PETUNJUK PRAKTIKUM

Disusun oleh: Wahyu Widoretno

LABORATORIUM KULTUR JARINGAN TUMBUHAN JURUSAN BIOLOGI - FAKULTAS MIPA

UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG

2018

TransformasiGenetikTanamandenganAgrobacteriumrhizogenes

TeoriDasar Transformasigenetikmerupakansalahsatuteknikrekayasagenetik yang dapat menghasilkan tanaman transgenik yangmemiliki sifat baru. Tiga faktor yang harus dipenuhi dalamtransformasi genetik adalah ketersediaan gen yang akanditransformasikan, sistem transformasi gen ke dalam genomtanamantargetdansistemregenerasisel-sel transformanmenjadiplantlet atau tanaman yang membawa danmengekspresikan genasingtersebut. Transformasi genetik dengan perantara Agrobacteriummemiliki beberapa kelebihan yaitu dapat menghasilkan jumlahtransforman yang banyak, murah dan prosedurnya relatif lebihsederhana dibandingkan dengan teknik lainnya. Keberhasilantransformasi genetik ditandai dengan terintegrasi danterekspresinya gen yang diintroduksikan serta tetap terpeliharadalamprosespembelahanselsampairegenerasitanaman.

Agrobacterium rhizogenesmerupakanbakteri tanahgram-negatif yang mempunyai Ri-plasmid (root inducing plasmid) danmenginduksi penyakit akar rambut, yangmenyebabkan proliferasiakardaritempatinfeksi.T-DNAdariRi-plasmidtipeagropineterdiridari 2 daerah T-DNA yang terpisah pada Ri-plasmidnya, yaitu TL-DNAdanTR-DNA.TL-DNApadaRiplasmidmempunyai4genyaiturol A, B, C, dan D, yang mempunyai peran dalam induksi akarrambut. Sedangkan TR-DNA pada Ri-plasmid membawa gen yangbertanggung jawab untuk sintesis opin dan gen untuk sintesisauksin(aux1danaux2)(Gambar1).

JikaA.rhizogenesmenginfeksi tanaman,bagianT-DNAdariRi-plasmidditransferpadaseltanaman.DNAakanterintegrasipadakromosom tanaman dan akan mengekspresikan gen-gen untukmensintesis senyawa opin dan induksi akar rambut. Ekspresi genpada plasmid Ri dapat diketahui melalui pembentukan akaradventif pada tempat yang diinfeksi oleh Agrobacterium dandikenaldengan‘hairyroot’(akarrambut)(NilsondanOlsson1997;

Gelvin 2003). Beberapa penelitian menunjukkan bahwa gen auxtidak memegang peran utama dalam penyakit akar rambut,sementaragenroldiperlukanuntukinduksiakarrambut.

Produksi akar rambut yang diperantai oleh A.rhizogenesmerupakanalatyangpentinguntukbiosintesismetabolitsekunder.Teknologi kultur akar rambut telah terbukti merupakan sistemproduksi alternatif yang efisien untuk metabolit sekunder padabeberapa tanaman (Giri dan Narasu 2000; Guillon dkk., 2006).Penggunaan metode kultur akar rambut dengan bantuan A.rhizogenes dapat meningkatkan kandungan metabolit sekunderanthraquinone pada sel Rubia cordifolia (Bulgakov, dkk., 2003),glukotropaeolin dari Tropaeolum majus (Wielanek and Urbanek.1999), hiosiamindan skopolamindariAtropabelladonna (Kamadadkk., 1986; Aoki dkk., 1997) danDaturainnoxia (Boitel-Conti dkk.,2000). Keuntungan menggunakan kultur akar rambut hasiltransformasi dalam produksi metabolit sekunder adalah relatifseragam,memilikikestabilangenetikyangtinggi,pertumbuhannyacepat dengan menggunakan medium tanpa penambahan zatpengatur tumbuh serta mudah dimanipulasi untuk meningkatkanpembentukanmetabolit sekunder (Mathius dkk., 2006; Dhakulkardkk.,2005;Doran,2006)

