7

2. TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Botani dan Taksonomi Tanaman Sambiloto

Tanaman sambiloto (Andrographis paniculata (Burm.f.) Wallich Ex Ness)

disebut juga “King of bitters” adalah salah satu tanaman obat yang menjadi

unggulan nasional (Ditjen POM 2001) dan diprioritaskan serta prospektif untuk

dikembangkan di Indonesia (Kintoko 2006). Subramanian et al. (2012) bahkan

menuliskan bahwa sambiloto adalah a bitter plant with a sweet future untuk

menggambarkan prospektifnya tanaman obat ini. Tanaman sambiloto berasal dari

semenanjung India dan Sri Lanka (Lattoo et al. 2006; Mishra et al. 2007;

Jarukamjorn & Nemoto 2008). Tanaman ini tumbuh secara alami di Asia

Tenggara yaitu India (dan Sri Lanka), Pakistan dan Indonesia tetapi

dibudidayakan secara ekstensif di China dan Thailand, timur dan barat India, serta

Mauritius (Mishra et al. 2007). Tanaman ini kemudian menyebar ke daerah tropis

Asia hingga sampai di Indonesia.

Gambar 1. Tanaman Sambiloto

Di India, sambiloto dahulu adalah tumbuhan liar yang digunakan untuk

mengobati penyakit disentri, diare, atau malaria. Saat ini tanaman sambiloto

sangat bernilai untuk sistem pengobatan tradisional di India seperti pengobatan

Ayurvedic, Unani dan Siddha. Hal ini ditemukan dalam Indian Pharmacopeia dan

8

telah disusun paling sedikit dalam 26 formula Ayurvedic (Lattoo et al. 2006). Di

China dalam Traditional Chinese Medicine (TCM), sambiloto diketahui penting

sebagai tanaman cold property dan digunakan sebagai penurun panas serta

membersihkan racun-racun di dalam tubuh (Mishra et al. 2007). Di Thailand,

semenjak tahun 1999 sambiloto telah dijadikan sebagai salah satu tanaman yang

termasuk dalam The National List of Essential Drug (Jarumkajorn & Nemoto

2008). Di Indonesia Departemen Kesehatan melalui Ditjen POM (2001) telah

memasukkan tanaman sambiloto dalam 9 tanaman obat unggulan yang prospektif

untuk dikembangkan.

Adapun klasifikasi secara taksonomi dari tanaman sambiloto adalah:

Kingdom : Plantae, Plants;

Subkingdom : Tracheobionta, Vascular plants

Super division : Spermatophyta, Seed plants

Division : Angiosperma

Class : Dicotyledonae

Sub class : Gamopetalae

Series : Bicarpellatae

Order : Personales

Tribe : Justicieae

Family : Acanthaceae

Genus : Andrographis

Species : paniculata (Mishra et al. 2007)

Sambiloto dapat tumbuh di semua jenis tanah sehingga tanaman ini

terdistribusi luas di belahan bumi. Habitat aslinya adalah tempat-tempat terbuka

yang teduh dan agak lembab, seperti kebun, tepi sungai, pekarangan, semak, atau

rumpun bambu. Sambiloto dapat tumbuh di dataran rendah sampai dengan

ketinggian 700 m dpl (Mishra et al. 2007).

Deskripsi secara botani tanaman sambiloto merupakan tanaman tahunan,

herba semusim, bentuk tanaman lurus bercabang dengan tinggi berkisar antara 30-

110 cm. Batang berkayu berbentuk bulat, berwarna hijau tua, dengan cabang

utama memiliki batang berbentuk acutely quadrangular, tekstur mudah patah

9

dengan banyak cabang (monopodial) berbentuk segiempat (kwadrangularis)

dengan nodus yang membesar (Mishra et al. 2007; Jarumkajorn & Nemoto.

2008).

Daun tunggal sederhana, letak berhadapan bersilang, bertangkai pendek,

berbentuk pedang (lanset) dengan tepi rata (integer), pangkal runcing, ujung

meruncing dan permukaannya halus, berwarna hijau, permukaan atas berwarna

hijau tua, bagian bawah berwarna hijau muda, panjangnya 2-12 cm, dan lebar 1-3

cm (Mishra et al. 2007; Subramanian et al. 2012).

Perbungaan rasemosa yang bercabang membentuk malai, keluar dari ujung

batang atau ketiak daun. Bunganya berwarna putih keunguan, berbentuk jorong

(bulan panjang) dengan pangkal dan ujungnya yang lancip, dengan 5 kalix, bentuk

tabung dengan panjangnya berkisar antara 6 mm (Mishra et al. 2007). Tanaman

berbunga dalam waktu 90-120 hari setelah germinasi.

