10-50-1-pb

Efek Ekstrak Daun Mengkudu Terhadap Jumlah Protein Glut4 Pada Tikus Putih Hiperglikemik

(Aguslina Kirtishanti, R. Budiono, Ratih, dan F. Isfandiari)

55

EFEK EKSTRAK DAUN MENGKUDU (Morinda citrifolia L.) TERHADAP JUMLAH PROTEIN GLUT4

PADA TIKUS PUTIH HIPERGLIKEMIK

Aguslina Kirtishanti, Ryanto Budiono, Ratih, dan Fitria Isfandiari

Fakultas Farmasi Universitas Surabaya

ABSTRACT

Difficulties in finding anti-diabetics which are effective, tolerable by the patients, safe, cause people to try to find other alternative, such as taking traditional medicine like “mengkudu” [Morinda citrifolia L.]. Mengkudu fruit had been proven to be able to increase the number of protein GLUT4 at type 2 diabetic male white rat’s sceletal muscle. Fruit of mengkudu has similar chemical ingredient with its leaves. So far, however, mengkudu leaves had not been studied to increase the number of protein GLUT4 at sceletal muscle. This study use male white rats Wistar strain. Total number of white rats involved in this study were 40 rats which treated : 10 rats as negative control group [no treatment], 10 rats as positive control group and they are treated with exogen insulin 0,35 U per body weight three times daily for 10 days. The last 20 rats is divided into 2 groups with 10 rat for each group as first trial group and second trial group. The trial group are treated with exogen insulin and first trial group were given water extract of mengkudu leaves 7,5 g per body weight and second trial group were given alcohol extract of mengkudu leaves 1,8 g per body weight twice daily which were administered starting from the seventh to tenth day of exogen insulin administration. After ten days of administration, blood glucose level of all rats was measured and all rats were killed afterwards. The next step is sceletal muscle tissue processing to be painted immunohistochemistry to GLUT4. Conclusion of the result is water extract and alcohol extract of mengkudu leaves could not increase the number of protein GLUT4 at type 2 diabetic male white rats.

Keywords : mengkudu, leaves,Glut4, diabetes mellitus

ABSTRAK

Kesulitan mendapatkan obat antidiabetes yang efektif dan aman menyebabkan pasien mencoba obat alternatif, misalnya dengan menggunakan obat tradisional “mengkudu” (Morinda citrifolia L.). Buah mengkudu telah terbukti dapat meningkatkan jumlah protein Glut4 pada otot rangka tikus putih jantan diabetik. Buah mengkudu memiliki kandungan kimia yang hampir sama dengan daunnya. Oleh sebab itu dalam penelitian ini dilakukan penelitian untuk mengetahui apakah daun mengkudu juga dapat meningkatkan jumlah protein Glut4 seperti buahnya. Dalam penelitian ini digunakan 40 tikus putih jantan strain Wistar yang dibagi menjadi 4 kelompok, yaitu kelompok kontrol negatif, kelompok kontrol positif yang diberi insulin eksogen 0,35 U per berat badan tiga kali sehari selama 10 hari, kelompok perlakuan pertama yang diberi ekstrak air daun mengkudu 7,5 g per kg berat badan, dan kelompok perlakuan kedua yang diberi ekstrak alkohol daun mengkudu 1,8 g per kg berat badan dua kali sehari mulai hari ke-7 sampai hari ke-10. Kadar gula darah diukur setelah hari ke-10. Jaringan otot rangka diambil dan dilakukan pewarnaan untuk melihat protein Glut4. Dari hasil penelitian yang diperoleh disimpulkan bahwa ekstrak air dan alkohol daun mengkudu tidak dapat meningkatkan jumlah protein Glut4 pada tikus putih jantan diabetik tipe 2.

Kata kunci : mengkudu, daun,Glut4, diabetes mellitus

Jurnal Farmasi Indonesia Vol. 4 No. 2 Juli 2008: 55 - 62

56

PENDAHULUAN

Mengkudu telah digunakan sebagai pengobatan selama 2000 th lebih. Tanaman mengkudu sekarang dipublikasikan oleh insan kesehatan sebagai obat ajaib dalam pengobatan berbagai penyakit (1). Berdasarkan hasil riset moderen, mengkudu dapat digunakan pada pengobatan berbagai penyakit seperti diabetes mellitus, hepatitis kronis, sakit pinggul, gangguan fungsi ginjal, kencing batu, dan gangguan hormon tiroid (2).