Efisiensi transformasi pada tanaman dipengaruhi oleh: (1)umurtanamanpadasaatinfeksiyangberkaitandengankompetensisel, (2) umur isolat Agrobacterium yang digunakan untuk infeksiyang berhubungan dengan virulensi. Dalam hal ini umur isolatbakteri berkaitan dengan fase pertumbuhan Agrobacterium,sedangkan waktu inkubasi menentukan fase pertumbuhan yangberkaitan dengan proses molekuler dalam sel bakteri dalammengatur gen rol pada proses transformasi, dan (3) suhu untukpertumbuhanAgrobacterium.

Lama infeksi atau inokulasi bakteri dan kokultivasi jugadapat mempengaruhi efisiensi transformasi genetik. Pawlicki dkk.(1992) menyatakan bahwa efisiensi transformasi tertinggididapatkandaripotongantangkaidaunyangdikokultivasiselama2-3 hari sebesar 40-50% dan setelah 7 hari kokultivasi terjadipenurunan efisiensi karena kesulitan mematikan bakteri. Segmen

hipokotilkacangtanahyangdiinfeksidenganA.rhizogenesselama15menit dan lama kokultivasi selama 2 hari memberikan responpembentukanakarpalingtinggi(Karthikeyandkk.,2007).

Gambar 1. Struktur Ri-plasmid dan mekanisme transfer T-DNA

Agrobacteriumrhizogenespadaseltumbuhan.A. rhizogenesGambar 2. Induksi akar rambut melalui transformasi dengan

Agrobacteriumrhizogenes

Tujuan : melakukan transformasi genetik pada tanaman denganAgrobacteriumrhizogenes

Bahandanalat:● Biji tomat (Lycopersicon esculentum Mill.) dan ubi bit

merah/beetroot (Beta vulgaris), biakan AgrobacteriumrhizogenesATCC-15834

●MediaMS,mediaYMB/A(YeastMannitolBroth/Agar),antibiotikcefotaximdankanamycin

● Laminar air flow, autoklaf, spektrofotometer, sentrifus, shaker,Petridish, Erlenmeyer, oose, pinset, scalpel, gelas ukur,mikropipet

CaraKerja

Tahapan percobaan yang dilakukan meliputi: persiapanstrainA.rhizogenes,persiapaneksplankecambahtomatdanubibitmerah,tranformasigenetikA.rhizogenespadaeksplandanseleksiakarrambuttransformanputativepadamediumselektifkanamisin.

1.PersiapanisolatAgrobacteriumrhizogenes●Agrobacteriumrhizogenesdiremajakandengancaraisolatbakteri

diambil satu ose steril dan di-streak secara continous di atasmedia Yeast Manitol Agar (YMA) dan diinkubasi dalam suhuruangselama48jamdalamgelap.

● Setelah2 hari, biakanA. rhizogenes kemudiandikulturkanpadamediumYeastManitol Broth (YMB) dan diinkubasi dalam suhuruangselama24jamdengandishaker100rpm.

● Penentuan nilai Optical Density (OD) A. Rhizogenes dilakukandenganmengambilsatuoosekolonitunggaldandicampurkankedalam ± 35ml YMB dan diinkubasi dengan di shaker 100 rpmpada suhu ruang selama 16-24 jam kemudian dilakukanpengukuran OD dengan spektrofotometri pada panjanggelombang600nm.

● Suspensi A. rhizogenes dengan nilai OD yang telah diketahuikemudiandisentrifugasidengankecepatan5000rpmselama10menituntukmemisahkanA.rhizogenesdarisuspensi.

● Pellet yang terbentuk kemudian diambil dan disuspensikankembali pada mediumMS cair sehingga diperoleh suspensi A.rhizogenes pada medium MS dengan OD 0,5 masing-masingsebanyak20mldengankonsentrasibakteri105sel/ml.

2.Persiapaneksplanhipokotildandaunkecambah● Biji tomat dan ubi bit merah disterilisasi dengan baycline 20%

(0,25% NaOCl) selama 15 menit, kemudian dibilas denganaquadessteril2x,masing-masingselama5menit.