Gambar 2. Bunga, biji dan kapsul buah tanaman sambiloto

Kapsul dari tanaman memanjang, linear-oblong, panjangnya 1–2 cm dan

lebarnya 2–5 mm. Biji sangat kecil, dengan bentuk subquadrate dengan jumlah 1-

5 buah (Mishra et al. 2007). Di Australia bunga dan buah ditemukan antara bulan

Nopember sampai bulan Juni, sedang di Indonesia bunga dan buah dapat

ditemukan sepanjang tahun. Di India, bunga dan buah bisa dijumpai pada bulan

Oktober atau antara Maret sampai Juli.

Sambiloto merupakan tanaman menyerbuk sendiri atau self pollination

(Latto et al. 2006; Wijarat et al. 2012). Sifat ini berdampak pada keragaman

10

genetik sambiloto yang sangat rendah (Sabu et al. 2001; Maison et al. 2005;

Sakuanrungsirikul et al. 2008; Latoo et al. 2008; Pandey & Mandal. 2010; Wijarat

et al. 2012).

2.2. Efek Farmakologi Sambiloto

Sambiloto mengandung senyawa bioaktif yaitu diterpen lakton, flavanoid

(Akbar 2011) dan polifenol (Chao & Lin. 2010). Ekstraksi dengan menggunakan

etanol atau methanol dari tanaman utuh, daun dan stem menghasilkan 20 lebih

senyawa diterpen dan lebih dari 10 senyawa flavanoid. Pada analisa senyawa

diterpen didapatkan 4 komponen utama senyawa yang paling dominan dan berasa

pahit (Yang et al. 2012) yaitu andrographolide, dehydroandrographolide,

deoxyandrographolide dan neoandrographolide (Gambar 3), yang juga merupakan

komponen senyawa aktif utama pada sambiloto.

Gambar 3. Struktur kimia dari 4 komponen utama diterpenoid yang terdapat pada tanaman sambiloto: andrographolide, dehydroandrographolide, deoxyandrographolide dan neoandrographolide (Yang et al. 2012).

Secara farmakologis tanaman sambiloto memiliki kisaran fungsi yang

sangat luas yaitu sebagai hepatoproteksi, gastroproteksi, anti alergi, anti-virus,

antipiretic, vermicidal, anti-jerawat, analgesik, anti-inflammatory, anti-bakteri,

anti-malaria, antityphoid, anti-kanker, anti-atherosclerotic, anti-hyperglycemic

dan hypoglycemic, anti-diare, trombolityc, disamping dapat juga digunakan untuk

peningkatan imunitas/ immunomodulator (Mishra et al. 2007; Jarukamjorn &

Nemoto 2008; Chao & Lin 2010; Akbar. 2011; Chowdhury et al. 2012).

11

Sambiloto juga menjadi obat menakjubkan pada tahun 1919 karena dapat menjadi

obat utama pada saat terjadi epidemik influenza yang terjadi secara global

(Sharma et al. 2009). Penelitian yang telah dilakukan di Bastyr University USA,

bahkan telah menemukan aktivitas anti HIV pada andrographolide yang di isolasi

dari tanaman sambiloto yang berasal dari Indonesia (Otake et al. 1995).

Andrographolide (C20H30O5) mudah larut dalam methanol, etanol, piridin,

asam asetat dan aseton dan sukar larut dalam eter dan air. Titik leleh dari senyawa

andrographolide adalah 228o-230oC, spektrum UV pada etanol dengan λ

maksimal adalah 223 nm (Wongkittipong et al. 2000). Pada tanaman sambiloto

kandungan andrographolide terakumulasi paling banyak di daun yaitu sebesar

2,39% sedangkan paling rendah ditemukan di biji (Sharma et al. 1992).

Konsentrasi andrographolide paling tinggi ditemukan pada saat sebelum tanaman

berbunga, semakin awal maka semakin bagus untuk dipanen.

Kandungan andrographolide pada tanaman sambiloto yang diisolasi dari

beberapa lokasi yang berbeda rata-rata berkisar antara 0.95%-2% berat kering

(Sabu et al. 2001; Raina et al. 2007; Patarapanich et al. 2007; Sharma, et al. 2009;

Pandey & Mandal 2010; Mamatha 2011). Kandungan tersebut bergantung pada

lokasi penanaman (letak geografi), musim tanam, genotipe tanaman dan variasi

somaklonal (Koobkokkruad et al. 2008; Pandey & Mandal 2010). Penelitian yang

dilakukan oleh Bhan et al (2006) mendapatkan kadar andrographolide yang

bervariasi pada saat dipanen pada bulan yang berbeda. Dari penelitian ini

diketahui kadar andrographolide berkisar antara 5%-7% yang dipanen pada bulan

September sampai November. Kadar andrographolide juga didapatkan bervariasi

ketika dianalisa pada tahap pertumbuhan yang berbeda (Parasher et al. 2011) yaitu

berkisar antara 0.25%-3.02% yang diukur pada umur 30-120 hari. Semakin lama

tahap pertumbuhan sambiloto maka kadar andrographolide yang didapatkan juga

semakin tinggi (120 hari).

