5_mikrolaut_modul_5_ta20131.pdf

7/21/2019 5_mikrolaut_modul_5_ta20131.pdf

1/9

Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013 Page 19

MODUL

Teknik Identifikasi Bakteri

POKOK BAHASAN :1. Teknik Pewarnaan GRAM (Pewarnaan Differensial)

2. Uji Katalase

3. Pembuatan stok agar miring

TUJUAN PRAKTIKUM :

1. Mempelajari cara menyiapkan apusan bakteri dengan baik sebagai prasyarat untuk mempelajari

teknik pewarnaan;2. Mempelajari prosedur Pewarnaan Gram, memahami tahapan prosedur dan reaksi kimiawi yang

terlibat dalam prosedur.

3. Mempelajari salah satu uji biokimia katalase untuk identifikasi awal bakteri

TINJAUAN PUSTAKA :

Bakteri isolat tunggal dapat disimpan dalam waktu lama (4-6 bulan) dengan menggunakan agar

miring pada suhu dingin. Media padat dibuat menjadi agar miring di dalam Penyimpanan lebih

lama dapat dilakukan dengan menggunakan teknik kriopreservasi yaitu bakteri disimpan dalam

media-gliserol 50% pada suhu -80 0C. Agar miring juga dapat digunakan untuk melihat motilitas

bakteri. Pergerakan bakteri agar miring dapat dilihat dari bentuk goresan. Bentuk irregular ataupun

menyebar dari goresan menunjukkan bakteri bersifat motil, jika bentuk koloni mengikuti goresan

kemungkinan besar bakteri bersifat non motil.

Bakteri berukuran sangat kecil dan tipis sehingga sukar dilihat struktur tubuhnya walaupun dengan

bantuan mikroskop. Untuk melihat morfologi bakteri secara lebih jelas dikembangkan teknik

pewarnaan bakteri. Prinsip pewarnaan bakteri adalah pertukaran antara ion zat warna dengan ion

protoplasma sel.


2/9


Terdapat dua kelompok zat pewarna bakteri, yaitu : (1) bersifat Asam, berupa anion dan umum

digunakan dalam bentuk garam natrium. (2) bersifat Alkali, berupa kation dan umum digunakan

dalam bentuk klorida.

Selain zat warna diperlukan zat tambahan yang berfungsi untuk mengendapkan hasil reaksi zatwarna dengan komponen dinding sel bakteri. Zat tersebut dikenal dengan istilah zat Pematek yang

akan melekatkan zat warna pada plasma sel.

Teknik pewarnaan bakteri dapat dibagi menjadi dua jenis, yaitu :

Pewarnaan Sedehana atau Tunggal, dengan menggunakan satu macam zat warna seperti :

Metilen Blue, Karbol Violet dan Air Fucshin.

Pewarnaan Differensial dengan menggunakan dua atau lebih zat warna.

Pengamatan morfologi bakteri hasil pewarnaan dilakukan di bawah pengamatan mikroskop.

Berdasarkan Pewarnaan GRAM, bakteri diklasifikasikan ke dalam 2 (dua) kelompok besar yaitu :

Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif. Perbedaan utama di antara keduanya adalah struktur dan

komposisi dinding selnya. Bakteri Gram Positifmampu mempertahankan zat warna utama dalam

pewarnaan Gram, yaitu Gentian Violet, sehingga nampak berwarna ungu saat pengamatan

dikarenakan dinding sel kelompok bakteri ini tersusun oleh sebagian besar Peptidoglikan, yang

mampu mengikat zat warna dan tidak rusak saat dicuci dengan alcohol. Sementara itu, bakteri Gram

negatif memiliki komposisi dinding sel yang sebagian besar tersusun dari lapisan lipid, sehingga

pada saat pewarnaan kurang dapat mempertahankan zat warna utama terutama saat dicuci dengan

alcohol (lipid rusak saat dicuci dengan alcohol), akibatnya kelompok bakteri ini memberikan

kenampakan warna merah (warna dari zat warna ke dua : safranin atau air fuchsin) di akhir kegiatan

pewarnaan Gram.

Seri reagen yang digunakan dalam Teknik Pewarnaan Gram meliputi : Zat Warna I (Gentian/Crystal

Violet), Larutan Iodine, Alcohol, dan Zat Warna II (Safranin/ Air Fuchsin). Adapun ilustrasi kondisi

sel bakteri saat pewarnaan Gram tampak seperti pada Gambar berikut :


3/9


UJI KATALASE

Identifikasi suatu jenis bakteri dilakukan melalui serangkaian pengujian dan pengamatan.

Pewarnaan gram bertujuan untuk membantu mengetahui kategori kelompok bakteri berdasarkan

struktur dinding sel dan bentuk bakteri. Uji katalase merupakan salah satu pengujian biokimia untuk

mengidentifikasi bakteri apakah menghasilkan enzim katalase atau tidak. Enzim katalase dihasilkan

oleh beberapa jenis bakteri dalam rangka mencegah oksidasi radikal bebas yang dapat merusak atau

membunuh bakteri. Ada beberapa jenis pengujian biokimia lain yang merupakan bagian dari

pengidentifikasian suatu jenis bakteri diantaranya :kemampuan bakteri menghasilkan enzim

hidrolitik terhadap substrat yang ditambahkan pada media, kemampuan memfermentasi gula,

mengoksidasi nitrat dsb. Uji katalase sangat mudah dilakukan dengan menggunakan hydrogen

peroksida 3% yang diberikan pada bakteri target, pembentukan buih/busa menunjukkan

kemampuan bakteri menghasilkan enzim katalase.