●Bijisterildikecambahkanpadamediaagar.●Hipokotildandaunkecambahberumur14haridigunakansebagai

eksplantransformasi3.TransformasiA.rhizogenespadaeksplan.●TransformasiA.rhizogenesdilakukanpadaeksplanhipokotildan

daunkecambahtomatdanubibitmerahumur14hari.● Eksplan hipokotil dan daun kecambah dipotong-potong dengan

ukuran 0,5 cm, ditransfer ke Petri dish yang berisi larutansuspensiA.rhizogenes20mldenganopticaldensity(OD)0,5.

● Sebagai kontrol, eksplan hipokotil dan daun tanpa diinokulasidenganA.rhizogenes.

●Eksplandilukai(ditusuk-tusuk)denganjarumsyringesteril.●CampuraneksplandanA.rhizogenesdiinkubasiselama60menit.● Eksplan yang telah diinokulasi dengan A. rhizogenes kemudian

diletakkandiataskertassaringsterilyangtelahdibasahidenganmedium MS cair untuk menghilangkan kelebihan suspensi A.rhizogenespadapermukaaneksplan

● Eksplan kemudian dikultur (dikokultivasi) padamediaMS padattanpazatpengaturtumbuhselama3haridalamkondisigelap.

● Setelah kokultivasi, eksplan dicuci dengan antibiotik cefotaxim500ppmselama5menituntukmenghilangkanA.Rhizogenes.

● EksplandikulturkanpadamediaMSpadatyang telahditambahcefotaxim 500 ppm selama 7 hari untuk mematikan A.rhizogenes.

4.Seleksidanperbanyakanakarrambuttransformanpadamediaselektifkanamisin

●Setelah7hari,eksplandipindahkanpadamediaselektifMSyangmengandung kanamisin. Kultur diinkubasi pada suhu 25 oCdalamkondisiterangselama6minggu.

● Eksplan yang membentuk akar rambut menandakan bahwaeksplan telah tertransformasi dengan Ri-plasmid dari A.rhizogenes.

● Parameter yang diamatimeliputi kecepatan pembentukan akar,persentase eksplan yang membentuk akar, jumlah akar yangterbentuktiapeksplan,panjangakarsertaberatbasahakar.

ProduksiMetabolitSekunderpadaKulturKalus

Teoridasar Kultur sel dan jaringan tumbuhanmerupakan teknik yangbermanfaat untuk mempelajari metabolisme tumbuhan dalamkondisi terkontrol. Sistem ini tidak hanya dalam membantu kitamemahamibagaimanaselmensintesisdanmengakumulasiproduksekunder tetapi juga merupakan sistem alternatif yang potensialuntukproduksimetabolit sekunder tumbuhan. Produksimetabolitsekunderdalamkulturjaringandanseltumbuhantelahdilaporkanpada antosianin pada kultur kalusVitis vinifera (Mihaidkk., 2010)dancatharanthus(PiovandanFilipinni,2007),rosmarinicacidpadaEchium amoenum (Mehrabani dkk., 2005); trans-resveratrol padajaringankalusVitisviniferaL(KeskindanKunter2010). Antosianin merupakan pigmen dari golongan flavonoidyang memperlihatkan warna merah muda sampai merah cerahyang terdapat pada semua jaringan tanaman. Pigmen antosianinini dapat dimanfaatkan sebagai pewarna makanan alami yangmenyehatkankarenamempunyaiaktifitasantioksidan,danterbuktisebagai antikanker, dan digunakan untuk melawan gangguancardiovascular,penyakitneurologi,diabetesdaninflamasi(Maharikdkk., 2009). Produksi antosianin dalam kultur jaringan dan seltumbuhan telah dilaporkan pada beberapa spesies tumbuhanmeliputi wild carrot (Dougall dan Weyrauch 1980), Hibiscussabariffa (Mizukami, dkk. 1988), Vitis sp. (Tamura, dkk. 1989),strawberry(El-SawydanTaha2000)dancatharanthus(Taha,dkk.,2008). Penerapan kultur jaringan tumbuhan untuk produksimetabolit sekunder mempunyai beberapa keuntungan.Keuntungan-keuntungan tersebut, antara lain (a) membentuksenyawa bioaktif dalam kondisi terkontrol dan waktu yangbutuhkanrelatif lebihsingkat, (b)bebasdarikontaminasimikroba,(c) setiap sel dapat diperbanyak untuk menghasilkan senyawametabolit sekunder tertentu, (d) pertumbuhan sel terkontrol danprosesmetabolismenyadapatdiatur secara rasional,dan (e) tidak

