1. Sebut dan jelaskan langkah kerja dalam Western Blotting

1. Preparasi sampel yang digunakan

Sampel diberikan perlakuan seperti didinginkan menggunakan TBS dan

disentrifus untuk mengambil bagian protein yang diinginkan kemudian

dicampur dengan buffer kemudian didihkan dan disentrifus.

2. Gel Elektroforesis

Gel yang biasa dipakai misalnya SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-

polyacrylamide gel electrophoresis) untuk memisahkan protein berdasarkan

ukurannya dengan adanya arus listrik.. Sampel terlebih dahulu dimasukkan

ke dalam sumur gel. Kemudian lakukan gel pada menit dan volta tertentu

dan voltage ditingkatkan hingga 100-150 V selama 1 jam. Pemisahan protein

menggunakan gel elektroporosis ini bergantung pada ukuran dari protein

yang ingin dianalisa.

3. Transfer Protein dari Gel menuju membran

Protein harus dipindahkan dari gel ke sebuah kertas membran, biasanya

nitroselulosa atau PVDF. Membran ini diletakkan di atas gel, dan tumpukan

kertas penyerap diletakkan di atasnya. Larutan buffer kemudian akan

merambat ke atas melalui reaksi kapiler dengan membawa protein-

proteinnya.

Cara lain untuk mentransfer protein adalah dengan menggunakan teknik

elektroblotting. Teknik ini menggunakan arus listrik untuk menarik protein

dari gel ke membran. Dapat dilakukan dengan cara :

1. Meletakkan gel ke transfer buffer selama 10-5 menit

2. Memassang tranfer sandwich agar tidak ada gelembung udara,

pastikan posisi blot di katoda dan gel pada anoda.

3. Letakkan kaset pada tangki transfer dan letakkan pemblok es pada

tangki

4. Lakukan transfer sepanjang malam pada tempat yang dingin dengan

tegangan konstan sebesar 10mA

Setelah itu, barulah membran dengan protein sampel tersebut diinkubasi

dengan antibody dan dibilas serta diwarnai menggunakan Ponceau solution

untuk memeriksa kualitas tranfer, kemudian dibilas kembali menggunakan

TBST sebanyak 3 kali. Kemudian lakukan blok melakukan BSA, dan inkubasi

sepanjang malam dengan antibodi primer pada suhu 4 derajat celcius.

4. Analisis

Pada analisis dapat digunakan metode di bawah ini

a. Colorimetric detection

b. Chemiluminescent

c. Radioactive detection

d. Fluorescent detection

Setelah pengambilan citra gambar kemudian dilakukan analisis dengan

software komputer.

2. Jelaskan istilah di bawah berikut

a. Antibodi monoklonal

Antibodi Monoklonal adalah antibodi sejenis yang diproduksi oleh sel

plasma klon sel-sel positif sejenis. Antibodi ini dibuat oleh sel-sel

hibridoma(hasil fusi 2 sel berbeda; penghasil sel positif Limpa

danselmieloma)yangdikultur.Bertindak sebagai antigen yang

akanmenghasilkan anti bodi adalah limpa. Fungsi antara lain diagnosis

penyakit dan kehamilan.Antibodi monoklonal adalah zatyang diproduksi

oleh sel gabungan tipe tunggal yang memiliki kekhususan tambahan. Ini

adalah komponen penting darisistem kekebalan tubuh. Mereka dapat

mengenali dan mengikat ke antigen yang spesifik. Pada

teknologi antibodimonklonal, sel tumor yang dapat mereplikasi tanpa

henti digabungkan dengan sel mamalia yang memproduksi antibodi.Hasil

penggabungan sel ini adalah hybridoma, yang akan terus memproduksi

antibodi. Antibodi monoklonal mengenalisetiap determinan yang antigen

(bagian dari makromolekul yang dikenali oleh sistem kekepalan tubuh /

epitope). Merekamenyerang molekul targetnya dan mereka bisa memilah

antara epitope yang sama. Selain sangat spesifik, merekamemberikan

landasan untuk perlindungan melawan patogen. Antibodi monoklonal

sekarang telah digunakan untuk banyakmasalah diagnostik seperti :

mengidentifikasi agen infeksi, mengidentifikasi tumor, antigen dan

antibodi auto, mengukurprotein dan level drug pada serum, mengenali

darah dan jaringan, mengidentifikasi sel spesifik yang terlibat dalam

responkekebalan dan mengidentifikasi serta mengkuantifikasi hormon

b. SDS PAGE

SDS-PAGE atau Sodium Dodecyl Sulfate – PolyAcrylamide Gel

Electrophoresis adalah teknik sederhana yang umum digunakan untuk

menganalisa ukuran protein

c. Indirect assay

indirect yang dideteksi dan diukur konsentrasinya merupakan

antibody. Pada ELISA indirect menggunakan suatu antigen spesifik

(monoklonal) serta antibody sekunder spesifik tertaut enzim signal

untuk mendeteksi keberadaan antibody yang diinginkan pada

sampel yang diuji.

d. Sandwich assay

Pada Teknik ELISA jenis ini menggunakan antibody primer

spesifik untuk menangkap antigen yang diinginkan dan antibody

sekunder tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan

antigen yang diinginkan. Pada dasarnya, prinsip kerja dari ELISA

sandwich mirip dengan ELISA direct, hanya saja pada ELISA

sandwich, larutan antigen yang diinginkan tidak perlu dipurifikasi.

Namun, karena antigen yang diinginkan tersebut harus dapat

berinteraksi dengan antibody primer spesifik dan antibody

sekunder spesifik tertaut enzim signal, maka teknik ELISA

sandwich ini cenderung dikhususkan pada antigen memiliki

minimal 2 sisi antigenic (sisi interaksi dengan antibodi) atau

antigen yang bersifat multivalent seperti polisakarida atau

protein. Pada ELISA sandwich, antibody primer seringkali disebut

sebagai antibody penangkap, sedangkan antibody sekunder

seringkali disebut sebagai antibody penangkap, sedagkan antibody

sekunder seringkali disebut sebagai antibody deteksi.

Dalam pengaplikasiannya, ELISA sandwich lebih banyak

dimanfaatkan untuk mendeteksi keberadaan antigen multivalent

yang kadarnya sangat rendah pada suatu larutan dengan tingkat

kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan ELISA sandwich memiliki

tingkat sensitivitas tinggi terhadap antigen yang diinginkan akibat

keharusan dari antigen tersebut untuk berinteraksi dengan kedua

antibody.

e. Nitrocellulose membrane

Merupakan suatu media atau berupa kertas yang menyerap

protein pada untuk dianalisa lanjut pada proses western blotting

misalnya.

3. Contoh hasil Western Blotting

A.

DAFTAR PUSTAKA:

A= Hasil Analisa menggunakan SDS page yang hanya menunjukkan deteksi potein hingga satuan 100ng

B= Hasil analisa menggunakan western blotting yang mampu menunjukkan deteksi protein hingga 1ng

A= Hasil Analisa menggunakan SDS page yang hanya menunjukkan deteksi potein hingga satuan 100ng

B= Hasil analisa menggunakan western blotting yang mampu menunjukkan deteksi protein hingga 1ng

Protein terdeteksi adanya dua pita protein pada ukuran berat molekul ± 75kDa dan ± 25 kDa

http://id.shvoong.com/medicine-and-health/medicine-history/2111504-

western-blot/#ixzz1fNk5xeOf

http://www.molecularstation.com/protein/western-blot/#top