Andrographolide merupakan golongan dari diterpenlakton. Sebagai bagian

dari golongan diterpen andrographolide mengikuti jalur biosintesis dari terpenoid.

Semua golongan terpenoid disintesis melalui kondensasi isopentenil diphosphate

(IDP/IPP) dan Allylic isomer dimethyl allyl diphosphate (DMADP/DMAPP).

Biosintesis dari terpenoid terjadi di sitosol dan plastida (Aharoni et al. 2006).

12

Dijelaskan oleh Jha et al. (2011) jalur MVA terjadi di dalam sitosol sedangkan

jalur MED/DXP terjadi di dalam plastida. IDP/IPP dan DMADP/DMAPP

disintesis melalui jalur 2-methylerythritol 4-phosphate (MEP) melalui deoxy-D-

xylullose 5-phosphatase dalam plastida. IDP/IPP juga disintesis di sitosol melalui

jalur mevalonat.

Urutan penambahan kepala ke ekor pada unit IDP/IPP ke

DMADP/DMAPP menghasilkan prenyl diphosphates geranyl diphosphate (GDP),

farnesyl diphosphate (FDP) dan geranylgeranyl diphosphate (GGDP/GGPP). Tiga

komponen ini yang menjadi prekursor untuk sintesis monoterpen, sesquiterpen

dan diterpen. Secara umum GDP dan GGDP/GGPP dalam pastida digunakan

sebagai substrat untuk biosintesis monoterpen dan diterpen seangkan FDP di

sitosol digunakan untuk biosintesis sesquiterpen.

Penelitian yang dilakukan oleh Srivastava dan Akhila (2010)

menghasilkan jalur biosintesis andrographoide mengikuti 2 jalur yaitu jalur MVA

(jalur asam mevalonat) dan jalur MEP/DXP (jalur methylerythritol phosphate).

Pada jalur MEP/DXP didapatkan akumulasi andrographolide yang lebih banyak

jika dibandingkan dengan jalur MVA. Aharoni et al. 2006 menambahkan bahwa

pada jalur MEP/DXP, IDP/IPP dan DMADP/DMAPP membentuk 2 rantai, rantai

pertama menghasilkan GDP yang selanjutnya akan menghasilkan senyawa

monoterpen (C10), sedangkan rantai kedua berupa GGDP/GGPP bercabang

menghasilkan senyawa diterpen (C20) dan tetraterpen (C40) (Gambar 4).

Srivastava dan Akhila (2010) menambahkan bahwa jalur diterpen yang dihasilkan

dari oxido GGDP/GGPP menghasilkan senyawa andrographolide (Gambar 5).

Penelitian dari Jha et al (2011) mendapatkan hasil bahwa 3-hydroxy-3-

methylglutaryl-coenzyme A reductase (hmgr) adalah salah satu enzim kunci yang

berperan pada akumulasi kandungan andrographolide dan klorofil pada tanaman

sambiloto.

13

Gambar 4. Jalur biosintesis andrographolide. Pembentukan adrographolide

melalui jalur MVA dan jalur MEP/DXP di sitosol dan plastida (Aharoni et al. 2006).

Gambar 5. Jalur diterpen yang dihasilkan dari oxido GGDP/GGPP menghasilkan

senyawa andrographolide (Srinivastava & Akhila. 2010; Jha et al. 2011)

andrographolide

14

2.3. Perbaikan Mutu Tanaman Obat

Pemuliaan atau perbaikan mutu tanaman adalah salah satu strategi yang

dapat digunakan untuk mempertinggi keragaman genetik dan meningkatkan

kandungan senyawa aktif pada tanaman obat. Teknik pemuliaan tanaman secara

konvensional dan bioteknologi dapat diterapkan pada tingkat genetik untuk

perbaikan mutu dan konsistensi obat-obatan herbal agar dapat dibudidayakan dan

juga untuk memodifikasi potensi farmasi dan toksisitasnya (Canter et al. 2005).

Pemuliaan tanaman menghendaki adanya variasi genetik dari sifat tanaman yang

bermutu yang dapat berguna untuk perbaikan sifat tanaman tersebut (Novak &

Brunner 1992).