bergantung kepada kondisi lingkungan seperti keadaan geografi,iklimdanmusim(Fitriani,2003). Produksi metabolit sekunder dalam kultur jaringan dapatditingkatkan dengan menggunakan metode elisitasi, pemberianprekursorsertamodifikasimediumdan lingkungantumbuhkultur.Elisitasimerupakanprosespenambahanelisitorpadaseltumbuhandengan tujuan untuk meningkatkan pembentukan metabolitsekunder. Elisitor terdiri atas dua kelompok, yaitu elisitor abiotikdan elisitor biotik. Elisitor abiotik berasal dari senyawa anorganik,radiasi secara fisik seperti ultraviolet, logam berat dan deterjen.Elisitor biotik dapat dikelompokkan dalam elisitor endogen danelisitoreksogen.

Pengaruh elisitor terhadap peningkatan sintesis metabolitsekunder dimulai dengan interaksi elisitor dengan reseptormembran tanaman. Interaksi tersebut menimbulkan sinyal yangakanmengaktifkangenspesifikdalamsintesismetabolitsekunder.Beberapa penelitian telah membuktikan bahwa metode elisitasidapatmeningkatkankandunganmetabolitsekunderKapsaicinpadakultur sel Capsicium frutescens (Sudha dan Ravishankar, 2002),gosipol dalam kultur akar kapas (Setiawati, 2006) dan solasodinpadakulturpucukSolanummammosumL.(Kusumastuti,2006). Beberapa penelitian menunjukkan bahwa auksin dansitokinin merupakan faktor utama dalam mengatur produksiantosianin secara in vitro (El-Sawy, 2000). Konsentrasi dankeseimbanganzatpengaturtumbuh,tipeeksplanmerupakanfaktorpenting dalam memacu kecepatan pertumbuhan kalus danproduksiantosianin(Mizukamidkk,1988;Endress,2008).

Gambar 3. Pertumbuhan kalus dan produksi antosianin pada kultur kalus

Crataegus sinaica 6 minggu setelah kultur pada medium MS denganpenambahan zat pengatur tumbuh yang berbeda. Pertumbuhan kalusA)padamediaMS+2mg/LBA+1mg/LNAA,(B1)padamediaMS+1mg/LKIN+0.5 mg/L NAA, (B 2) pada media MS+1mg/L BA+0.5mg/NAA B3padamediaMS+2mg/L BA+1mg/L NAA, (C 1, 2, 3) Ekstrak antosianindarikaluspadagambarB.(Maharikdkk.,2009).

Tujuan : Induksikalusdanproduksimetabolitsekunderantosianin

dalamkulturkalusBahandanalat:●Tanamanmawar(RosagallicaatauRosahybrid),bijibijiubibitmerah(Betavulgaris)

●Methanol,HCl,etanol,asamasetatglasial,butanol,kertassaring●MediaMS+IAA2mg/L+kinetin1mg/LMediaMS+IAA2mg/L+BA1mg/L●Mortar+pestle,gelasbeker,pipetukur,corong,botolflakon,

pipakapiler,lampuUV,platsilicagelF254,spektrofotometer.Carakerja1.Perkecambahanbiji●Bijiubibitmerahdisterilisasidenganbaycline20%(0,25%NaOCl)

selama 15 menit, kemudian dibilas dengan aquades steril 2x,masing-masingselama5menit.

●Bijisterildikecambahkanpadamediaagar.