Berkaitan dengan penyakit diabetes mellitus (DM), mengkudu memiliki kelebihan karena memiliki fungsi konstruktif, yaitu membangun kembali jaringan-jaringan yang rusak, menyembuhkan penyakit komplikasi lain, menurunkan kadar gula darah dan mengembalikan kemampuan tubuh untuk mengatur gula darah seperti sediakala (3). Berdasarkan penelitian terdahulu (4), diketahui bahwa buah mengkudu dapat meningkatkan jumlah GLUT4 protein pada otot skeletal tikus putih jantan DM tipe 2. Kandungan yang terdapat didalam buah mengkudu hampir sama dengan yang terdapat pada daun seperti antrakuinon, beta-carotene dan sterol, tetapi peningkatan jumlah GLUT4 protein karena pemberian daun mengkudu sampai saat ini masih belum jelas.

Pada penderita DM tipe 2 didapatkan bahwa ekspresi mRNA SREBP-1c (Sterol Regulatory-Element Binding Protein-1c) menurun. SREBP-1c merupakan faktor transkripsi untuk beberapa gen yang berbeda antara lain adalah gen GLUT4 (5,6). GLUT4 (transporter glukosa 4) adalah protein transpor untuk glukosa yang bertujuan membawa glukosa masuk ke dalam sel. GLUT4 yang berada dalam sel akan pindah ke permukaan sel target (sel otot dan sel adiposa) untuk berikatan serta membawa glukosa

masuk ke dalam sel. Proses translokasi GLUT4 ke permukaan sel target tersebut diawali dengan ikatan insulin dan reseptor insulin (7). Bila transkripsi GLUT4 menurun akibat SREBP-1c yang menurun maka ekspresi GLUT4 protein juga menurun sehingga jumlah GLUT4 protein dalam sel menurun. Penurunan jumlah GLUT4 akan menurunkan glukosa yang masuk ke dalam sel sehingga dapat terjadi hiperglikemia. Bila hal ini berlangsung dalam waktu yang lama maka dapat menjadi DM tipe 2 yang menetap.

Dalam mengungkap permasalahan di atas, maka dilakukan studi eksperimental. Penelitian dilakukan terhadap tikus putih jantan strain Wistar yang diinduksi dengan insulin eksogen (long acting human insulin)(8, 9). Insulin eksogen diberikan pada tikus putih jantan tiga kali sehari selama 10 hari secara intraperitoneal (ip) untuk mendapatkan keadaan hiperglikemik (analog diabetes mellitus tipe 2). Penelitian dilakukan dalam 4 kelompok hewan coba yaitu kelompok kontrol negatif tanpa diinduksi insulin eksogen dan hanya diberikan aquadem saja, kelompok kontrol positif dengan induksi insulin eksogen dan kelompok uji I dan uji II dengan induksi insulin eksogen dan pemberian ekstrak air dan ekstrak etanol daun mengkudu. Selanjutnya dari keempat kelompok hewan coba tersebut diamati jumlah GLUT4 protein pada sel otot skeletal paha tikus dengan teknik pengecatan secara imunohistokimia. Kadar glukosa darah puasa diamati pada hari ke 11 sebagai kriteria sampel untuk menyatakan bahwa pemberian insulin eksogen sudah dapat menimbulkan keadaan hiperglikemik yang analog dengan DM tipe 2.

Sediaan uji yang digunakan ada 2 macam yaitu ekstrak air dan ekstrak



57

etanol. Penggunaan sediaan tersebut untuk melihat kandungan yang dapat meningkatkan jumlah GLUT4 protein lebih banyak terdapat dalam pelarut air atau pelarut etanol.

Penelitian ini bertujuan untuk menjelaskan peningkatan jumlah GLUT4 protein pada sel otot skeletal tikus putih jantan hiperglikemik (analog diabetes mellitus tipe 2) karena pemberian ekstrak air dan ekstrak etanol daun mengkudu dan menjelaskan ekstrak air atau ekstrak etanol daun mengkudu yang dapat meningkatkan jumlah GLUT4 protein lebih banyak.

Ekstrak air dan/atau ekstrak etanol daun mengkudu ini diharapkan dapat memberikan alternatif pengobatan pada keadaan hiperglikemik dan/atau DM tipe 2 dengan efek terapi yang efektif dan relatif aman serta memberikan tambahan informasi kepada peneliti, ilmuwan, dan industri obat tradisional dalam pengembangan mutu dan teknik pembuatan obat tradisional mengkudu sehingga produk yang dihasilkan adalah produk dengan efek terapi yang optimal dan efek samping yang minimal.