Pemuliaan mutasi adalah teknik pemuliaan yang dapat menghasilkan

variabilitas pada populasi yang mengalami mutasi, melalui perubahan secara

genetik sifat genotipe dan fenotipe yang dapat digunakan untuk seleksi yang

efektif pada sifat-sifat yang diinginkan (Tah 2008). Mutasi menurut Van Harten

(1998) didefinisikan sebagai perubahan pada tingkat hereditas terhadap materi

genetik, yang tidak disebabkan oleh peristiwa rekombinasi atau segregasi.

Perubahan materi genetik yang terjadi pada umumnya dapat diekspresikan pada

fenotipe tanaman dan diturunkan ke generasi selanjutnya secara genetik.

Strategi utama dari pemuliaan mutasi adalah untuk meningkatkan varietas

yang adaptif dengan merubah 1 atau 2 karakter yang utama (Ahloowalia &

Maluszynski 2001). Karakter tersebut meliputi perubahan tinggi tanaman,

proliferasi sel, peningkatan germinasi, pertumbuhan sel, aktivitas enzim,

ketahanan terhadap cekaman lingkungan, peningkatan hasil dan kualitas, ukuran

tanaman, waktu pembungaan, pemasakan buah, warna buah, serta kompatibelnya

sel pada kondisi lingkungan ekstrim sampai dengan peningkatan senyawa aktif

(Ahloowalia & Maluszynski 2001; Kiong et al. 2008).

Induksi mutasi merupakan metode yang paling mudah dalam menciptakan

variabilitas genetik dibandingkan dengan metode pemuliaan yang lainnya (Minn

et al. 2008). Induksi mutasi dapat diasumsikan sebagai dimensi baru, tidak hanya

pada perbaikan tanaman tetapi juga eksplorasi biologi (Ahloowalia &

Maluszynski 2001). Peningkatan nilai mutasi dengan menggunakan induksi

mutasi memberikan peluang peningkatan sumber variasi genotipe dan sangat

15

penting pada pemuliaan tanaman (Hoang et al. 2009). Mutasi somatik terjadi jika

sel mutan terus melakukan pembelahan, secara individual dan akan mengandung

bagian dari jaringan dengan genotipe yang berbeda dengan sel normal. Hal ini

termasuk terjadinya perubahan kariotipe, mutasi titik, pidah silang somatik dan

pertukaran kromatik, perubahan organela DNA, amplifikasi DNA, insersi atau

eksisi dari elemen loncat dan segregasi dari pre-existing kimera (Thohirah et al

2009).

Mutasi dengan menggunakan irradiasi pengion merupakan salah satu

pilihan yang paling banyak digunakan untuk membentuk mutan. Hal ini

disebabkan karena kemudahan aplikasinya dan kekuatan daya tembusnya dalam

menembus jaringan tanaman (Anwar et al. 2004). Saat ini mutasi dapat

dihubungkan dengan perubahan urutan DNA untuk beberapa sifat tanaman dan

untuk pembuatan peta molekuler yang tetap pada struktural dan fungsional

genomik pada tanaman (Ahloowalia & Maluszynski 2001). Pemuliaan mutasi

merupakan salah satu alternatif terbaik untuk mempertinggi keragaman genetik

tanaman sambiloto sekaligus mencari sifat-sifat unggul yang dapat di seleksi

untuk menghasilkan varietas sambiloto dengan kadar andrographoide yang tinggi

dan sifat unggul yang lainnya. Generasi M1 merupakan generasi heterogen

dimana setiap tanaman akan membawa mutasi yang berbeda (Thohirah et al

2009). Pengaruh secara genetik atau mutasi dapat merubah material genetik dan

akan diteruskan dari generasi M1 ke generasi selanjutnya.

2.4. Iradiasi Sinar Gamma pada Tanaman Obat

Radiasi sinar gamma sangat penting pada pemuliaan mutasi dan

mutagenesis yang dapat digunakan untuk membentuk karakter tanaman dan

meningkatkan variasi genetik (Kiong et al. 2008). Mutagenesis berperan penting

dalam menghasilkan mutan baru dengan perbaikan kualitas yang dapat

meningkatkan metabolit yang dinilai penting secara komersial (Sanada 1986).

Sinar gamma adalah mutagen yang mempunyai energi radiasi yang dapat

menyebabkan kerusakan pada ikatan kovalen atau ikatan hidrogen pada

molekul/biomolekul di sel yang dapat menghasilkan kerusakan pada tingkat

kromosom, gen dan berakhir dengan kematian sel (Xiang et al. 2002). Pengaruh

16

irradiasi sinar gamma secara biologi didasarkan pada interaksi dengan atom atau

molekul dalam sel, terutama air untuk membentuk radikal bebas (Borzouei et al.