●Hipokotildandaunkecambahberumur14haridigunakansebagaieksplanuntukinduksikalus

2.Induksikalus● Daun dan batang muda tanaman mawar disterilisasi dengan

baycline30%(0,25%NaOCl)selama15menit● Larutansterilandibuangdaneksplandibilasdenganairdistilasi

steril2x@5menit.● Eksplan daun dan batang yang telah disterilisasi atau eksplan

daundanhipokotildarikecambahinvitroubibitmerahdikulturpadamediadankulturdiinkubasidibawahtemperatur26±1oCdibawahpencahayaan16jam/hari.

● Setelah 3 minggu, kalus disubkultur pada media yang baru.Sebelum disubkultur, diamati pertumbuhan kalus denganmenghitung persentase pembentukan kalus dan menimbangberatbasah(dalamkondisisteril).

2.Subkulturkalusdanelisitasiataupemberianprecursor● Kalus disubkultur pada media baru yang sama dengan media

induksikalus.● Setelah 3 minggu kultur, diamati pertumbuhan kalus dan

dilakukananalisiskandunganantosianinkalus.3.Analisisantosianin.• Kalusditimbang0,1g,digerusdenganmortaldanpestledan

dihomogenasi dengan larutan methanol asam 10 ml (rasioMeOH:HCl=99:1V/V).

• Larutan disimpan dalam kondisi gelap selama 24 jam padasuhu250C.

• Sampeldisentrifugasiselama10menitpadakecepatan4000rpm

• Supernatan diambil untuk digunakan analisis kuantitatif dankualitatifantosianin.

• Analisis kuantitatif antosianin dilakukan denganmenggunakan spektrofotometri sedangkan analisis kualitatif

antosianin dilakukan dengan menggunakan metodekromatografilapistipis(KLT)Analisiskuantitatif

• Konsentrasi pigmen antosianin diekspresikan sebagaicyanidin-3-glucoside

• PenentuankandunganantosianintotaldilakukandenganmetodepHDifferentialMethod (GiustiandWrolstad,2000)

• Ekstrakantosianin/supernatandilarutkandalambufferKCL-HCL(1M,pH1)danbufferNaOAc(1M,pH4,5)(Lampiran4) dengan perbandingan ekstrak terhadap buffer = 1:5(v/v).

• Larutandiinkubasidalamsuhuruangselama15menit.• Masing-masing larutandiukurabsorbansinyapadapanjang

gelombang520nmdan700nm.• Kandunganantosianin(cyanidin-3-glucosida,mg/L)dihitung

denganmenggunakandenganrumus:Kandunganantosianin(mg/L)=AxMWxDFx103/εx1

DimanaA = absorbansi larutan = (A520nm – A700nm)pH 1.0 –

(A520nm–A700nm)pH4.5MW = berat molekul = 449,2 g mol-1 untuk cyanidin-3-

glucoside(cyd-3-glu) DF=faktorpengenceran 1=tebalkuvet

ε=coefisienekstingsi,untukcyd-3-glu=26900Lmol-1cm-1 103=faktorkonversidarigkemg

Analisiskualitatif• Supernatan (dapatdipekatkandenganrotaryevaporator/gas

nitrogen) 10 μl ditotolkan pada plat silica gel F254 denganmenggunakanpipakapilerpadajarsak1cmdarigarisbawahplatsilicagelF254.

• Plat yang sudah ada totolan sampel dielusi dalam eluenbutanol:asam asetat glasial:air (3:1:1) sampai tanda bataskertas(1cmdaribatasplatbagianatas).

• HasilkromatogramkemudiandilihatdibawahsinarUVpadapanjanggelombang254dan366.