METODOLOGI PENELITIAN Bahan dan alat

Bahan penelitian yang digunakan adalah ekstrak air dan ekstrak etanol daun mengkudu, insulin eksogen (Insulin Monotard 40 UI, Novo Nordisk), pereaksi anti GLUT4 (Santacruz), formalin, alkohol 96%p.a (E. Merck), xylol, parafin cair, dan aquabidestilata. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah spuit 1 ml, jarum suntik, Accutrend test dan strip glukosa, alat-alat bedah, mikrotom, objek glass, cover glass, mikroskop cahaya.

Cara Kerja Penelitian ini menggunakan 40

ekor tikus putih jantan strain Wistar sebagai sampel penelitian yang dibagi dalam 4 kelompok. Sampel penelitian tersebut diambil secara simple random sampling yaitu sampel diambil secara acak sederhana karena populasi dianggap homogen (10). Masing-masing kelompok hewan coba terdiri dari 10 ekor tikus putih jantan. Perlakuan terhadap hewan coba diberikan selama 10 hari dengan tahapan sebagai berikut : a. Kelompok kontrol negatif diberi

aquadem selama 10 hari. Kelompok kontrol positif diberi insulin eksogen 0,35 U/kg BB secara intraperitoneal (ip) 3 kali sehari selama 10 hari. Kelompok uji I dan uji II diberi insulin eksogen dengan cara, dosis dan lama pemberian yang sama dengan kelompok kontrol positif, tetapi pada hari ketujuh sampai ke sepuluh tikus kelompok uji I diberi ekstrak air daun mengkudu 7,5 g/kg BB dan tikus kelompok uji II diberi ekstrak etanol daun mengkudu 1,8 g/kgBB secara oral 2 kali sehari.

b. Pada hari ke 11 dilakukan pengukuran kadar glukosa darah puasa pada semua kelompok tikus sebagai kriteria sampel.

c. Kemudian semua tikus dikorbankan dan diambil otot skeletal bagian paha. Potongan otot skeletal paha tikus diproses menggunakan teknik rutin melalui tahapan yaitu fiksasi, dehidrasi, clearing, impregnasi dan embedding untuk pembuatan blok parafin.

d. Blok parafin dipotong tipis menggunakan mikrotom, kemudian dibuat sediaan dengan pengecatan secara imunohistokimia menggunakan reagen anti GLUT4 untuk


58

menghitung jumlah GLUT4 protein.

e. Penghitungan jumlah GLUT4 dilakukan di bawah mikroskop dengan pembesaran 400 kali.

Metode pengumpulan dan analisis data Data kadar glukosa darah dianalisis menggunakan anava satu arah. Pemeriksaan jumlah GLUT4 protein dilakukan dengan menghitung GLUT4 protein dalam sel otot skeletal yang telah dilakukan pengecatan secara imunohistokimia. Sel otot yang diamati adalah sel otot yang dianggap representatif dengan sel yang tidak terlipat, tidak ada sel yang bertumpuk-tumpuk dan irisan tidak tebal. Sel otot

yang mengandung GLUT4 protein memiliki inti berwarna biru dan dikelilingi oleh sitoplasma yang berwarna coklat. Jumlah GLUT4 protein dihitung setiap satu irisan otot. Data jumlah GLUT4 protein dianalisis menggunakan anacova, kemudian kedua analisis tersebut diteruskan dengan uji Tukey untuk melihat perbedaan yang bermakna antar

kelompok dengan harga p0,05 (11).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil pengukuran kadar glukosa darah pada tikus putih jantan sebagai kriteria sampel dapat dilihat pada tabel 1 dan gambar 1.

Tabel 1

Kadar Glukosa Darah Pada Kelompok Kontrol Negatif, Kelompok Kontrol Positif, Kelompok Uji I dan Kelompok Uji II

No. Tikus

Kadar glukosa darah (mg/dl)

Kelompok Kontrol negatif

Kelompok Kontrol positif

Kelompok Uji I

Kelompok Uji II

1 2 3 4 5 6 7

115 112 110 93 110 111 117

144 128 115 112 131 164 154

94 135 96 102 112 90 -

121 118 107 112 107 110 116

Rata2 109,71 135,42 104,83 113

SD 7,82 19,47 16,64 5,48

Kadar glukosa darah yang

diperoleh dibandingkan antara kelompok kontrol negatif, kontrol positif, uji I dan uji II dan dianalisis statistik menggunakan anava satu arah. Berdasarkan hasil statistik didapatkan perbedaan bermakna antara kelompok kontrol positif dengan kelompok kontrol negatif, uji I dan uji II. Tetapi tidak terdapat perbedaan bermakna kadar glukosa

darah antara kelompok kontrol negatif dengan kelompok uji I dan uji II. Demikian juga tidak ada perbedaan bermakna antara kelompok uji I dan kelompok uji II. Hal ini menunjukkan bahwa insulin eksogen dapat menimbulkan keadaan hiperglikemik walaupun hiperglikemiknya tidak tinggi dan belum dapat dikatakan sebagai DM tipe 2.