2010). Radikal bebas ini dapat merusak atau memodifikasi komponen yang

penting pada sel tanaman dan telah dilaporkan berakibat pada perubahaan

tanaman baik secara morfologi, anatomi, biokimia dan fisiologi tanaman,

bergantung pada dosis irradiasi yang diberikan. Pengaruh dari sinar gamma

termasuk pada perubahan struktur sel dan metabolisme sel seperti dilasi membran

tilakoid, perubahan fotosintesis, modulasi sistem antioksidatif dan akumulasi

komponen fenolik (Wi et al. 2007). Irradiasi sinar gamma juga dapat

menyebabkan modulasi pada pola protein dengan cara menginduksi keberadaan

atau kehilangan beberapa pita protein (Hegazi & Hamideldin 2010).

Gambar 6. Pengaruh seluler secara langsung dan tidak langsung irradiasi pada

makromolekul (Azzam et al. 2012).

Radiasi dapat menyebabkan peningkatan produksi Reactive Oxygen

Spesies (ROS) melalui hidrolisis air atau pemutusan ikatan makromolekul yang

lain (Vandenhove et al 2010). ROS, seperti radikal superoksida (O2.-), radikal

hidroksil (-OH) dan hidrogen peroksida (H2O2) dan oksigen tunggal yang

terbentuk dari radiolisis air, yang dapat menyebabkan kerusakan pada tingkat

seluler (Alikamanoglu et al. 2011; El-Beltagi et al 2011). Secara ekstrim radikal

hidroksil yang reaktif dapat menyebabkan modifikasi basa, delesi basa dan

17

pemutusan untai DNA, yang dapat menyebabkan degradasi fotolitik karena

terjadinya oksidasi dan kerusakan struktur membram karena terjadinya

peroksidasi (Alikamanoglu et al. 2011). Adanya radiolisis air karena radiasi sinar

gamma juga menyebabkan perubahan kimia dari protein yang disebabkan karena

terjadinya fragmentasi, cross linking, agregasi dan oksidatif yang disebabkan oleh

radikal oksigen yang terbentuk tersebut (Lee et al 2005). ROS sangat reaktif pada

lipid membram, protein dan DNA. ROS diketahui dapat mengaktifkan sinyal

nitrogenmonoksida (NO) dan NADPH oksidase seperti enzim yang diketahui

dapat menyebabkan oksidatif (Zhang & Bjorn. 2009; Vandenhove et al 2010).

ROS dipercaya juga sebagai penyebab utama stress injuries dan kerusakan seluler

secara cepat (El-Beltagi et al 2011).

Kunci utama radiasi bahan tanaman adalah pada dosis radiasi, yang

merupakan jumlah energi radiasi yang diserap bahan tanaman. Unit penghitungan

dosis radiasi dahulu mempergunakan satuan rad, saat ini adalah Gray (Gy) sesuai

dengan unit dalam sistem internasional (SI). Satu Gy sama dengan serapan dari 1

Joule energi per kilogram produk yang diirradiasi, dimana 1 rad = 10-2 Gy atau 1

Gy= 100 rad. Pada penerapannya dosis irradiasi dibagi dalam tiga kategori yaitu

dosis tinggi (> 10 kGy), medium (1-10 kGy) dan rendah (<1 kGy). Dosis tinggi

biasanya digunakan untuk sterilisasi produk makanan dan dosis rendah digunakan

untuk menginduksi mutasi pada bahan berupa biji. Dosis berkisar 60-70 Gy telah

banyak diaplikasikan pada biji tanaman seperti, padi, gandum, jagung, kacang

(Van Harlen 1998; Ahloowalia & Maluszynski 2001). Stimulasi pengaruh

irradiasi sinar gamma dosis rendah kemungkinan menyebabkan terjadinya

stimulasi pembelahan sel atau elongasi sel dan perubahanan proses metabolisme

yang mengakibatkan sintesis fitohormon atau asam nukleat (Nassar et al. 2004).

Hegasi & Hamideldin (2010) mengatakan bahwa pada dosis yang rendah

untaian DNA yang panjang akan terpisah menjadi untaian kecil, sedangkan pada

dosis tinggi untaian DNA akan terpisah menjadi untaian panjang dan kecil.

Ditambahkan oleh Zeid et al (2001), bahwa jalur dari radiasi gamma dosis rendah

kemungkinan menyebabkan peningkatan aktivasi enzim dan embrio muda yang

menghasilkan peningkatan pembelahan sel yang berakibat tidak hanya pada

germinasi tetapi juga pada pertumbuhan vegetatif dan pembungaan. Penggunaan

18

irradiasi dosis rendah (1-10 Gy) juga telah dilaporkan dapat meningkatkan kadar

artemisin pada Artemisia annua (Koobkoooruad et al. 2008).