• Derajat letak bercak pada kromatogram KLT ditentukanberdasarkan nilai Rf. Nilai Rf dapat dihitung dengan rumusberikut:Rf=Jarakyangditempuhsubstansi/Jarakyangditempuholeh

pelarut

PengamatanNo Tanaman Media BB

kalus Warna awal

sampel

Warna setelah

ekstraksi

Jumlah spot

Nilai Rf

Nilai Absorbansi

1 Mawar 1 2

2 Ubi bit 1 2

Daftar Pustaka Aoki, T, H. Matsumoto, Y. Asako, Y. Matsunaga & K. Shimomura. 1997. Variation

of alkaloid productivity among several clones of hairy roots and regenerated plants of Atropa belladonna transformed with Agrobacterium rhizogenes 15834. Plant Cell Rep.,16: 282-286.

Atlas, R.M. 2004. Handbook of Microbiological media. Third edition. CRC Press. New York.

Boitel-Conti, M., J.C. Laberche, A. Lanoue, C. Ducroucq and B.s. Sangwan-Norreeel. 2000. Influence of feeding precursors on tropane alkaloid production during an abiotic stress in Datura innoxia transformed roots. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 60 (2): 131-137

Bulgakov, V.P. , G. K. Tchernoded, N. P. Mischenko, Yu. N. Shkryl, V. P. Glazunov, S. A. Fedoreyev, and Yu. N. Zhuravlev. 2003. Increase in Anthraquinone Content in Rubia cordifolia Cells Transformed by rol Genes Does Not Involve Activation of the NADPH Oxidase Signaling Pathway. Biochemistry 68 (7): 795-801.

Dhakulkar, S., S. Bhargava, T.R. Ganapathi and V.A. Bapat. 2005. Induction of Hairy Roots in Gmelina arborea Roxb. Using Agrobacterium rhizogenes. Founder’s Day Special Issue. 100-105

Doran, P.M. 2006. Properties and Applications of Hairy Root Cultures. Department of Biotechnology, University of New South Wales, Sydney, Australia

Dougall, D.K. and K.W. Weyrauch, 1980. Abilities of organic acids to support growth and anthocyanin accumulation by suspension cultures of wild carrot cells using ammonium as the sole nitrogen source. In vitro 16: 969-975.

El-Sawy, A. and H.S. Taha, 2000. Stimulation of anthocyanin production in strawberry callus cultrures. J. Agric.Sci. Mansoura Uni., 25(4): 2247-2256

El-Sawy A. and HS. Taha. 2000. Stimulation of anthocyanin production in strawberry callus cultrures. J. Agric.Sci., 25(4):2247-2256.

Endress R. 2008. Plant cells as producers of secondary compounds, in Anthocyanins Biosynthesis Functions and Applications K Gould, K Davies, C Winfield (1stEd) Springer, pp. 110-111.

Fitriani, A. 2003. Kandungan Ajmalisin Pada Kultur Kalus Catharanthus roseus (L.) G. Don Setelah Dielisitasi Homogenat Jamur Pythium phanidermatum Edson Fitzp. http://tumoutou.net/6_sem2_023/any_fitriani.htm. Diakses 11 Januari 2008

Gelvin, S.B. 2009. Agrobacterium in the genomics age. Plant Physiology 50:1665-1676.

Giri A, Narasu MJ. 2000. Transgenic hairy roots: recent trends and applications. Biotechnol. Adv. 18: 1-22.

Guillon S, Tremouillaux-Guiller J, Pati PK, Rideau M, Gantet P. 2006. Harnessing the potential of hairy roots: dawn of a new era. Trends. Biotechnol. 24: 403-409.

Kamada, H., N. Okamura, M.Satake, H.Harada & K. Shimomura. 1986. Alkaloid production by hairy root culture in Atropla belladonna. Plant Cell Rep.5: 239-242.