Prinsip dari uji katalase adalah pernapasan anaerob, mikroorganisme memproduksi hydrogen

peroksida dan dalam beberapa kasus, bahkan mencapai racun toksik superoksida. Akumulasi dari

Gambar: Kondisi Sel Bakteri saat Pewarnaan Gram


4/9


zat ini dapat mengakibatkan kematian organisme kecuali mereka dapat mendegradasi secara

enzimatis. Zat ini diproduksi ketika lingkungan aerob, fakultatif anaerob, dan mikroaerofil

digunakan dalam jalur pernapasan aerobic, dimana oksigen merupakan akhir aseptor electron,

selama pendegradasian karbohidrat untuk produksi energy. Organisme mampu memproduksikatalase yang secara cepat mampu mendegradasi hydrogen peroksida.

2H2O2 2H2O + O2

Organisme aerobic yang kekurangan katalase dapat mendegradasi terutama superoksida toksik

menggunakan enzim superoksida dismutase. Produk akhir dari superoksida dismutase adalah

H2O2, tapi ini memiliki sedikit toksik terhadap sel bakteri daripada superoksida.

Produksi katalase dapat ditentukan dengan menambahkan substrat H2O2 tepat ketika diinkubasi

dalam NA agar miring kultur. Jika terdapat katalase, reaksi kimia dapat diindikasikan denganadanya buih-buih yang menandakan adanya oksigen bebas (O2). Jika tidak terdapat buih, maka

menunjukkan hasil negatif.

PROSEDUR PELAKSANAAN PRAKTIKUM :

1.

TEKNIK PEMBUATAN APUSAN BAKTERI

Alat : Jarum Ose

Gelas Object

Bunsen

Bahan : Biakan (Agar Culture/ Broth Culture)

NaCl Fisiologis

Spiritus

Prosedur :

Sumber dari biakan Padat (Solid Medium)

1. Dengan menggunakan Jarum Ose, ambil 2 loop NaCl Fisiologis, tempatkan di atas Object

Glass;

2. Dengan menggunakan Jarum Ose (ujung runcing), ambil 1 koloni bakteri dari biakan

Padat, tempatkan di atas suspensi NaCl Fisiologis yang sudah ada di atas Object Glass,

3. Ratakan suspensi dengan membentuk area apusan;

4. Keringkan suspensi pada suhu ruang untuk beberapa menit;

5. Lewatkan suspensi di atas api bunsen untuk fiksasi apusan.


5/9


Sumber dari biakan Cair (Liquid Medium)

1. Dengan menggunakan Jarum Ose, ambil 2 loop Biakan Cair (Broth Culture), tempatkan di

atas Object Glass;

2. Ratakan suspensi dengan membentuk area apusan;

3. Keringkan suspensi pada suhu ruang untuk beberapa menit;

4. Lewatkan suspensi di atas api bunsen untuk fiksasi apusan.


6/9


Ilustrasi Teknik Pembuatan Apusan bakteri dapat dilihat pada Gambar berikut :

Gambar: Teknik Pembuatan Apusan Bakteri


7/9


2.

TEKNIK PEWARNAAN GRAM

Alat :

Object Glass

Cover Glass Pipet Tetes

Botol Semprot

Bunsen

Bahan :

Apusan Bakteri

Zat Warna Gentian Violet Iodine

Alcohol

Zat Warna Safranin/ Air Fuchsin

Aquades

Spiritus

Prosedur :

1. Persiapkan Apusan bakteri yang telah dibuat pada tahap sebelumnya;

2.

Teteskan 1 tetes Zat Warna I (Gentian Violet)ke atas area apusan, biarkan selama 20 detik;

3. Cuci perlahan dengan menggunakan air aquades, biarkan 2 detik;

4. Teteskan 1 tetes Larutan Iodineke atas apusan, biarkan 30 detik s.d. 1 menit;

5. Cuci dengan Alcohol, hingga larutan yang mengalir sudah tidak berwarna (sekitar 10 20

detik);

6. Cuci perlahan dengan menggunakan air aquades, biarkan selama 2 detik;

7. Teteskan 1 tetes Zat Warna II (Safranin/ Air Fuchsin),biarkan selama 20 detik;

8.

Cuci perlahan dengan menggunakan air aquades, biarkan selama 2 detik;

9. Keringkan di suhu ruang;

10.Amati di atas mikroskop dengan perbesar 100 x Objektif, dengan bantuan minyak imersi;


8/9


Ilustrasi Prosedur Pewarnaan Gram dapat dilihat pada Gambar berikut :

Prosedur Uji Katalase

Bahan :

Biakan padat bakteri berumur 24 jam

NaCl fisiologis 0,9%

Hydrogen peroksida 3%

Alat:

Slide glass

Kawat ose

Bunsen

Gambar: Prosedur Pewarnaan Gram


9/9

5_mikrolaut_modul_5_ta20131.pdf

Documents