Irradiasi menggunakan sinar gamma telah terbukti secara ekonomis dan

lebih efektif bila dibandingkan dengan irradiasi yang lain. Hal ini disebabkan

karena aplikasinya mudah dan penetrasinya yang kuat sehingga dapat digunakan

untuk perbaikan tanaman (Anwar et al. 2004). Aplikasi radiasi pada tanaman telah

banyak dilakukan dengan berbagai tujuan diantaranya adalah untuk peningkatan

produktifitas tanaman (Khan & Khan. 2010), peningkatan produksi minyak

(Nassar et al. 2004) serta perakitan tanaman tahan penyakit dan toleran terhadap

kadar garam (Khodary 2004; Beltagi et al. 2006; El Sayed et al. 2007; Hoang et

al. 2009).

Sampai saat ini penelitian tentang irradiasi pada tanaman obat mulai

banyak dilaporkan. Pada awalnya irradiasi pada tanaman obat lebih banyak

digunakan untuk mengetahui kualitas higienis hasil ekstraksi dari herba

(Chmielewski & Migdal 2005), dekontaminasi dan disinfeksi mikroba pada

simplisia (Timpraser et al. 2003; Phianphak et al. 2007), seperti pada tanaman

obat Camellia sinensis (Fanaro et al. 2009) dan Turnera diffusa Wild (Camaro et

al. 2008). Dosis irradiasi yang biasa digunakan untuk dekontaminasi dan

disinfeksi mikroorganisme biasanya tinggi (kGy). Pada tanaman sambiloto

irradiasi dengan tujuan untuk mengetahui kualitas higienis hasil ekstraksi dari

herba dan dekontaminasi serta disinfeksi mikroba pada simplisia juga telah

dilaporkan (Timpraser et al. 2003, Chobkarjing 2004; Mamatha et al. 2010)

dengan dosis pemakaian berkisar antara 5-25 kGy.

Perkembangan penggunaan teknik irradiasi pada tanaman obat juga mulai

digunakan untuk perbaikan mutu tanaman. Penelitian yang telah dilaporkan

diantaranya adalah untuk peningkatan produksi shikonin pada Lithospermum

erythrorhizon S (Chung et al. 2006), menginduksi perubahan biokimia pada

tanaman obat Orthosiphon stamineus (Kiong et al. 2008), peningkatan senyawa

alkaloid pada tanaman obat Atropa belladonna L (Abdel-Hady et al. 2008),

peningkatan kandungan artemisinin pada Artemisia annua (Koobkoooruad et al.

2008), peningkatan kandungan minyak pada tanaman obat Thevetia (Adeogun and

Adeogun. 2009) dan peningkatan akumulasi flavanoid pada Centella asiatica

19

(Moghaddam et al. 2011). Pada tanaman sambiloto, irradiasi untuk tujuan

perbaikan mutu tanaman telah dilaporkan oleh Lattoo et al (2006), dengan

melakukan pembuatan jantan mandul menggunakan irradiasi sinar gamma dengan

dosis 2 kRad. Sampai saat ini penelitian tentang peningkatan senyawa aktif

tanaman sambiloto dengan irradiasi belum pernah dilaporkan.

2.5. Deteksi Mutan Hasil Irradiasi

Mutan yang terbentuk perlu diseleksi melalui beberapa generasi

pertumbuhan biji atau propagasi secara vegetatif. Pada tanaman yang diperbanyak

melalui biji mutan resesif biasanya diseleksi pada generasi kedua (M2) atau ke

tiga (M3) setelah perlakuan irradiasi. Pada tanaman yang diperbanyak secara

vegetatif beberapa siklus dari propagasi diperlukan untuk mendapatkan homo-

histont atau ‘dissolve’ kimera dan mendapatkan mutan yang solid (Ahloowalia &

Maluszynski 2001). Pada perbanyakan mutan secara vegetatif, generasi M1V0

merupakan populasi generasi tanaman mutan (M, kependekan dari ’Mutan’) yang

belum diperbanyak secara vegetatif (V0). Tanaman generasi M1V1 merupakan

populasi tanaman hasil perbanyakan vegetatif pertama (V1) dari mutan generasi

pertama (M1). Sedangkan tanaman generasi M1V2 adalah populasi tanaman hasil

perbanyakan vegetatif dari M1V1, demikian seterusnya sehingga didapatkan

generasi M1V3 (Aisyah et al. 2009).