Karthikeyan, A. S. Palanivel, S. Parvathy and R.B. Raj. 2007. Hairy root induction from hypocotyls segments of groundnut (Arachis hypogaea L.). African Journal of Biotecnology 6 (15): 1817-1820

Keskin N and B. Kunter. 2010. Production of trans-resveratrol in callus tissue of Vitis vinifera L. in response to ultraviolet-C irradiation. The Journal of Animal & Plant Sciences, 20(3), 2010, Page: 197-200

Kusumastuti, M. Y. 2006. The influence of Copper and Cobalt Ions on The Growth Index and Solasodine Accumulation in Shoot Culture of Solanum laciniatum Ait. Undergraduate Theses Airlangga University

Maharik N, S. Elgengaihi, H Taha 2009. Anthocyanin production in callus of Crataegus sinica Boiss. International Journal of Academic Research 1(1)

Mathius, N. T., N. Haris, J. Santoso dan A. Heri. 2006. Pengaruh elisitasi terhadap pertumbuhan dan produksi alkaloida kinolin dari akar rambut tanaman kina(Cinchona succirubra Pavon ex Klotzsch). Menara Perkebunan 74 (1): 10-22

Mehrabani M, Shams-Ardakani M, Ghannadi A, Dehkordic NG and Jazi SES. 2010. Production of Rosmarinic Acid in Echium amoenum Fisch. and C.A. Mey. Cell Cultures. Iranian Journal of Pharmaceutical Research 2: 111-115

Mihai R, Mitoi M, Brezeanu A, Cogalniceanu G. 2010. Two–stage system, a possible strategy for the enhancement of anthocyanin biosynthesis in a long-term grape callus cultures. Romanian Biotechnological Letters 15 (1)

Mizukami, H., K. Tomita, H. Ohashi and N. Hiraoka, 1988. Anthocyanin production in callus cultures of roselle (Hibiscus sabdariffa L.). Plant Cell Rep. 7: 553-556.

Nilson, O. dan O. Olson. 1997. Getting to the root: the role of the Agrobacterium rhizogenes rol genes in formation of hairy roots. Physiol. Plant 100, 463-473

Piovan A and Filippini R. 2007Anthocyanins in Catharanthus roseus in vivo and in vitro: a review. Photochemistry review 6 (2-3): 235-242

Setiawati, T. 2001. Pengaruh Pemberian Elisitor Yang Berasal dari Jamur Verticilum dahliae Terhadap Kandungan Gosipol dalam Kultur Akar. Tesis. 571.638

Sudha, G., G. A. Ravishankar,. 2002. Influence of Calcium Channel Modulators in Capsaicin Production by Cell Suspension Cultures of Capsicum frutescens Mill. Researce Communication. 1:570- 578

Taha, H. S., Abd El-Rahman, R.A., Fathalla, M. Abd-El-Kareem and Aly, U.E. 2008. Successful Application for Enhancement and Production of Anthocyantn Pigment from Calli Cultures of Some Ornamental Plants. Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 2(4): 1148-1156

Tamura, H., Y. Kumaoka and H. Sugisawa, 1989. Identification and quantitative variation of anthocyanins produced by cultured callus tissue of Vitis sp. Agric Bio. Chem., 53: 1969-1970.

Wielanek, M. & H. Urbanek. 1999. Glucotropaeolin and myrosinase production in hairy root cultures of Tropaeolum majus. Plant Cell Tiss. & Org. Cult. 57: 39-45.

LAMPIRAN Lampiran 1. Komposisi Medium MS dan Yeast Mannitol Komposisi medium MS (Murashige and Skoog, 1962)

Komponen Jumlah (mg/L) Makronutrien KNO3 NH4NO3 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O KH2PO4

1 900 1 650 440 370 170

Mikronutrien MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O H3BO3 KI Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O FeSO4.7H2O (dilarutkan dengan Na2EDTA 37,3 mg/l)

22,3 8,6 6,2 0,83 0,25 0,025 0,025 27,8

Vitamin Thiamin-HCl Nicotinic acid Pyridoxine HCl Glycin

0,1 0,5 0,5 2

Myo-inositol 100 Sukrosa 30 000 pH 5.5 - 5.8

Komposisi medium Yeast Mannitol (Atlas, 2004)

Bahan Kimia Berat (mg/l) K2HPO4 0,5 MgSO4.7H2O 0,2 NaCl 0,1 D-mannitol 10 Yeast ekstrak 0,4

Ket: pH 6,8-7

Lampiran 2. Pembuatan Medium Pembuatan media MS (1 liter) • Timbang masing-masing komponen media (untuk komponen media dengan

jumlah yang sangat kecil, terutama mikronutrien dibuat stok terlebih dahulu) dengan jumlah sesuai dengan tabel 1, masukkan ke dalam Erlenmeyer 1 liter.