59

0

20

40

60

80

100

120

140R

ata

-2 K

ad

ar

Glu

ko

sa D

ara

h

(mg

%)

Kontrol (-) Kontrol (+) Uji I Uji II

Kelompok

Gambar 1. Diagram batang rata-rata kadar glukosa darah pada kelompok

kontrol negatif, kelompok kontrol positif, kelompok uji I dan kelompok uji II

Pemeriksaan terhadap jumlah GLUT4 protein dilakukan dengan menghitung GLUT4 protein dalam sel otot skeletal yang telah dilakukan pengecatan secara imunohistokimia. Teknik imunohistokimia yang dipakai adalah metode indirect dengan prinsip pembentukan ikatan antigen-antibodi. Antigennya adalah GLUT4 protein yang ada dalam sel otot skeletal sedangkan antibodi primernya adalah antibodi poliklonal, anti-GLUT4, dan

antibodi sekundernya adalah biotinylated yang sudah diberi label sehingga ikatan antigen-antibodinya dapat dilihat. Data jumlah GLUT4 protein dari setiap kelompok perlakuan ditampilkan pada tabel 2 dan data statistik anacova jumlah GLUT4 protein dapat dilihat pada tabel 3. Grafik diagram batang rata-rata jumlah GLUT4 setiap kelompok perlakuan ditampilkan pada gambar 2.

Tabel 2

Jumlah GLUT4 Protein Pada Kelompok Kontrol Negatif, Kelompok Kontrol Positif, Kelompok Uji I dan Kelompok Uji II

No. Tikus

Jumlah GLUT4 protein

Kelompok Kontrol negatif

Kelompok Kontrol positif

Kelompok Uji I

Kelompok Uji II

1 2 3 4 5 6 7

302 278 273 340 281 279 268

170 183 209 211 183 157 160

241 190 155 247 159 238

-

215 71 83 116 187 226 116

Rata2 288,71 181,85 205 144,86

SD 25 21,69 42,40 63,54


60

Tabel 3 Anocova GLUT 4 Protein Pada Kelompok Kontrol Negatif,

Kelompok Kontrol Positif, Kelompok Uji I dan Kelompok Uji II

Dependent Variable : Jumlah GLUT4 Protein

95% Confidence Interval

Kelompok Mean Std. Error Lower Bound Upper Bound


281.406a

203.759a

192.147a

141.281a

15.444 19.003 17.546 15.060

249.378 164.349 155.759 110.048

313.433 243.169 228.534 172.514

a. Covariates appearing in the model are evaluated at the following values : KadarGlukosaDarah = 116.1481

(I) Kelompok (J) Kelompok Sig.

Uji I Kontrol (+) .691

Kontrol (-) .001

Uji II .034

Kontrol (+) Kontrol (-) .007

Uji II .021

Kontrol (-) Uji II .000

0

50

100

150

200

250

300

Rata

-2 J

um

lah

GL

UT

4-

Pro

tein


Kelompok

Gambar 2. Diagram batang rata-rata jumlah Glut4 protein pada kelompok

kontrol negatif, kelompok kontrol positif, kelompok uji I dan kelompok uji II

Data jumlah Glut4 protein dianalisis menggunakan anacova dengan covariannya adalah kadar glukosa darah. Berdasarkan hasil statistik tersebut, kadar glukosa darah tidak mempengaruhi jumlah Glut4 protein. Data statistik tersebut juga menyatakan bahwa tidak ada perbedaan bermakna antara

kelompok uji I dengan kelompok kontrol positif, tetapi berbeda bermakna dengan kelompok kontrol negatif. Hal ini menjelaskan bahwa jumlah Glut4 protein pada kelompok uji I (diberi ekstrak air daun mengkudu) relatif sama dengan kelompok kontrol positif (sebagai model DM tipe 2) sedangkan jumlah