Mutasi gen yang terjadi tanpa ekspresi fenotipe yang terlihat biasanya tidak

dapat dikenali. Untuk dapat mengenali mutasi gen yang terjadi berbagai metode

telah diaplikasikan untuk mendeteksi pengaruh mutagen pada tanaman. Pada

tanaman obat perubahan sifat dan karakter mutan dapat dideteksi secara

morfologi, molekuler dan fitokimia.

Secara morfologi deteksi dilakukan dengan mengamati perubahan fenotipe,

seperti tinggi tanaman, bentuk daun, bentuk batang serta perubahan morfologi

yang terjadi pada mutan dibandingkan dengan kontrol. Deteksi secara molekuler

dilakukan untuk mengetahui perubahanan profil DNA hal ini dapat dilakukan

dengan menggunakan penanda molekuler. Sedangkan deteksi secara fitokimia

dapat dilakukan terhadap perubahan komponen senyawa aktif yang terkandung

dalam tanaman obat tersebut dibandingkan dengan kontrol. Pada mutan tanaman

20

obat selain terjadi perubahan genotipe diharapkan terjadi juga perubahan karakter

senyawa aktif yang terkandung didalamnya.

2.5.1. Deteksi Perubahan Morfologi Mutan

Perubahan fenotipe atau morfologi mutan dari hasil irradiasi biasanya

beraneka ragam bentuk tergantung dosis yang digunakan. Pada mutan yang

terbentuk, perubahan morfologi menjadi tanda awal untuk mengetahui pengaruh

mutasi pada tanaman tersebut. Perubahan ini dapat terjadi pada seluruh bagian

tanaman, baik berupa daun, bunga, batang, dan akar. Perubahan warna dan bentuk

bunga, tanaman kerdil atau tanaman menjadi besar (giant) dan fenotipe baru yang

terbentuk menjadi nilai komersial yang dapat diseleksi menjadi varietas baru

(Ahloowalia & Maluszynski 2001).

Banyak mutan menjadi tanaman kerdil, yang justru menjadi tanda spesifik

bagi hasil tertentu, seperti pada mutan padi Calrose 76 yang dikeluarkan di

California, yang berkontribusi besar pada produksi padi di USA, mempunyai ciri

tanaman yang semi kerdil (Ahloowalia & Maluszynski 2001). Pada tanaman hias,

pengaruh mutasi sangat terlihat secara morfologi, perubahan warna bunga, bentuk

dan ukuran bunga yang mudah di seleksi dan menjadi nilai lebih secara komersial.

Pada mutan tanaman krisan selain terjadi variasi ukuran dan bentuk bunga,

perubahan warna juga ditemukan (Lamseejan et al. 2000). Pembentukan mutan

kerdil juga telah ditemukan pada tanaman Cynodon dactylon (Lu et al. 2009) dan

pisang (Suprasana et al. 2008).

2.5.2. Deteksi Perubahan Profil DNA Mutan

Deteksi perubahan profil DNA mutan dapat dilakukan dengan

mengunakan penanda molekuler. Penanda molekuler didefinisikan sebagai bagian

dari segmen DNA yang mewakili perbedaan pada tingkat genom (Agarwal et al.

2008). Penanda molekuler secara langsung dapat membandingkan perubahan

genotipe pada tingkat DNA. Penanda molekuler sangat akurat karena dapat

memberikan informasi polimorfik, sebagai komposisi genetik yang unik pada

masing-masing spesies, yang tidak tergantung pada umur dan kondisi fisiologi

seperti faktor lingkungan (Joshi et al. 2004). Penanda molekuler dapat

21

memperlihatkan perbedaan antar aksesi pada tingkat DNA dan memberikan

informasi secara langsung, dapat dipercaya dan efisien untuk konservasi dan

pemeliharaan plasma nutfah dibandingkan analisa secara morfologi (Babaei et al.

2010).

Teknik Inter Simple Sequence Repeat (ISSR) adalah teknik berbasis PCR

yang telah dilaporkan oleh Zietkiewicz et al. (1994), yang melibatkan amplifikasi

segmen DNA diantara daerah perulangan 2 mikrosatelit yang identik dengan

orientasi pada arah berlawanan menggunakan primer yang didisain dari daerah

inti mikrosatelit. Teknik ini menggunakan primer mikrosatelit, panjangnya sekitar

16-25 bp dari pengulangan di-nukleotida, tri-nukleotida, tetra-nukleotida atau

penta-nukleotida pada target genom multi lokus (Vijayan et al. 2005). Teknik

penanda DNA ISSR ini adalah penanda ideal untuk pemetaan genetik dan

populasi disebabkan karena berlimpah ruah dan tingginya nilai polimorfik

diantara individu dan populasi yang genotipenya berdekatan (Hadia et al. 2008).