• Tambahkan sukrosa 3 g/L dan zat pengatur tumbuh dengan konsentrasi sesuai perlakuan, dan tambahkan aquadest sampai volume 900 ml.

• Ukur pH medium dengan pH meter antara 5,5-5,8. Perhatikan cara mengoperasikan pH meter. Jika pH terlalu rendah naikkan dengan menambahkan NaOH 0,1 N dan jika pH terlalu tinggi turunkan dengan menambahkan HCl 0,1 N.

• Tambahkan agar 9 g/L, kemudian tambahkan aquadest sampai volume 1 liter. Sambil diaduk panaskan medium sampai mendidih kemudian masukkan ± 20 ml (sesuaikan dengan volume botol) ke dalam botol kultur dan tutup rapat dengan aluminium foil. Beri label yang bertuliskan jenis dan konsentrasi zpt yang ditambahkan.

• Sterilkan medium dengan autoklav pada suhu 121 C, tekanan 15 lbs (1,5 atm) selama 15 menit.

• Keluarkan dari autoklav dan simpan di ruang penyimpanan.

Lampiran 3. Komposisi media Yeast Manitol (Atlas, 2004)

Bahan Berat untuk 1 liter media (g) KH2PO4 0.5 MgSO4.7H2O 0.2 NaCl 0.1 D-Manitol 10 Yeast ekstrak 0.4

Ket: untuk pembuatan 1 liter media Yeast Manitol Agar (YMA), dibutuhkan 11 g agar

pH 6.8 ± 0.2 Pembuatan Media Yeast Manitol: Media Yeast Manitol Broth dan Yeast Manitol Agar

- Timbang masing-masing komponen media Yeast Manitol dan dilarutkan dalam aquadest ¾ volume (± 750 mL), kemudian dihomogenkan

- pH larutan diukur sampai 6.8, peningkatan atau penurunan pH dilakukan dengan menambahkan larutan NaOH atau HCl

Media Yeast Manitol Broth - Volume larutan ditambah dengan aquadest sampai 1000 mL - Larutan dalam erlenmeyer ditutup dengan aluminium foil dan

disterilisasi dengan autoclav dengan suhu 121oC selama 15 menit Media Yeast Manitol Agar

- Larutan ditambah agar 11 g, volume larutan ditambah aquadest sampai 1000 mL

- Larutan dipanaskan (sambil diaduk) sampai mendidih dan larutan ,menjadi bening.

- Larutan dibagi dalam beberapa cawan Petridish, selanjutnya cawan ditup dengan aluminium foil/kertas dan disterilisasi dengan autoclav dengan suhu 121oC tekanan 2 atm selama 15 menit.

Lampiran 4 Pembuatan larutan buffer

• Buffer pH 1,0 (potassium chloride, 0,025M) Timbang 1,86 g KCL, masukkan ke dalam beaker dan tambahkan air destilasi sampai 980 mL. Ukur datan ur pH menjadi 1 (±0,05) dengan HCL. Transfer ke labu volumetrik dan encerkan/tambahkan dengan air destilasi sampai volume 1 L.

• Buffer pH 4,5 (sodium acetate, 0.4 M) Timbang 54,43 g CH3CO2Na.3H2O, masukkan ke dalam beaker dan tambahkan air destilasi sampai volume 960 ml. Ukur pH dan atur pH menjadi 4,5 (±0,05) dengan HCL.Transfer ke labu volumetrik dan encerkan/tambahkan dengan air destilasi sampai volume 1 L.

Lampiran 5. Format Laporan

Judul/Topik Praktikum

1. Latar Belakang (min 1,5 halaman) 2. Tujuan 3. Cara Kerja (Diagram alir) 4. Hasil dan Pembahasan 5. Kesimpulan 6. Referensi (min lima; 3 asing, 2 indonesia) 7. Lampiran