukan analisis dengan SDS-PAGE

karena protein mempunyai berat molekul yang beragam, sehingga setelah

dilakukan SDSPAGE, protein dengan berat molekul yang berbeda akan terpisah

pada area gel. Kemudian dilanjutkan dengan mentransfer protein tersebut dari

Polyacrilamide Gel ke membrane nitroselulose dan selanjutnya dilabel dengan

antibodi. Hasil ikatan antara protein antigen dan antibodi tersebut kemudian

diwarnai dengan menggunakan pewarnaan yang diinginkan, seperti pewarnaan

dengan commasie blue (Rantam, 2003).

Gambar 1. Rincian langkah-langkah yang terlibat dalam memperoleh protein

untuk western blot.

Gambar 2. Gambar merinci langkah-langkah dalam melakukan western blot

See Diagram 1 below. First things first. Obtain a protein sample you want to

analyze, such as cell samples. Lyse the cells to release protein contents. Run

these on a gel which separates proteins on the basis of size. Then transfer these

gel proteins onto a membrane using electricity. This membrane can then be used

to probe for proteins of interest using a primary antibody.

What You Need to Western Blot:

A Protein Sample

A Good Antibody to Detect your Protein of Interest

Western blot relies on the primary antibody to detect this protein from the

thousands of proteins on your membrane and previously on your gel! (a cell can

contain 30,000 different proteins - and these same proteins can even be altered

giving you over 300,000 different proteins!). Using an antibody recognizes your

primary antibody (a secondary antibody) you build up a protein-antibody-

antibody sandwich! The secondary antibody has a horse radish peroxidase

enzyme which converts a luminol substrate to a light releasing substance! This

light is detected as a spot on film. From this spot you can determine how much

protein is there relative to other spots, or the size of the protein relative to a size

marker that is run also on the gel.

Diagram 2 shows a western blot example gel. Lane 1 is a protein size marker

ladder which shows different known sizes of proteins, this can be purchased

commercially and the sizes of all the spots are given in a pamphlet. Lane 3 is a

cancer sample and lane 5 is a normal sample. As you can see the protein in lane 3

has a higher expression than the cancer sample in lane 5, which is interesting.

Also, the protein spots in lanes 3 and 5 are the same size as the 2nd spot in the

size ladder from lane 1. We can then look at the known protein size from our

brochure which we received with the ladder. We then determine that the size of

the protein is 80 kDa. Our protein of interest is also 80 kDa. So we know that the

western blot worked and that the protein is highly expressed in a cancer sample!

To Detect your Protein:

Buy an Antibody Against Your Primary Antibody Source

Use an ECL - Chemiluminescence Kit and Film to Get the Results

DAFTAR PUSTAKA:

http://id.shvoong.com/medicine-and-health/medicine-history/2111504-

western-blot/#ixzz1fNk5xeOf

http://www.molecularstation.com/protein/western-blot/#top