Kelebihan dari teknik ISSR dibandingkan dengan teknik yang lain adalah

lebih efisien, sederhana pengoperasiannya, akurat, biaya murah, prosesnya cepat,

tinggi polimorfik yang didapat, stabil, dapat dipercaya dan mudah diulang

(Vijayan et al. 2005; Zhou et al. 2007; Hussein et al. 2008; Su et al. 2008).

Teknik ISSR mendeteksi polimorfik pada lokus mikrosatelite dan inter-

mikrosatelite tanpa terlebih dahulu mengetahui urutan DNA (Hussein et al. 2005)

dengan syarat susunan basa yang berulang tersebut mewakili secara luas dan

menyebar diseluruh genom (Wahyuni et al. 2004).

2.5.3. Deteksi Perubahan Profil Fitokimia Mutan

Untuk mengetahui perubahan senyawa aktif pada mutan hasil irradiasi

dapat diketahui dengan melakukan analisa profil perubahan senyawa aktif

tanaman tersebut. Banyak metode yang telah digunakan untuk mendeteksi profil

fitokimia yang berubah pada mutan tanaman obat. Kromatografi Lapis Tipis

(TLC) dan Kromatografi (HPLC) telah menjadi prosedur standar untuk

mengidentifikasi senyawa aktif tanaman obat.

Pada tanaman sambiloto ekstraksi kandungan senyawa aktif secara

konvensional dilakukan dengan menggunakan maserasi, ekstraksi Soxhlet dan

22

ekstraksi ultrasonic (Subramanian et al. 2012). Di beberapa Negara Asia dimana

sambiloto dijual secara komersial, berbagai metode digunakan untuk memastikan

tingkat standarisasi dari andrographolide, metode yang digunakan diantaranya

adalah thin layer chromatography, ultraviolet spectrophotometry, liquid

chromatography, teknik volumetric dan colorimetric serta HPLC. Metode-metode

tersebut merupakan metode yang paling baik dan dapat diandalkan untuk

mengetahui profil andrograpolide secara kuantitatif dan kualitatif (Aromdee et al.

2005; Mishra et al. 2007).

Umumnya, ekstraksi andrographolide dilakukan dengan menggunakan

metanol atau air, kemudian ekstrak difraksinasi lebih lanjut dengan metanol-

kloroform, dichlorometan dan/atau petroleum eter atau heksana sesuai dengan

fraksi andrographolide atau gugus yang diinginkan (Mishra et al. 2007). Metode

HPLC dan HPTLC lebih sering digunakan untuk analisa quantitatif

andrographolide karena merupakan metode kromatografi cair sederhana yang

telah dapat digunakan untuk penentuan 3 komponen andrographolide utama yaitu

didehydroandrographolide, andrografolide dan neoandrographolide dengan

deteksi UV pada panjang gelombang 230 nm (Mishra et al. 2007).

Teknik HPLC merupakan pengembangan dari teknik kromatografi dengan

fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat. Kelebihan dari teknik HPLC

adalah mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran, mudah

melaksanakannya, kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi, dapat dihindari

terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang dianalisis, resolusi yang baik, dapat

digunakan bermacam-macam detektor, kolom dapat digunakan kembali, dan

mudah melakukan "sample recovery".

Untuk meningkatkan resolusi, kolom HPLC dikemas dengan partikel yang

berukuran kecil (3, 5, 10 μm) dengan distribusi ukuran sempit. Laju aliran dan

ukuran kolom dapat disesuaikan untuk meminimalkan pelebaran pita (Ngan.

2005). Pemilihan pelarut dan kondisi eluen (gradien atau isokratik) bergantung

pada campuran masing-masing komponen dan kandungan yang diinginkan.

Kebanyakan elusi yang digunakan adalah elusi gradien. Elusi gradien

merupakan solven organik yang dibentuk dari campuran dua macam eluen, eluen

yang satu mengandung konsentrasi rendah dari solven organik atau tidak

23

mengandung solven organik (bufer A) dan yang satunya terdiri dari konsentrasi

tinggi dari solven didalam air (bufer B). Tetapi kandungan solven organik kedua

eluen tersebut identik (Chobkarjing. 2004). Detektor yang biasa digunakan dalam

sistem HPLC adalah ultraviolet/visible (UV/Vis), indeks bias (RI), evaporative

light-scattering (ELS), MS dan detektor fluoresensi (Ngan. 2005). Elusi isokratik

adalah elusi dimana fase gerak masuk dalam kolom dalam kondisi tetap. Pada

elusi isokratik kondisi kromatografi dijaga tetap konstan melalui sejumlah

penelitian. Hal ini yang mendasari konstruksi dasar dari sistem kromatografi pada

metode elusi isokratik lebih sederhana (Chobkarjing. 2004).