61

GLUT4 protein pada kelompok kontrol negatif (model hewan coba normal) jauh lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok kontrol positif dan kelompok uji I. Hal ini berarti ekstrak air daun mengkudu belum dapat meningkatkan jumlah GLUT4 protein pada otot skeletal. Hasil statistik juga menyatakan bahwa kelompok uji II berbeda bermakna dengan kelompok uji I, kelompok kontrol positif dan kelompok kontrol negatif. Jumlah GLUT4 protein pada kelompok uji II jauh lebih rendah dari ketiga kelompok sebelumnya. Selain itu juga jumlah GLUT4 pada kelompok uji II sangat bervariasi dan ini dapat terlihat

dari nilai standar deviasinya. Hal ini mungkin disebabkan karena hewan cobanya tidak dalam satu inbred yang sama sehingga memberikan hasil yang bervariasi. Jumlah GLUT4 protein yang rendah pada kelompok uji I dan terutama uji II dapat disebabkan karena dosis ekstrak air dan ekstrak etanol daun mengkudu belum cukup untuk meningkatkan jumlah GLUT4 protein secara berarti.

Hasil pewarnaan secara imunohistokimia yang menunjukkan adanya GLUT4 protein dan tidak adanya GLUT4 protein berturut-turut ditampilkan pada gambar 3 dan 4.

Gambar 3. Hasil pewarnaan secara imunohistokimia terhadap GLUT4 protein dengan pembesaran 400x (tanda panah menunjukkan adanya

GLUT4 protein yang ditandai dengan inti sel berwarna biru yang dikelilingi oleh sitoplasma yang berwarna coklat)

KESIMPULAN DAN SARAN

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa pemberian ekstrak air (7,5 g/kg BB) dan ekstrak etanol (1,8 g/kg BB) daun mengkudu belum dapat meningkatkan jumlah GLUT4 protein pada otot skeletal tikus putih jantan hiperglikemik yang analog dengan diabetes mellitus tipe 2.

Disarankan untuk melakukan penelitian lebih lanjut mengenai dosis yang tepat dari daun mengkudu untuk meningkatkan jumlah GLUT4 protein. Disamping itu perlu dilakukan penelitian lanjut dengan mengisolasi sterol baik dari buah maupun daun mengkudu untuk melihat efeknya terhadap peningkatan jumlah GLUT4 protein.


62

Gambar 4. Hasil pewarnaan secara imunohistokimia pada preparat yang tidak terdapat GLUT4 protein dengan pembesaran 400x (tanda panah

menunjukkan inti sel berwarna biru tanpa dikelilingi sitoplasma berwarna coklat berarti tidak terdapat GLUT4)

DAFTAR PUSTAKA

1. Bangun AP dan Sarwono B. Khasiat dan Manfaat Mengkudu. Jakarta: Agromedia Pustaka; 2002. hal. 8 – 23

2. Harmanto Ning. Menumpas Diabetes Bersama Mahkota Dewa. Jakarta: Agro Media Pustaka; 2004. hal. 16-25

3. Kirtishanti A. Efek Jus Buah Mengkudu Terhadap Peningkatan Jumlah GLUT4 Protein Pada Tikus Putih Jantan Hiperglikemik (Analog Diabetes Mellitus Tipe 2). Tesis Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga; 2004.

4. Ducluzeau PH, Perretti N, Laville M, Andreelli F, Vega N, Riou JP. Regulation by Insulin of Gene Expression in Human Skeletal Muscle and Adipose Tissue. Diabetes 2001; 50: 1134 - 1142

5. Lay SL, Lefrere I, Trautwein C, Dugail I, Krief S. Insulin and Sterol-regulatory Element-binding Protein-1c (SREBP-1c) Regulation of Gene Expression in 3T3-L1 Adipocytes,

Journal Biology Chemistry 2002; 277 (38): 35625 - 35634

6. Ganong W. Review of Medical Physiology 10

th edition. San

Fransisco: Appleton and Lange; 2000. p. 318 – 332

7. Wu YC, Hsu JH, Liu IM, Liou SS, Su HC, Cheng JT. Increase of Insulin Sensitivity in Diabetic Rats Received Die-Huang-Wan, A Herbal Mixture Used in Chinese Traditional Medicine. Acta Pharmacologica Sinica 2001; 23(12): 1181 – 1187

8. Cheng JT, Liu IM, Chi TC, Su HC, Chang CG. Stimulation of Insulin Release in Rats by Die-Huang-Wan, A Herbal Mixture Used in Chinese Traditional Medicine. Journal of Pharmacy and Pharmacology 2001; 53: 273 – 276.

9. Zainuddin M. Metodologi Penelitian. Surabaya: Universitas Airlangga; 2000.

10. Steel RGD and Torrie JH. Principles and Procedures of Statistics. A Biometrical Approach 2

nd ed.

Singapore: McGraw-Hill Int.Book Co; 1987.

10-50-1-pb

Documents